陽極TaOxナノチューブアレイの生体適合性の向上

背景

タンタル（Ta）は、希少で、硬く、耐食性が高く、生体不活性の金属です[1,2,3]。タンタル材料の酸化は、その表面に非常に薄くて浸透できない酸化膜を形成することにより、その生体適合性に貢献します。タンタルの高い柔軟性と生体適合性により、歯科インプラント、整形外科インプラント、骨再建などの臨床応用が可能になります[4、5、6]。最近、タンタルはチタンよりも優れた生体適合性を持っていることがわかりました。たとえば、細胞外マトリックスの形成が豊富で、細胞の付着と成長が優れており、表面の生細胞密度がはるかに高い[7,8,9]。一方、いくつかの研究は、ナノ構造の表面形状の特徴的な物理化学的特性が細胞の挙動に影響を与える主な要因であることを証明しています[10、11、12]。理想的な生体材料の表面は、細胞の内部成長に最適な環境を提供できる必要があります。 Ruckh etal。陽極酸化されたTaナノチューブは、平坦な表面と比較した場合、オッセオインテグレーションを強化するための基板を提供することを実証しました[13]。最近開発された多孔質タンタル材料は、骨の特性を模倣しており、軟組織と骨の内部成長を可能にし、良好な生物学的固定を提供します[14、15、16、17]。多孔質タンタルの高い安定性と治癒の可能性は、再建手術中に骨構造間のギャップを融合するのに役立ちます。したがって、多孔性タンタルは、ドナー部位の罹患率がない、高い安定性、優れた骨統合特性、および感染症の伝染の潜在的なリスクの防止など、他の移植片と比較したいくつかの利点により、生体材料分野で大きな関心を取り戻しました[18、19、20 、21]。最近の臨床レビューでは、多孔性タンタル寛骨臼カップを投与された患者は、ヒドロキシアパタイトでコーティングされたチタン（Ti）カップを投与された患者と比較してインプラント固定の程度が高いことが示されました[22、23、24、25]。

最近、自己組織化TiO ₂ を開発しました 電気化学的陽極酸化法を利用した異なる直径のナノチューブ[26、27]。ヒト線維芽細胞は、超臨界CO ₂ でより明白な直径特異的挙動を示すことがわかりました。 （ScCO ₂ ）-陽極酸化されたままのナノチューブよりも処理されたナノチューブ[27]。さらに、Agで装飾されたTiO ₂ を製造しました。 電子ビーム蒸発法によるナノチューブであり、最小直径（直径25 nm）のAgで装飾されたナノチューブは、ヒト線維芽細胞およびヒト鼻上皮細胞の接着と増殖を促進する上で最も明白な生物学的活性を示しました[26]。この研究では、TaO _{x を作成しました} 同様の電気化学的陽極酸化法による異なる直径のナノチューブ。 TaO _{x の直径に応じた、細胞接着や増殖などの細胞の挙動} ナノチューブが調査された。この研究の目的は、自己組織化されたTaO _{x の生体適合性を研究することです。} 電気化学的陽極酸化によって製造された、ナノチューブの直径が異なるナノチューブアレイ。

メソッド

TaOの準備 _x ナノチューブ

TaシートはECHOChemicalから購入しました（厚さ0.127 mm、純度99.7％、CAS番号7440-25-7）。陽極酸化プロセスの前に、Taシートをアセトン、イソプロパノール、エタノール、および水で超音波洗浄しました。すべての陽極酸化実験は、試薬グレードの化学物質と脱イオン水から調製された4.9 wt％HFを含む硫酸溶液中で20°Cで実行されました。アノードとしてＴａおよび対極としてＰｔを有する２電極電気化学セルが使用された。電圧を10〜40 Vに調整して、TaO _{x を作成しました。} ナノチューブの直径は20〜90nmの範囲です。低強度の紫外線照射（約2 mW / cm ² ）TaO _{x に蛍光ブラックライト電球を使用} 生体適合性テストの前に、8時間のナノチューブサンプルが作成されました。

材料の特性評価

TaO _{x の表面形態、内径と外径、壁の厚さ、長さ} ナノチューブは、走査型電子顕微鏡（SEM）によって特徴づけられました。エネルギー分散分光計（EDS）を備えたX線回折（XRD）および透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して、TaO _{x の結晶構造を調べました。} ナノチューブアレイ。 TaO _{x の表面湿潤性を評価するために、接触角測定を実施しました。} 分度器接眼レンズを備えた水平顕微鏡を使用した伸長法によるナノチューブサンプル。測定の試験液として水と培地を使用しました。

