Fe3 +用の再開可能な蛍光プローブBHN-Fe3O4 @ SiO2ハイブリッドナノ構造とそのバイオイメージングへの応用

要約

多機能蛍光プローブBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ のナノ構造設計および開発されました。 Fe ³⁺ に対して優れた選択的応答を示します蛍光消光を備えており、外部磁場を使用してリサイクルできます。 EDTAを追加した場合（2.5×10 ^-5 M）後件部Fe ³⁺ -BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 、Fe ³⁺ 複合体から除去することができ、その蛍光プロービング能力が回復します。これは、この構成されたオンオフタイプの蛍光プローブを逆にして再利用できることを意味します。同時に、このプローブは、Fe ³⁺ を定量的に検出するためにうまく適用されました。検出下限が1.25×10 ^-8 の線形モード M.さらに、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ構造プローブは、Fe ³⁺ の検出に使用されています。生きているHeLa細胞で、バイオイメージング検出で大きな可能性を示しています。

背景

あらゆる種類の小分子やイオンを検出する新しい方法の開発は、科学研究者にとって重要な課題となっています。代謝過程で不可欠な重要な金属イオンの1つとして、Fe ³⁺ 脳機能や病理学、遺伝子転写、免疫機能、哺乳類の生殖など、さまざまな生物学的プロセスにおいて不可欠かつ重要な役割を果たしています[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。医学的調査によると、代謝または生物学的プロセスは、Fe ³⁺ の場合にのみ、すべての生細胞が適切に機能するために正常であることが示されています。濃度は適切な範囲にあります。 Fe ³⁺ の場合生体内の濃度が適切な範囲から外れると、代謝または生物学的プロセスでいくつかの疾患または重篤な障害が誘発される可能性があります[10、11、12]。 Fe ³⁺ を検出するために、さまざまな検出方法が開発されていますが [13,14,15]、蛍光技術は、操作が簡単で、感度と選択性が高く、検出限界が低いため、より効果的で強力な方法です[16,17,18,19,20]。

これらの分子ベースの蛍光プローブでは、安全性、リサイクル性、および再利用性に関するいくつかの問題が解決されていません。たとえば、参考文献[21]で指摘されているように、使用される小分子は毒性があります。分子ベースの蛍光プローブに見られるこれらの欠陥は、実際のアプリケーションに入るプローブを完全に制限します。上記のFe ³⁺ 用蛍光プローブの安全性の課題を克服するため、小分子蛍光プローブに組み込まれた無機支持体を使用することにより、別の技術的アプローチが提案されている。このような新しいアプローチでは、磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、ナノチューブ、メソポーラスシリカなどの無機材料を蛍光プローブの設計に使用できることが知られています[22、23、24]。これらすべての無機材料の中で、磁性シリカコアシェルFe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子には、毒性が低く、生体適合性が高く、外部磁場による分離が簡単で、表面積が大きいため、分子内の他の材料またはイオン認識および分離領域に蛍光プローブを移植できるという利点があります[25、26、27]。したがって、この新しいアプローチは、Fe ³⁺ を検出するためのアプリケーションを実現するための可能な方法を提供します。、特に毒性が低く、生体適合性が高い安全性において。

この作品では、一種の多機能磁性BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ 用のナノ構造蛍光センサー設計され、合成されました。 Fe ³⁺ に対して高感度で選択的な反応を示します CH ₃で著しく蛍光消光します CN / H ₂ O（1：1、 v / v ）室温で。外部磁場を印加することにより、プローブを溶液から分離することができます。システムにEDTAを追加する場合、Fe ³⁺ 蛍光強度の回復により複合体から除去することができます。さらに、HeLa細胞を使用した共焦点蛍光イメージングは、プローブを適用してFe ³⁺ を検出できることを示しました。生細胞で。したがって、得られたBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 優れた選択性、水溶性、可逆性、およびリサイクル性を示し、Fe ³⁺ の検出に役立ちます。。

メソッド/実験

Fe ₃の合成 O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子

Fe ₃ O ₄ マグネタイトナノ粒子は参考文献[28]に従って合成されました。それらは、安定したFe ₃を得るために、修正されたストーバー法[29]によってさらに薄いシリカ層でコーティングされました。 O ₄ @SiO ₂ 。オルトケイ酸テトラエチル（TEOS）は、エタノール/水混合物のシードとしてマグネタイトナノ粒子で加水分解されました。結果として得られるFe ₃ O ₄ @SiO ₂ 蛍光センサーナノ粒子の担体として、平均直径50〜60nmのナノ粒子を使用しました。

