光学顕微鏡を使用した分光法

ハイフンでつながれた機器は、2つの異なるテクノロジーの機能をブレンドして、新しい機能を備えた新しい分析技術を形成する機器です。顕微鏡分光光度計は、そのようなハイフンでつながれた機器の1つです。これは、光学顕微鏡の倍率とUV-可視-NIR範囲分光光度計の分析能力を組み合わせたハイブリッドです。そのため、顕微鏡分光光度計を使用して、深紫外線から近赤外領域までの顕微鏡サンプル領域の分子スペクトルを測定できます。それらは多くの異なるタイプの分光法用に構成することができ、そのため、ミクロンサイズのサンプルの吸光度、反射率、さらには蛍光やフォトルミネッセンスなどの発光スペクトルを測定するために使用されます。特殊なアルゴリズムを追加することで、顕微鏡分光光度計を使用して、薄膜の厚さを測定したり、顕微鏡サンプルの測色計として機能したりすることもできます。

顕微鏡分光光度計を使用する理由はたくさんあります。最も明白なのは、スペクトルがミクロンよりも小さいサンプル領域から取得できることです。さらに、これらの機器は、固体または液体の形で少量のサンプルしか必要としません。もう1つの利点は、多くのサンプルで準備がほとんどまたはまったく必要ないことです。また、分光光度計ではスペクトル範囲が広く、照明の変動を補正でき、光の各波長帯の強度を測定できるため、分光法による色の比較はより正確になる傾向があります。

顕微鏡検査が登場する前は、多くの種類の顕微鏡サンプルを分析する唯一の方法は、微量化学試験を使用してから、ある種の目視検査を行うことでした。残念ながら、これらの方法は破壊的であり、多くのサンプルを必要とし、人間の視覚系の不正確さに悩まされる傾向があります。顕微鏡分光光度計はこれらの問題を回避し、人間の目の範囲を超えて「見る」ことができ、他の方法では明らかにならない変動を検出できます。

顕微鏡分光光度計の設計

顕微鏡分光光度計は、光学顕微鏡または光学顕微鏡をUV-可視-NIR範囲分光光度計と統合します（図1）。顕微鏡は、小さな物体の画像を拡大して研究できるように設計された装置です。分光光度計は、紫外線から可視および近赤外領域までの光の各波長の強度を測定する機器です。適切に構成された顕微鏡分光光度計を使用すると、サブミクロンスケールのサンプリング領域で吸光度、反射率、および発光スペクトルを取得できます。

このような広いスペクトル範囲を良好な画像とスペクトル品質でカバーするために、カスタム設計の顕微鏡が構築され、分光光度計と統合されています。標準的な光学顕微鏡は、光学系に使用される材料と光源自体のために、可視領域の一部のみをカバーする限られたスペクトル範囲を持っています。最新の顕微鏡分光光度計は、光学設計とNIRを介した深紫外線用に最適化された光源を備えた特注の顕微鏡を利用しています。

良好なスペクトル結果を得るためには、分光光度計自体も顕微分光法用に設計する必要があります。これは、許容可能なスペクトル分解能を維持しながら、分光光度計が高感度でなければならないことを意味します。顕微鏡分光光度計はシングルビーム装置であり、サンプルを測定する前に参照スペクトルを取得する必要があるため、安定性も問題になります。同じサンプルを測定する場合、透過または反射顕微分光法から蛍光分光法に頻繁に切り替わるため、機器は高いダイナミックレンジを備えている必要があります。これにより、顕微鏡サンプルのまったく同じ場所からさまざまな種類のスペクトル情報を取得できます。

分光光度計と顕微鏡の統合は非常に重要です。顕微鏡と分光光度計は両方とも顕微鏡用に最適化する必要がありますが、顕微鏡分光光度計の操作の鍵は、それらが連携できるようにするハードウェアです。このインターフェースにはいくつかの基本的な要件があります。最も重要なことは、顕微鏡によって収集された電磁エネルギーをサンプルから分光光度計に送る必要があることです。ただし、ユーザーはサンプル測定領域を視覚化できるだけでなく、周囲のサンプルも見ることができる必要があります。これは、分光光度計の入口開口部をサンプル画像と同じ焦点面に配置することによって行われます。次に、サンプルは、通常の顕微鏡で行うように、入口開口部の画像が測定される領域を超えるまで、顕微鏡ステージで移動することができます。図2では、画像の中央にある黒い四角が分光光度計の開口部です。これはすべてリアルタイムで行われるため、顕微鏡サンプルの分光法は迅速かつ簡単です。

図3に示すように、顕微鏡光学系はサンプルに光を集中させます。次に、電磁エネルギーが顕微鏡の対物レンズによってサンプルから収集されます。対物レンズからの光は、分光光度計のミラーリングされた入口開口部に焦点を合わせます。光の大部分は、入口開口面からカメラに反射されます。分光光度計の開口部もカメラによって画像化されるため、サンプル上に黒い四角として表示されます（図2）。これにより、顕微鏡分光光度計の簡単かつ迅速な位置合わせが可能になります。入口開口部を通過した光は、分光光度計を通過し、そこでスペクトルが測定されます。