ヒト線維芽細胞培養

MRC-5ヒト線維芽細胞（BRCC、Bioresource Collection and Research Center、Hsinchu、Taiwan、BCRC No. 60023）を10 cm組織培養プレートにプレーティングし、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むイーグル最小必須培地（Gibco）で培養しました。 ）、2 mM l-グルタミン、1.5 g / L重曹、0.1 mM非必須アミノ酸、1.0 mMピルビン酸ナトリウム、5％CO ₂ 37°Cで。次に、オートクレーブ処理したTaO _{x に細胞を播種しました。} さらなる研究のために12ウェル培養プレート（Falcon）の底にシートを置きます。

細胞接着アッセイ

各TaO _{x に細胞を播種しました} 2.5×10 ³ の密度のシート セル/ cm ² 5％CO ₂ で培養 37°Cで3日間、PBSで2回すすいだ。基板上の付着細胞を室温で4％パラホルムアルデヒドで1時間固定した後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄し、PBS中の0.1％Triton X-100（Sigma-Aldrich）で15分間透過処理しました。 4°C。 PBSで洗浄した後、ローダミンファロイジン（Life Technologies）と室温で15分間インキュベートすることにより、アクチンフィラメントを標識しました。次に、ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（Thermo FisherScientific）と5分間インキュベートすることにより、細胞核を染色しました。細胞を蛍光顕微鏡（AX80、オリンパス）で分析し、細胞接着の形態と細胞骨格の配置を調べました。 SEM観察では、細胞を2.5％グルタルアルデヒド溶液（Merck）で室温で1時間固定した後、PBS溶液で2回リンスし、一連のエタノール（40、50、60、70、80、90、および100）で脱水しました。 ％）および臨界点乾燥機（CPD 030、ライカ）で乾燥した臨界点。 SEM観察の前に、サンプルに薄い白金膜をコーティングしました。

細胞増殖アッセイ

各TO _{x に細胞を播種しました} 1×10 ⁴ の密度の基板 セル/ cm ² 1週間培養しました。 1週間後、サンプルをPBSで2回リンスし、WST-1試薬キット（Roche、ペンツベルク、ドイツ）を使用して細胞増殖を推定しました。 10％WST-1細胞増殖試薬を含む培地を各検体に添加し、5％CO ₂ の加湿雰囲気で培養しました。 37°Cで2時間。各ウェルの溶液を96ウェルプレートに移した。溶液の吸光度は、分光光度計（Spectral Max250）を使用して450nmで測定しました。

統計分析

すべての実験は3回行われ、少なくとも3回の独立した実験が行われました。データは平均±標準偏差（SD）として表され、SPSS 12.0ソフトウェア（SPSS Inc.）を使用した分散分析（ANOVA）によって分析されました。 p <0.05の値は統計的に有意であると見なされました。

結果と考察

図1a–eは、平坦なTaフォイルと陽極酸化されたままのTaOのSEM画像を示しています _x 平均ナノチューブ直径がそれぞれ20、35、65、90nmのナノチューブアレイ。すべての陽極酸化処理されたTaO _x ナノチューブは明確に定義されたナノチューブ構造を示し、それらのナノチューブの直径は印加電圧にほぼ比例していました。これらのサンプルの中で、直径20 nmのナノチューブは、図1bから取った拡大領域に示されているように、比較的不明瞭なナノチューブ表面を示しています。この観察結果は、陽極酸化プロセスでの低電圧動作下での電界強度が弱いことに起因する可能性があります。図2は、すべてのTaO _{x のクロスセッションをさらに示しています。} ナノチューブとそれに対応するナノチューブの長さ。 XRDおよびTEM分析を使用して、TaO _{x をさらに特定しました。} ナノチューブの結晶化度。図3aのXRDスペクトルに示されているように、Ta箔に関連するピークのみが観察され（JCPDSカード番号04–0788）、陽極酸化されたままのTaO _x ナノチューブはおそらくアモルファス相です。図3bは、直径90nmのTaO _{x から撮影した代表的なTEM画像を示しています。} 陽極酸化されたままのサンプルからナノチューブが剥がれ、明確に定義されたナノチューブ構造が明らかになりました。挿入図の斑点のない回折パターンは、TaO _{x であることを確認しています。} ナノチューブは非結晶です。