BHN-Fe ₃の合成 O ₄ @SiO ₂ ナノ構造

N -ブチル-4-ビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ-1,8-ナフタルイミド（BHN）は、以前に報告された方法[30、31]に従って合成されます。最初の中間体は、4-ブロモ-1,8-ナフタル酸無水物と n の反応によって合成されました。 -ブチルアミン。次に、中間体をジエタノールアミンと反応させて、BHNを得た。 ESI-MS：m / z 357.3（M + H ⁺ ）。 ¹ H NMR（CDCl ₃ 、400 MHz）：δ （ppm）：0.95（t、3H、 J =8.0 Hz）; 1.41（m、2H）; 1.66（m、2H）; 2.69（m、2H）; 3.60（t、4H、 J =5.0 Hz）; 3.86（t、4H、 J =5.0 Hz）; 4.08（t、2H、 J =8.0 Hz）; 7.33（d、1H、 J =8.0 Hz）; 7.58（t、1H、 J =8.0 Hz）; 8.38（d、1 H、 J =8.0 Hz）; 8.41（dd、1H、 J =8.0 Hz）; 8.84（dd、1H、 J =8.0Hz）。

BHN（356 mg、1 mmol）と3-イソシアナトプロピル-トリエトキシシラン（IPTES、494 mg、2 mmol）を無水THF（15 mL）に室温で混合しました。次に、溶液をN ₂の下で48時間還流しました。。その後、溶媒を蒸発させ、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、石油エーテル/ CH ₂）によりさらに精製した。 Cl ₂ /メタノール50/50/1）、255 mg（30％）のBHN-IPTESを黄色の粉末として得ます。 ESI-MS：m / z 851.5（M + H ⁺ ）。 ¹ H NMR：（400 MHz、CDCl ₃ ）：δ （ppm）0.60（t、4H、 J =8.0 Hz）; 0.98（t、3H、 J =8.0 Hz）; 1.21（m、18H）; 1.45（m、2H）; 1.58（m、4H）; 1.70（m、2H）; 3.13（m、4H）; 3.73（t、2H、 J =5.0 Hz）; 3.82（m、12H）; 4.16（m、4H）; 4.24（m、4H）; 4.94（m、2H）; 7.38（d、1H、 J =8.0 Hz）; 7.70（t、1H、 J =8.0 Hz）; 8.45（d、1H、J =8.0 Hz）; 8.50（dd、1H、 J =8.0 Hz）; 8.58（dd、1H、 J =8.0Hz）。

100ミリグラムの乾燥Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子と300mg（0.35 mmol）のBHN-IPTESを無水トルエン（15 mL）に懸濁しました。溶液をN ₂の下で110°Cで12時間還流しました。 BHN-Fe ₃を取得するには O ₄ @SiO ₂ 。ナノ粒子を遠心分離（10,000 rpm）で収集し、無水エタノールで完全に繰り返し洗浄しました。上部の液体の蛍光を監視することにより、未反応の有機分子を完全に除去することができました。次に、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ構造は最終的に真空下で一晩乾燥されました。

結果と考察

BHN-Fe ₃の設計 O ₄ @SiO ₂

Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子は、安全でリサイクル可能で再利用可能なFe ³⁺ を構築するための有望な候補です。毒性が低く、生体適合性が高く、外部磁場によるリサイクルが容易な蛍光センサー。他のフルオロフォアと比較して、1,8-ナフタルイミドはストークスシフトが大きく、発光波長が長く、異なる側鎖と高い量子収率で修飾するのに便利です。したがって、適切な側鎖を導入することで、Fe ₃にグラフトすることができます。 O ₄ @SiO ₂ 安全でリサイクル可能で再利用可能なFe ³⁺ を得るためのナノ粒子顕著な蛍光応答を示す蛍光センサー。

よく知られているように、Fe ³⁺ OおよびN原子と簡単に配位できるため、1,8-ナフタルイミドをジエタノールアミンで修飾して、1,8-ナフタルイミドがFe ³⁺ を検出できるようにしました。図1aに示すように。ジエタノールアミンでは、ヒドロキシエチル部分とエステルアミド部分が受容体ユニットとして機能しました。最後に、修飾された1,8-ナフタルイミドをFe ₃にグラフトしました。 O ₄ @SiO ₂ Si（OEt）₃間の加水分解-凝縮反応を介してとFe ₃の表面のヒドロキシル O ₄ @SiO ₂ 図1bに示すように。

