老化後の歯科用傾斜ナノガラス-ジルコニア材料の生体適合性

背景

歯科用ジルコニアベースのセラミック（たとえば、3 mol％イットリウム安定化正方晶ジルコニア多結晶（3Y-TZP））は、固有の変態強化メカニズムにより、優れた機械的強度と優れた耐破壊性を示し、補綴装置の製造に広く利用されています[ 1]。ジルコニアのコア材料は通常、不透明な外観を覆うために半透明のベニヤリングポーセレンでコーティングされています。ただし、層状ジルコニアの修復は失敗する傾向があります。ジルコニアベースの修復物が失敗する最も頻繁な理由として、ベニアリングセラミックの欠けと層間剥離が報告されています[2、3]。ベニアセラミックのチッピングと層間剥離は、ジルコニアコアとベニアセラミックの間の熱膨張係数と弾性率の不一致に起因することが報告されています[4]。そのため、前回の研究では、ナノジルコニア粒子から焼結したジルコニア表面に、熱膨張係数が一致する低弾性率のナノサイズガラスを浸透させ、弾性グレードを生成することにより、コアとベニアの結合を改善する新しいコンセプトを導入しました。ナノガラス/ジルコニア（G / Z）システム。 G / Zシステムのベニアリングポーセレンへの接着強度は、従来のジルコニアベースのシステムの接着強度の3倍であることが実証されました[4]。

Y-TZPの経年劣化はよく知られています。 Y-TZPの老化は、湿度、機械的負荷、および低温にさらされる口腔環境によって引き起こされる可能性があり、その結果、表面の粗面化、微小亀裂、およびY-TZP粒子の体内への放出が生じます[5、6]。湿度と低温の存在下で、正方晶から単斜晶（t-m）のジルコニア相変態が引き起こされる可能性があります。結晶の体積膨張により、材料表面に局所的な応力と微小亀裂が生じ、水が材料の内部にさらに浸透し、追加の相変態が起こり、機械的特性が低下します[7、8、9]。さらに、表面粗さや化学組成などの生体材料の物理化学的特性がその生体適合性に影響を与えることが現在広く知られています。したがって、G / Zの生体適合性に対する老化劣化の影響を評価する必要があります。

張ら。 [10、11]ガラスを緻密なジルコニア下部構造に浸透させ、優れた機械的特性を備えた段階的なガラス-ジルコニア複合材料を開発しました。ただし、特に老化現象を考慮すると、段階的なガラス-ジルコニア複合材料の生体適合性は不明です。

したがって、新しく開発されたG / Zシステムの生体適合性試験は、ガラス材料の追加とその結果としての構造変化のために、その臨床応用に不可欠です。 G / Zシステムの導入により、ジルコニアベースの修復物の失敗に対する解決策が提供され、成功率が向上する可能性があります。したがって、老化前後のG / Zシステムの生体適合性試験は、G / Zの臨床応用のためのバイオセーフティに関するガイドラインを提供します。

本研究では、老化前後のG / Zシステムの生体適合性を評価しました。評価には、細胞生存率、細胞形態、細胞接着、および酸化ストレス応答の分析と組み合わせた口腔粘膜刺激試験が含まれていました。

メソッド

標本の準備

Y-TZPは、すでに臨床応用が承認されている生体適合性材料であり、ここでは、Y-TZP検体を対照群として設定しました。すべての標本は均一なプレート（1.5×1.5×0.2 cm）として作成されました。 ISO 13356は、単純化された形状（曲げ棒）と研磨された表面を備えた試験片の評価について説明しています。

G / Z標本の準備

ガラス粉末は、ナノメートルの粉砕装置（Emax、Retsch、ハーン、ノルトラインヴェストファーレン、ドイツ）でナノサイズの粒子が得られるまで粉砕された。浸透ガラスの主成分と割合（> 1 wt％）を表1に示します[4]。イットリウム安定化ジルコニア粉末（5.18 wt％Y ₂ O ₃ 、TZ-3Y-Eグレード;東ソー、東京、東京県、日本）は、150 MPaの一軸圧力下で2分間圧縮された後、マッフル炉で1350°Cで2時間部分的に焼結されました。所望の酸化物をボールミル粉砕して200メッシュの粉末にした。 Y-TZP基板試験片は、1200°Cで2時間予備焼結され、多孔質構造を形成しました。溶融ガラススラリーを、予備焼結したY-TZP多孔質基板試験片の上面に塗布しました。次に、コーティングされた試験片を1350°Cで2時間浸透させて、段階的なガラスジルコニア構造を作成しました。ガラスの浸透と緻密化は同時に行われました。