顕微鏡は、実行する実験のタイプに応じて、さまざまな照明スキームで構成できます。白色光による入射照明により、深紫外線から近赤外までの反射顕微分光法が可能になります。入射照明は、蛍光またはフォトルミネッセンス顕微分光法にも使用できます。さらに、顕微鏡コンデンサーを介してサンプルに白色光を集束させた透過顕微分光法が可能です。

顕微分光法の応用

最初の顕微鏡分光光度計は1940年代に開発され、それ以来、さまざまなアプリケーションが開発されてきました。顕微鏡サンプル領域のスペクトルを取得する機能を備えた顕微鏡分光光度計は、大学の研究室から生産ラインまで、品質管理や故障分析のためにあらゆる場所で使用されています。

法医学。 法医学的証拠の分析は、1980年代初頭以来、顕微鏡分光光度計の最も重要なアプリケーションの1つです。最大の努力は、痕跡証拠、特に繊維とペイントチップの分析でした1、2。それらの名前が示すように、これらのタイプのサンプルは通常顕微鏡であり、証拠であるため、テストによって損傷または破壊されるべきではありません。ファイバーでは、顕微鏡分光光度計を使用して、個々のファイバーのUV-可視-NIR吸光度および蛍光スペクトルを測定します。通常、ペイントチップは断面化され、各層の吸光度スペクトルが測定されるため、既知のサンプルと問題のあるサンプルを高度な識別で比較できます。

フラットパネルディスプレイ。 最新のフラットパネルディスプレイは、数百万のマルチカラーピクセルで構成されています。技術が進歩するにつれて、ピクセルはますます小さくなり、ますます大きな表面全体にさらに密に詰め込まれます。最新のディスプレイは、量子ドットや有機発光ダイオードなどのさまざまな技術を使用して、微視的スケールでさまざまな色のピクセルを作成します。顕微鏡分光光度計は、これらの材料を実行可能な光源として、そして最終的にはディスプレイとして開発するのに役立ちます3,4。顕微鏡分光光度計は、ピクセルの色と強度の両方がディスプレイ全体で一貫していることを確認するために製造プロセスでも使用され、それによってディスプレイ全体で明るく均一に照らされた画像を保証します。

エネルギー。 石炭と石油の根源岩には、ビトリナイトやその他のマセラルが含まれています。顕微鏡分光光度計は、石炭、コークス、石油根源岩の熱成熟度5、したがってエネルギー含有量を評価するために使用されます。これは、研磨されたサンプル上のビトリナイトの絶対反射率を測定することによって行われます。反射率に応じて、サンプルの熱成熟度が決定される場合があります。

ナノテクノロジー。 顕微鏡分光光度計は、透過率、反射率、および発光スペクトルの顕微鏡サンプル領域を測定する能力に基づいて、ナノテクノロジーと材料科学も進歩させています。急速に成長しているアプリケーション分野の1つは、表面プラズモン共鳴（SPR）の開発と使用です6,7,8。

表面プラズモンは、平面の金属表面またはナノスケールの金属粒子を光で照らすことによって励起されます（図4）。これらの材料の光学特性の変化は、これらのナノ粒子または表面が他の材料と相互作用するときに発生します。そのため、何らかの形のプラズモン共鳴を示す新しい材料を開発するだけでなく、これらの現象を特徴とするデバイスを構築するために多くの作業が行われています。後者には、さまざまなタイプのバイオセンサーとマイクロ流体デバイスセンサーが含まれます。顕微鏡分光光度計は、SPR材料のスペクトルがさまざまな条件下でどのように変化するかを測定し、研究者が新しい材料を特徴付けて、特定の光学効果のためにその材料を「調整」できるようにします。

結論

顕微鏡分光光度計は、光学顕微鏡と分光光度計を組み合わせたハイフンでつながれた技術であり、顕微鏡のサンプル領域のスペクトルを取得できます。このような機器は、深紫外線から可視領域および近赤外領域への吸収および反射スペクトルが可能です。顕微鏡分光光度計は、蛍光および他のタイプの発光スペクトルを測定することもできます。これらのデバイスは、法医学、半導体および光学膜厚測定、バイオテクノロジー、最新の材料科学など、多くの分野で使用されています。

参考資料

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4. Rezaei、S. D.、Hong Ng、R. J.、Dong、Z.、Ho、J.、Koay、E. H.、Ramakrishna、S。、＆Yang、J. K.（2019） 一定のサブ波長分解能を持つ広色域プラズモニックカラーパレット 。 ACS nano、13（3）、3580-3588。
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この記事は、CRAIC Technologies（San Dimas、CA）の社長であるPaulMartin博士によって書かれました。詳細については、マーティン博士にお問い合わせください。このメールアドレスはスパムボットから保護されています。表示するにはJavaScriptを有効にする必要があります。または、こちらにアクセスしてください 。