BHN-Fe ₃の構造 O ₄ @SiO ₂

図2aに示すTEM画像から、BHN-Fe ₃の典型的なコア/シェル構造 O ₄ @SiO ₂ はっきりと表示されます。裸の磁気コアは液体中で凝集しやすいですが、磁性ナノ粒子の表面のシリカシェルは凝集を防ぎ、分散性を向上させます。酸化鉄ナノ粒子はシリカシェルにうまく閉じ込められ、よく分散しています。また、コア/シェル構造の全体の直径は50〜60 nmの狭い分布であり、酸化鉄コアは10 nmです。これは、超常磁性の臨界サイズよりも小さく、蛍光プローブのキャリアナノ粒子として使用するのに適しています。

図2bは、Fe ₃のXRD粉末回折パターンを示しています。 O ₄ 、Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 、およびBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 。裸のFe ₃の6つの特徴的な回折ピーク O ₄ マグネタイトの220、311、400、422、511、および440の反射にインデックスを付けることができます。ただし、Fe ₃に起因するXRDピーク O ₄ Fe ₃の強度が低い O ₄ @SiO ₂ およびBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 、これは、Fe ₃ O ₄ ナノ粒子はアモルファスシリカシェルでコーティングされています。シリカシェルは、Fe ₃の相対含有量を減少させる可能性があります O ₄ コアし、ピーク強度に影響を与えます。また、幅広いXRDパッケージは、Fe ₃で20°〜30°の低い回折角で見られます。 O ₄ @SiO ₂ およびBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 、これはアモルファス状態のSiO ₂に対応します Fe ₃を取り巻く殻 O ₄ ナノ粒子。

Fe ₃の表面でのBHN-IPTESの修飾条件を研究する O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子、そのフーリエ変換赤外（FT-IR）スペクトルが測定されます。図2cに示すように、2つの曲線は両方とも、3400〜3500 cm ^-1 でシラノール上に伸びる-OHの典型的な振動バンドを示しました。および1000〜1200 cm ^-1 [32]。これは、Fe ₃のすべてのシラノールではないことを示しています。 O ₄ @SiO ₂ ナノ粒子は共有結合で修飾されています。 1630 cm ^-1 のバンド -OH振動の曲げモードを表します[33]。 1109を中心としたバンド（νas ）および800 cm ^-1 シロキサン（-Si-O-Si-）に起因する可能性があります[34]。上記のピークは、シリカシェルの存在を示しています。 2965および2934cm ^-1 に追加のピーク BHN-Fe ₃で見つかりました O ₄ @SiO ₂ 、脂肪族および芳香族基の-CH振動に対応します[32、35]。 1697、1590、および1516 cm ^-1 のバンド BHN-Fe ₃の O ₄ @SiO ₂ -CH ₃の曲げ振動に由来します BHNパート[36]から。これらの結果は、磁性材料BHN-Fe ₃に有機分子が存在することを示しています。 O ₄ @SiO ₂ 。

磁性ナノ粒子の超常磁性特性は、その生物学的応用に重要な役割を果たします。追加ファイル1：図S1は、BHN-Fe ₃の磁化曲線を示しています。 O ₄ @SiO ₂ これは、300Kで-15,000〜15,000 Oeの範囲の振動試料型磁力計によって測定されました。結果は、磁性Fe ₃の直径という結論と一致していました。 O ₄ 30 nm未満のナノ粒子は通常、室温で超常磁性です[37]。合成されたBHN-Fe ₃の飽和磁化値 O ₄ @SiO ₂ 約4.02emu / gです。さらに重要なのは、BHN-Fe ₃のヒステリシスループから O ₄ @SiO ₂ ナノ構造では、超常磁性を示し、ヒステリシスループに強制力は見られませんでした。この現象は、マグネタイトコアの直径が約10nmと小さいことが原因でした。同時に、シリカシェルはマグネタイトコアの凝集を防ぎます。したがって、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ構造はさらに良好な分散性を示すことができます。