Y-TZP標本の準備

Y-TZPブランク（Weiland、Weiland Dental、Pforzheim、Baden-Württemberg、Germany）は、CAD / CAMシステム（Zenostar、Weiland Dental、Pforzheim、Baden-Württemberg、Germany）を使用して設計、粉砕、および完全密度まで焼結しました。

細胞培養

ヒト歯肉線維芽細胞（HGF）は、10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％l-グルタミン、および1％非必須アミノ酸を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、栄養混合F-12）で培養されました。 5％CO ₂ の加湿雰囲気 37°Cで。培地は3日ごとに交換されました。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすぐことにより培養皿から細胞を取り出し、トリプシン-EDTA溶液中でインキュベートしました。細胞を各テスト基板に1×10 ⁵ で播種しました すべてのアッセイで同じ培地中の細胞/ mL。

エージング

咀嚼状態を刺激するために、37°C​​の人工唾液で機械的老化を行い、2Hzの周波数で3点屈曲固定具を使用して負荷をかけました。次のエージングプロファイルが使用されました：80N負荷および10 ⁵ すべての標本のサイクル[12、13]。

細胞生存率

未老化および老化したG / ZおよびY-TZP曝露後のHGFの生存率は、alamarBlue ^® を使用して2、24、48、および72時間（曝露時間）で決定されました。 DMEMの10％溶液としての塩分析。アッセイテストの前に、すべての検体をHGFから取り出し、次に500μLのalamarBlue ^® を取り出しました。 色素を加えた後、4時間インキュベートしました。アリコート（100μL）を96ウェル細胞培養皿にデカントし、Synergy™H4マイクロプレート分光光度計（BioTek、Winooski、Vermont、USA）を使用して、励起（530 nm）および発光（580 nm）波長で蛍光強度を測定しました。すべての実験は3回3回行った。細胞の生存率は次のように計算されました：生存率（％）=（処理されたウェルの吸光度）/（コントロールウェルの吸光度）。

酸化ストレス

老化前後のG / ZおよびY-TZP処理HGFの活性酸素種（ROS）レベルは、活性酸素種アッセイキット（南京江蘇生物工学研究所、南京、江蘇）を使用して化学発光で同定されました。

細胞接着

HGFは、エージングの前後にG / ZおよびY-TZP試料表面で2時間培養されました。固定後、細胞核を4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）（Yeasen、Shanghai、Shanghai District、China）で染色しました。画像は、倒立LSM 510蛍光顕微鏡（Carl Zeiss、イエナ、トゥットリンゲン、ドイツ）で取得しました。接着細胞は、ランダムに選択された5つのセクション（450μm×450μm）の領域で×200の倍率で分析されました。細胞接着率は、接着細胞の数を播種された細胞の総数で割って決定されました。

細胞形態

HGFは、エージングの前後に、エージングされていないG / Z試料表面で2時間培養されました。固定後、ローダミンファロイジン（PBS中の3％BSAで1：100）を使用して、細胞を繊維状アクチン（F-アクチン）で染色しました。画像は、倒立LSM 510蛍光顕微鏡（Carl Zeiss、イエナ、トゥットリンゲン、ドイツ）で取得しました。細胞核の可視化のために、DAPI（Yeasen、Shanghai、Shanghai District、China）を使用してサンプルをガラスカバースリップにマウントしました。老化前後のG / ZおよびY-TZP表面の細胞形態は、XL-30 ESEM（Philips、アイントホーフェン、北ブラバント、オランダ）を使用した走査型電子顕微鏡（SEM）でも観察されました。

口腔粘膜刺激性試験

口腔粘膜刺激性試験は、中華人民共和国のYY / T0127.13-2009医学基準に従って実施されました。この試験には、10匹のWistar雄マウスを選択しました。老化したＧ ／ Ｚ標本は、試験材料として各動物について１つの頬袋に入れられ、一方、老化されていないＧ ／ Ｚ標本は、対照として反対側に置かれた。 2週間後に動物を犠牲にし、ディスクを取り外した後、ポーチを肉眼で検査しました。頬粘膜の組織学的分析は、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された凍結切片でさらに実施された。すべての巨視的および顕微鏡的観察の平均グレードが得られた。対照群の平均を試験群の平均から差し引いて、刺激指数を算出しました。