a を示すSEM画像 Taフォイル表面と自己組織化TaO _x 直径が b のナノチューブ 20、 c 35、 d 65、および e それぞれ90nm

TaO _{x の断面を示すSEM画像} 直径が a のナノチューブ 20、 b 35、 c 65、および d それぞれ90nm

a 陽極酸化されたままのTaOのXRDスペクトル _x 異なる直径と b のナノチューブ 陽極酸化されたままのTaO _{x から撮影されたTEM画像} 直径90nmのナノチューブ。挿入図は、対応する回折パターンも示しています

以前の研究では、細胞の付着、拡散、および細胞骨格の組織化は、疎水性の表面と比較して親水性の表面で著しく優れていることが報告されています[28]。 Das etal。さらに、低い接触角は高い表面エネルギーを意味し、これは細胞接着の改善に寄与する重要な要因でもあることを示しています[29]。したがって、TaO _{x の影響を理解することが不可欠です。} 表面湿潤性に関するナノチューブトポグラフィー。図4に示すように、陽極酸化処理されたままのすべてのTaO _x ナノチューブは、接触角が90°よりはるかに小さいため、親水性が高くなっています。さらに、それらの接触角は、ナノチューブの直径が35 nmに減少すると単調に減少し、直径が20nmに減少すると逆に増加することがわかりました。また、TaO _x ナノチューブサンプルは、試験液として水または培地を使用した場合にも同様の傾向を示します。親水性材料の小さな接触角を説明するウェンゼルの法則に基づいて、観察された湿潤性の挙動を説明しようとしています[30]。ウェンゼルのモデルでは、親水性材料の表面粗さが増すと接触角が小さくなり、水滴の下の溝が水で満たされます。ここでは、粗さ係数、つまり投影面積の単位あたりのナノチューブの物理的表面積を使用して、TaO _{x の幾何学的粗さを評価します。} ナノチューブサンプル[31]。図5に示すように、内径は D 、壁の厚さ W 、およびナノチューブの長さ L 、純粋に幾何学的な粗さ係数 G [4π L として計算できます { D + W } / {√3（D + 2 W） ² }] + 1 。 この計算では、ナノチューブのすべての表面が完全に滑らかであると想定しています。すべてのナノチューブサンプルについて計算された粗さ係数は、図5の表にまとめられています。直径20 nmのサンプルを除いて、直径の小さいナノチューブは幾何学的粗さが大きいため、ウェンゼルのモデルによれば、より優れた親水性を示すと考えられます。この推論は、ナノチューブの直径が35nmに減少すると接触角が減少するという我々の結果と一致しています。また、比較的不明瞭なナノチューブ表面を示す直径20 nmのナノチューブは、他のナノチューブよりも幾何学的粗さが小さく、親水性が低いこともよく説明されています。

a – j a 上の水と培地の液滴を示す光学画像 、 f Taフォイル表面と自己組織化TaO _x 直径が b のナノチューブ 、 g 20、 c 、 h 35、 d、i 65、および e 、 j それぞれ90nm。接触角は画像に示されています

内径 D の理想的なナノチューブ構造の概略図 、壁の厚さ W 、およびナノチューブの長さ L 。この研究で計算されたすべてのナノチューブサンプルの粗さ係数は、表にまとめられています