BHN-Fe ₃の蛍光応答 O ₄ @SiO ₂

BHN-Fe ₃の蛍光応答を検証するには O ₄ @SiO ₂ さまざまな金属イオンについて、蛍光測定はCH ₃で実行されました。 CN / H ₂ O 1：1（ v / v ）HEPESバッファー中のpH7.36の溶液。 BHN-Fe ₃の濃度 O ₄ @SiO ₂ は0.2g / Lです（遊離有機分子に対応するのは約3.34×10 ^-5 M、TGAによると、図2d）、およびさまざまな金属イオンAg ⁺ 、Al ³⁺ 、Ca ²⁺ 、Cd ²⁺ 、Co ²⁺ 、Cr ³⁺ 、Cu ²⁺ 、Hg ²⁺ 、K ⁺ 、Li ⁺ 、Mg ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Na ⁺ 、Pb ²⁺ 、Zn ^{2 +} 、およびFe ³⁺ （すべて過塩素酸塩として）5.0×10 ^-5 M.図3aに示すように、Fe ³⁺ を添加すると、有意な蛍光消光が観察されました。、ただし、Cu ²⁺ 以外の他の金属イオンを追加した場合、同じ条件で蛍光強度の有意な低下は検出されませんでした。。 Cu ²⁺ 20分でわずかな蛍光消光と応答が発生します。ただし、同じ検出条件では、Fe ³⁺ 2分で応答を引き起こし、明らかに5分でクエンチします（図3c）。 BHN-Fe ₃の吸収スペクトル O ₄ @SiO ₂ （0.2 g / L）さまざまな濃度のFe ³⁺ の存在下（0〜200μM）を調査しました（図3dを参照）。 Fe ³⁺ の場合徐々に添加し、BHN-Fe ₃の吸光度を O ₄ @SiO ₂ 250および350nmで徐々に増加します。これは、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ と協調するナノ構造徐々に。

次に、Fe（ClO ₄ ）₃ CH ₃で CN / H ₂ O 1：1（ v / v） BHN-Fe ₃の組み合わせを理解するために適用されました O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ に向けてイオン。図3eに示すように、BHN-Fe ₃の蛍光発光 O ₄ @SiO ₂ （0.2 g / L）は、Fe ³⁺ のさまざまな濃度（0〜100μM）で徐々に減少します。 CH ₃に追加されました CN / H ₂ O 1：1（ v / v ）BHN-Fe ₃であることを示すHEPESバッファ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ と協調するナノ構造複合体を定量的に形成します。蛍光滴定実験は、結合定数log βを示唆しています Fe ³⁺ の場合 BHN-Fe ₃への結合 O ₄ @SiO ₂ 8.23と計算されます。 BHN-Fe ₃からの蛍光の直線的な増加 O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ を添加すると、ナノ構造が観察されました。 0〜20μM、およびBHN-Fe ₃の検出限界 O ₄ @SiO ₂ からFe ³⁺ 1.25×10 ^-8 で検出されました蛍光分析下のM。蛍光滴定とジョブプロットの結果は、Fe ³⁺ の1：1結合比を示唆しました。 BHN-Fe ₃を使用 O ₄ @SiO ₂ （図3f）。陽イオン競合実験の結果を図3bに示します。これにより、BHN-Fe ₃の選択性と感度がわかります。 O ₄ @SiO ₂ からFe ³⁺ 他の金属イオンの影響を受けません。

ここで、蛍光強度の著しい低下は次のように説明できます。BHN-Fe₃の蛍光強度 O ₄ @SiO ₂ は、415 nmのランプで励起されますが、大きな共役系を持つ1,8-ナフタルイミドにより、518nmで高い蛍光を示します。さらに、構造内の電子供与基は、同時にシステムの蛍光に影響を与えます。 Fe ³⁺ で安定してキレート化した場合 1,8-ナフタルイミドの4位にあるO原子とN原子によって、金属カチオンとフルオロフォアの間の電子またはエネルギー移動が電子吸収効果を生み出し、蛍光消光を引き起こします[38]（図。 4a）。