統計分析

一元配置分散分析（ANOVA）を使用して、プールされた（すべての曝露時間）細胞生存率、酸化ストレス、および個々の歯科標本の評価のための細胞接着率データ（SPSS 22.0; SPSS Inc.、シカゴ、イリノイ州、米国） 。

結果

段階的なレイヤー構造

傾斜層の厚さは、約0.9〜1.0mmに制御されました。 G / Zシステムの構造とSEM画像を図1a、bに示します。図1a、bは、残留ガラス、ガラスコーティングされたジルコニア粒子、および粒子間ボイドの痕跡からなる形態を示しています。これにより、コアとベニヤの結合強度を高めるのに理想的な表面形態が作成されました。さらに、傾斜層のEDS分析を図1cに示します。これは、表面からの距離が長くなるにつれて、Zr元素の含有量が増加し、Si、Al、およびLa元素の含有量が減少することを示しています。詳細は以前の研究[4]で説明されています。

G / Zの物理的および化学的性質。 a 構造図。 b SEM画像。 c 傾斜機能層のEDS分析

細胞生存率

老化したG / ZおよびY-TZPで処理された細胞では、72時間で有意な代謝低下が観察されました（ P <0.00001）（図2a）。 2時間後、老化したG / Z処理細胞の有意な代謝低下は観察されませんでした（ P =0.47）、24時間（ P =0.82）、および48時間（ P =0.53）（図2a）。老化したY-TZP処理細胞では、2時間後に有意な代謝低下は観察されませんでした（ P =0.82）、24時間（ P =0.32）、および48時間（ P =0.54）（図2a）。 G / Z標本は、2時間後のY-TZPと比較して細胞生存率に有意差を誘発しませんでした（ P =0.94）、24時間（ P =0.86）、48時間（ P =0.68）、および72時間（ P =0.61）老化前の曝露。 G / Z標本は、2時間後のY-TZPと比較して細胞生存率に有意差を誘発しませんでした（ P =0.98）、24時間（ P =0.54）、48時間（ P =0.73）、72時間（ P =0.50）エージング後の曝露。

老化前後のG / ZとY-TZPの生体適合性。データは平均±SD、 n を表します =5. a 老化および非老化標本で処理されたHGFの細胞生存率。 b 老化および未老化の標本で処理されたHGFのRos産生。 c 老化および非老化標本で処理されたHGFの細胞接着率。有意性対対照群： ^＃ P <0.01; ^* P <0.05

酸化ストレス

老化したG / ZおよびY-TZPで処理された細胞の酸化ストレスデータは、72時間で有意な増加を示しました（ P <0.00001、図1b）。対照的に、老化したG / Z処理細胞は、2時間でROS産生に有意差を誘発しませんでした（ P =0.91）、24時間（ P =0.42）、および48時間（ P =0.62）。さらに、老化したY-TZP処理細胞は、2時間でROS産生に有意差を誘発しませんでした（ P =0.07）、24時間（ P =0.40）、および48時間（ P =0.53）。 G / Z標本は、2時間でY-TZPと比較してROS生成に有意差を誘発しませんでした（ P =0.16）、24時間（ P =0.79）、48時間（ P =0.14）、および72時間（ P =0.43）エージング前の曝露。 G / Z標本は、2時間でY-TZPと比較してROS生成に有意差を誘発しませんでした（ P =0.27）、24時間（ P =0.17）、48時間（ P =0.07）、および72時間（ P =0.15）エージング後の曝露。

細胞接着

G / ZとY-TZPの両方の細胞接着率は、老化後に大幅に増加しました（図2c）。老化していないG / ZとY-TZPの細胞接着率に有意差はありませんでした（ P =0.71）（図2c）。老化したG / ZとY-TZPの細胞接着率に有意差はありませんでした（ P =0.71）（図2c）。 G / ZとY-TZPの細胞接着率は、老化後に有意差を示さなかった（ P <0.00001）（図2c）。老化前後のY-TZPとG / Zの細胞接着の特徴的な写真を図3a–dに示します。