平らなTaフォイルとTaO _{x に応答したヒト線維芽細胞の挙動} ナノチューブアレイはさらに研究された。 TaO _{x での線維芽細胞の付着を評価するには} ナノチューブ、細胞骨格アクチンはローダミンファロイジンで染色されて赤色蛍光を発現し、核はDAPIで染色されて青色蛍光を発現しました。アクチン免疫染色は、平らなTaフォイルとTaO _{x の識別可能な細胞-材料接触形態を示します} さまざまな直径のナノチューブ（図6を参照）。細胞は最初に材料表面に付着し、次にさらに細胞分裂するために広がる必要があることはよく知られています。より良い細胞接着は、アクチン細胞骨格に結合したインテグリンを介した細胞内シグナル伝達カスケードのより多くの活性化を引き起こす可能性があります[32、33、34]。細胞接着の詳細な観察にはFE-SEMを使用しました（図7を参照）。直径35nmの線維芽細胞は、細長い平坦な形態で優れた細胞接着を示します。一方、Taフォイルと直径90nmのTaO _{x 上の線維芽細胞} ナノチューブは、付着した細胞が少なく、細胞がある程度広がっていないことを示しています。ナノチューブ上の細胞の被覆面積は、ImageJソフトウェアを使用してさらに推定され、これらのSEM画像に記録されています。接触角の傾向と同様に、被覆面積は、ナノチューブの直径が35 nmに減少すると単調に減少し、直径が20nmに減少すると逆に増加することがわかりました。直径35nmのTaO _x ナノチューブは確かに最大のセルカバレッジエリアを示しています。接着に適した部位が検出されると、細胞は表面の特徴を認識することが知られています。細胞はTaO _{x への接触を安定させることができると考えられています} 接着斑と成熟アクチン繊維を形成し、続いてチューブリン微小管を動員することによるナノチューブ[35]。アクチン細胞骨格は、癒着内にあるインテグリンにリンクしています。私たちの発見は、直径35 nmのナノチューブの細胞骨格は、平らなTa箔や他のTaO _{x の細胞骨格よりもよく形成される可能性があることを示唆しています。} ナノチューブアレイ。

a の線維芽細胞接着の蛍光顕微鏡画像 Taフォイルと自己組織化TaO _x 直径が b のナノチューブ 20、 c 35、 d 65、および e それぞれ90nm。赤色の蛍光は細胞骨格タンパク質のアクチンフィラメントを示し、青色の蛍光は核を示します

a – e a でのヒト線維芽細胞の細胞接着と増殖を示すSEM画像 Taフォイル表面と自己組織化TaO _x 直径が b のナノチューブ 20、 c 35、 d 65、および e それぞれ90nm。 ImageJソフトウェアによって推定されたサンプル上の細胞のカバレッジエリアは、画像に示されています

WST-1アッセイを使用して、TaO _{x での線維芽細胞の増殖をさらに評価しました。} 異なる直径のナノチューブ。図8は、WST-1アッセイの結果から測定された光学濃度の比較を示しています。細胞増殖は直径35nmのTaO _{x で最も高いことがわかります。} ナノチューブサンプル。ただし、TaグループとTaO _{x の間に大きな違いはありません。} ナノチューブアレイ。さらに、細胞増殖と表面湿潤性は、TaO _{x とほぼ同様の傾向を示します。} ナノチューブの直径。この観察は、ナノチューブの直径だけでなく、表面の湿潤性も細胞接着とそれに続く広がりに強く影響することを示唆している。言い換えれば、直径35 nmのナノチューブと比較して、直径20 nmのナノチューブは線維芽細胞に多くの焦点を与える可能性がありますが、親水性が低いため、いくつかの効果的な焦点接触が失われ、細胞接着が妨げられます。最終的に、直径35nmのTaO _x ナノチューブは、すべてのサンプルの中で最も高い生体適合性を示しています。

Taフォイルおよび自己組織化TaO _{x 上でヒト線維芽細胞を培養した後に測定された光学密度（QD）} 異なる直径のナノチューブ。標準偏差を含むOD値は、添付の表としてリストされています

結論

結論として、この作業では、陽極酸化処理されたTaO _{x の生体適合性を研究します。} ナノチューブの直径が異なるナノチューブ。すべての陽極酸化されたTaO _x ナノチューブは主にアモルファス相であることが確認されました。 TaO _{x を使用して表面湿潤性の遷移について説明します} ウェンゼルのモデルに基づくナノチューブの直径。インビトロでの生体適合性評価は、線維芽細胞がTaO _{x で明らかな湿潤性依存性の挙動を示すことをさらに示しています。} ナノチューブアレイ。直径35nmのTaO _x ナノチューブアレイは、すべてのナノチューブサンプルの中で最高の生体適合性を示します。この強化は、TaO _{x によって提供される高密度の焦点に起因する可能性があります。} より高い表面親水性によるナノチューブ。この研究は、TaO _{x を形成することにより、Taの生体適合性を改善できることを示しています。} 適切なナノチューブの直径と幾何学的粗さを備えたナノチューブアレイ。