Fe ³⁺ を添加することによる蛍光消光 BHN-Fe ₃のソリューションに O ₄ @SiO ₂ 完全にリバーシブルでした。 EDTAを追加する場合（2.5×10 ^-5 M）Fe ³⁺ -BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ システムでは、蛍光強度はほぼ元のレベルのBHN-Fe ₃に復元されました。 O ₄ @SiO ₂ （図4b）。さらに、Fe ³⁺ を繰り返し添加することにより、再利用性を評価しました。 -EDTAは、BHN-Fe ₃を変更して、システムに循環します。 O ₄ @SiO ₂ 各ステップの後に記録されている蛍光強度と、対応するデータを図4cに示します。 BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ BHN-Fe ₃のまれな損失のみであるため、優れた再利用性を示します。 O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ に対する感度 Fe ³⁺ を5回繰り返した後に観察されました -EDTAサイクル。その磁気特性の結果として、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 逆転磁気の責任がありました。図4dに示すように、分散液の近くに磁石を置くことで10分後に分散液（0.2 g / L）から簡単に分離でき、磁石を取り外したときに穏やかに攪拌して再分散させることができました。この磁気分離能力とBHN-Fe ₃の認識特性 O ₄ @SiO ₂ ナノ構造は、Fe ³⁺ を分離するためのシンプルで効率的なルートを提供しますろ過アプローチではなく。さらに重要なのは、BHN-Fe ₃の磁気的責任の逆転です。 O ₄ @SiO ₂ ナノ構造は、それらのリサイクル可能性を評価する際の重要な要素となるでしょう[39]。その磁気特性と組み合わせて、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ の効率的な無機-有機ハイブリッドセンサーとして生物系にかなり適用可能でした。

生物学的用途では、センサーが生理学的pH範囲の特定の金属イオンの測定に適していることが非常に重要です。図5aに示すように、BHN-Fe ₃の蛍光強度 O ₄ @SiO ₂ Feの有無³⁺ さまざまなpH値で調査されました。 BHN-Fe ₃の蛍光強度 O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ を追加すると、わずかに減少します酸性条件下では、1,8-ナフタルイミドの4位でのN原子のプロトン化により、Fe ³⁺ の配位能力が弱くなるためです。。次に、Fe ³⁺ の劇的な蛍光変化 -BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ システムは、pHが中性pHで、弱アルカリ性条件下で見つかった。ここでは、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ 優れたFe ³⁺ を示します pHが5.84〜10.52の範囲にあるときの検知能力。これは、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ は、これらの複雑な環境や生物学的システムに適用されることが期待されるプローブです。

BHN-Fe ₃の能力をさらに実証するため O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ を検出する生体システムでは、生のHeLa細胞で実験を行いました。まず、BHN-Fe ₃の細胞生存率を調べました。 O ₄ @SiO ₂ およびFe ³⁺ -BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ MTTアッセイを使用します。 HeLa細胞をBHN-Fe ₃とともにインキュベートしました O ₄ @SiO ₂ RPMI-1640で37°Cで0.5時間、次にFe（ClO ₄ ）₃ 0.5時間のインキュベーションのために追加されました。次に、HeLa細胞の共焦点蛍光画像を観察し、センサーとFe（ClO ₄の濃度で優れた染色能を示します。）₃ 最大0.2g / Lおよび5×10 ^-5 M.次に、蛍光顕微鏡実験を実施して、複雑な生物学的システムへの応用のより高いグラデーションを調査しました。図5bに示すように、HeLa細胞は12オリフィスプレート上で37°C、5％CO ₂で増殖しました。雰囲気を24時間、その後BHN-Fe ₃で処理 O ₄ @SiO ₂ （0.2 g / L）、0.5時間インキュベートすると、細胞は強い緑色の蛍光を示しました。次に、細胞を5×10 ^-5 で処理しました。 M Fe（ClO ₄ ）₃ 。 0.5時間後、蛍光が著しく減少するのが観察されました（図5c）。したがって、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ の画像化に使用できます生細胞で。

結論

要約すると、新しい多機能蛍光プローブBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ のナノ構造正常に設計および合成されました。プローブBHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ Fe ³⁺ に選択的に応答できます蛍光消光とFe ³⁺ の効率的な分離外部磁場で。構成されたオンオフタイプの蛍光モニタリングシステムは、プローブを逆にして再利用できることを示しています。同時に、このプローブは、Fe ³⁺ を定量的に検出するためにうまく適用されました。低い検出限界で。さらに、BHN-Fe ₃ O ₄ @SiO ₂ ナノ構造プローブは、Fe ³⁺ の検出に使用されています。生きているHeLa細胞で、バイオイメージング検出で大きな可能性を示しています。