老化前後のG / ZおよびY-TZPへの細胞接着。 a 高齢者G / Z。 b 未熟なG / Z。 c 老化したY-TZP。 d 未熟なY-TZP

細胞形態

異なるインキュベーション時間での蛍光画像は、細胞がG / Z表面に付着していることを示しました。ただし、細胞が平らになり、多角形でよく広がっている、老朽化し​​たG / Z表面（図4a–c）では広がりが大きかった。

蛍光顕微鏡で観察された老化前後のG / Z上のHGFの付着、広がり、および形態。 a 、 b 高齢者G / Z。 c 未熟なG / Z。細胞を基質上で72時間培養した後、固定し、糸状アクチン（F-アクチン、赤）と核（青）を染色しました

SEM画像は、老化および未老化のG / Z表面で培養された細胞が、伸長または細長い体と多数の微絨毛でかなり平らになっていることを示しました（図5a、b）。丸みを帯びた核が観察され、細胞質の広がりが標本表面に付着していることが確認できます（図5a）。

培養72時間後のエージング前後のG / ZでのHGF形態のSEM顕微鏡写真。 a 高齢者G / Z。 b 未熟なG / Z。元の倍率：×2000

口腔粘膜刺激性試験

試験側と対側の両方の肉眼的観察のスコアは0であり、結果として生じる刺激がないことを示しています。さらに、両側の顕微鏡評価からのスコアは0であり、明らかな刺激反応がないことを示しています。図6a、bは、未老化G / Zおよび老化G / Zで治療された頬粘膜に組織病理学的変化が観察されなかったことを示しています。

老化したG / Zで治療された粘膜の病理学的検査（ a ）およびエージングされていないG / Z（ b ）

ディスカッション

金属イオンの放出が広く議論されているため、金属セラミック材料はますます金属を含まない材料に取って代わられている。歯科補綴物の銀[14]、金[15]、チタン[16]、ニッケル[17]を含むさまざまな金属イオンが、唾液と血漿に放出される可能性があります。 McGinley etal。歯科用Ni-Cr合金から拡散したNiイオンが上皮組織全体から基底膜まで広がり、続いて細胞外マトリックス全体に広がり、細胞の生存率と組織の完全性が失われる可能性があるとさえ報告されています[18]。現在の研究は、主にすべてのセラミック材料の開発と改善に焦点を当てています。そのため、ジルコニアベースの材料の成功率を向上させるために、以前の研究[4]でG / Zが導入されました。ただし、老化を考慮したG / Zシステムの生体適合性は不明でした。生体適合性テストと適度なコントロールが不可欠です。その結果、一連の生体適合性テストが実施され、ゴールドスタンダードと比較されました。 、Y-TZP、経年変化を考慮。さらに、表面トポグラフィーならびに物理的および化学的特性は、研究によって細胞接着および生存率に影響を与えることが証明されています[19]。したがって、すべての試験片をサンドブラストし、臨床表面粗さまで研磨しました。

老化したG / ZおよびY-TZP処理細胞の有意な代謝低下が72時間で観察され（図2a）、老化がG / ZおよびY-TZPの細胞増殖を減少させることを証明しています。ジルコニア材料の生体適合性に対する加齢の影響については議論の余地があります。以前の研究では、加齢後のジルコニアの生体適合性の低下が報告されています[20]。一方、最近の研究では、老化したジルコニアの生体適合性の増加が証明されました[21]。生体適合性に対する加齢の異なる影響は、サイクル、温度、負荷、頻度などの異なる加齢手順に起因する可能性があります[22]。ジルコニアの物理的および化学的特性の変化に対する老化の影響は、ジルコニアの分解に対する老化手順の積極性に依存します。長期の口腔内状態をシミュレートするために、この研究で使用された老化手順は、咬合負荷と頻度、湿度の高い環境の使用、人体の温度などの臨床パラメーターに基づいていました[22]。

細胞の生存率はミトコンドリアの活動に依存しています。細胞増殖の減少とROS産生の増加は、上皮組織全体から基底膜まで、続いて細胞外マトリックス全体に拡散したイオンが広がり、細胞の生存率と組織の完全性が失われることに起因する可能性があります[6、23]。

G / ZとY-TZPの両方の細胞接着率は、老化後に増加しました（図2c）。老化前後のY-TZPとG / Zの細胞接着の特徴的な写真を図3a–dに示します。 G / Zでの細胞接着の正確な観察を行った。二重標識蛍光染色（図4a、b）およびSEMビュー（図5a、b）は、老化および非老化G / Zの両方で培養された細胞が平坦化され、十分に広がっていることを示しました。

細胞接着は、生体材料の物理化学的特性に依存します。移動と付着は、必ずしも直接関連しているわけではない生物学的パラメーターであることはよく知られています。細胞は非常に高い接着力でゆっくりと移動することができます[24、25]。 Al Qahtani etal。 [26]はまた、Y-TZPのサンドブラスト表面は、Saos-2骨芽細胞とインキュベートした場合、細胞接着は高いが細胞増殖は低いことを報告しました。表面の湿潤性は、表面に吸着されるタンパク質の量を調節することにより、細胞接着の優先度を決定する要因でもあります[27]。超親水性表面の細胞は、接着が完了するとすぐに増殖を開始することが報告されており、この現象は、親水性表面に吸着された大量のタンパク質と密接に関連していました[28]。 G / ZおよびY-TZPの経年劣化により、粗い表面に強い湿潤性がもたらされ、細胞の強力な接着が可能になります。このタイプの表面は、歯科用アバットメント表面の周囲の歯肉接着に最適です。対照的に、滑らかな表面は、口の敗血症環境でのバイオフィルム形成を防ぐように設計された表面に適切なように、材料に制限された接着特性を与えます[29]。したがって、歯科補綴物の材料として、G / ZおよびY-TZPの経年劣化により、バイオフィルム形成の可能性が高まりました。 G / ZとY-TZPの細胞接着率は、老化の前後で有意差を示しませんでした（図2c）。この発見は、G / ZとY-TZPが老化の前後で同様の細胞接着特性を示すことを証明し、G / Zの有望な表面生物学的特性を示しています。

インビボ刺激試験は、経口医療機器の長期適用にとって重要です。ここでは、G / Zで治療した粘膜の肉眼的または顕微鏡的な病理学的変化は観察されませんでした（図6a、b）。

大量の m の存在 -ZrO ₂ ジルコニアの強度が低下する可能性があります。 G / Zシステムの信頼できる生体適合性は、浸透手順中の小さな位相変化に起因する可能性があります。これは、以前の研究で証明されています[4]。別の研究では、浸透したY-TZP材料の適度な耐老化性が証明されました。猪子他[30]はAl ₂ O ₃ -浸透したY-TZPは、大量のc-ZrO ₂ のおかげで、エージング後も熱水的に安定していました。 Y-TZPと比較して初期単斜晶体積分率が高いものの、中間層表面での相。

いくつかの研究により、ガラス-ジルコニア組成物の信頼できる生体適合性が確認されました。 L-929線維芽細胞およびSaos-2骨芽細胞様細胞は、HAp-Al ₂ の表面で良好な接着と増殖を示しました。 O ₃ -ZrO ₂ （FGM）、FGMの良好な生体適合性を示します[31]。ガラス（Na ₂ O-SiO ₂ -B ₂ O ₃ -CaO）-Hap-ZrO ₂ 犬の脚の骨に3か月間移植した後、インプラント材料はチタンインプラント材料よりも骨との結合が良好でした[32]。 Li etal。ガラスジルコニア材料は良好な生物活性を示し、細胞毒性はないと報告されています[33]。ごく最近の研究では、有望な機械的特性と審美性を備えた高密度の段階的ガラス-ジルコニア組成が報告されています[10、11、34]。ただし、段階的なガラス-ジルコニア組成の生体適合性は報告されていません。

結論

細胞生存率、細胞接着、細胞形態、および酸化ストレス応答の分析と組み合わせた口腔粘膜刺激性試験によると、G / Zの生体適合性は老化前後のY-TZPの生体適合性に匹敵します。歯科補綴物として、G / Zは臨床応用において有望な未来を示しています。ただし、この研究は予備的な報告であり、現在の結果を確認するには、より包括的な試験方法を用いたさらにinvivoおよびinvitroの研究が必要です。

略語

DAPI：

4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩

F-アクチン：

フィラメント状アクチン

FGM：

HAp-Al ₂ O ₃ -ZrO ₂

G / Z：

段階的ナノガラス/ジルコニア

SEM：

走査型電子顕微鏡

t-m：

正方晶から単斜晶

Y-TZP：

イットリウム安定化正方晶ジルコニア多結晶