経年変化後のグレードナノガラス/ジルコニア歯科材料の生体適合性

概要

要旨

ナノガラスをナノジルコニア表面に浸透させることで、グレードナノガラス/ジルコニア（G/Z）システムを作製し、コア-ベニア結合強度を向上させた。イットリウム安定化四方晶ジルコニア多結晶体（Y-TZP）では経年変化が重大な懸念事項であるため、臨床応用前にG/Zシステムの生体適合性に対する経年変化の影響を評価することが不可欠である。ヒト歯肉線維芽細胞（HGF）を未経年および経年G/ZおよびY-TZP試料に播種し、2-72時間培養した。試験には口腔粘膜刺激性、細胞生存率、接着性、酸化ストレスが含まれた。代謝活性は経年G/ZとY-TZPで72時間後に有意に低下した（P < 0.00001）。全時間点において、経年前後を問わずG/ZとY-TZPの生存率に有意差は認められなかった。活性酸素種（ROS）産生は経年G/ZとY-TZPで72時間後に増加したが、差は有意ではなかった（P > 0.05）。接着率は経年後に両材料で上昇したが、G/ZとY-TZPで同等であった（P > 0.05）。経年および未経年G/Zの肉眼的・顕微鏡的刺激スコアはともに0であり、刺激性がないことを示した。

結論

G/Zシステムは優れた生体適合性を示し、将来の臨床応用に期待が持てる。

背景

歯科用ジルコニアセラミックス、特に3モル%イットリウム安定化四方晶ジルコニア多結晶体（3Y-TZP）は、変形強靭化メカニズムにより高い強度と破壊抵抗性を持つため、補綴装置に広く用いられている[1]。しかし、ジルコニアコアに施すベニアポーセレンは、コアとベニアの熱膨張係数と弾性率のミスマッチにより、チッピングや剥離で失敗することが多い[2-4]。この問題に対処するため、我々は以前、低弾性率ナノガラスを焼結ナノジルコニア表面に浸透させるグレードナノガラス/ジルコニア（G/Z）システムを導入し、従来システムの3倍の結合強度を達成した[4]。

Y-TZPの経年変化は湿度、機械的負荷、低温によって引き起こされ、表面粗化、微細亀裂、四方晶-単斜晶（t-m）相変態を誘発し、機械的特性を損なう可能性がある[5-9]。表面化学と粗さが生体適合性に影響するため、経年変化がG/Zシステムの生体組織との相互作用にどう影響するかを評価することが重要である。

Zhangらによる先行研究でガラス浸透ジルコニア複合材料の機械的利点が示された[10, 11]が、このグレード複合材料の生体適合性、特に経年後については不明であった。本研究では、G/Zを臨床的に受け入れられているY-TZPと比較し、経年前後で細胞生存率、形態、接着性、酸化ストレス、粘膜刺激性を評価することで、このギャップを埋める。

方法

試料の調製

臨床使用承認済みのY-TZP試料を対照とした。すべての試料はISO 13356規格に従った均一なプレート（1.5 × 1.5 × 0.2 cm）で、研磨済み表面を持つ。

G/Z試料の調製

ガラス粉末をEmaxグラインダーでナノメートルサイズに粉砕した。浸透ガラスの組成は表1に詳述[4]。Y-ジルコニア粉末（5.18 wt% Y₂O₃、TZ-3Y-Eグレード、東ソー）を150 MPaで2分間単軸プレスし、1350℃で2時間部分焼結し、200メッシュまでボールミルした。基板試料を1200℃で2時間予備焼結し多孔質ネットワークを形成した。溶融ガラススラリーを上面に塗布し、1350℃で2時間浸透させ、同時に浸透と致密化を達成した。

Y-TZP試料の調製

Y-TZPブランクをCAD/CAMシステム（Zenostar、Weiland Dental）で削り出し、全密度で焼結した。

細胞培養

HGFを、10%胎児牛血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1% L-グルタミン、1%非必須アミノ酸を添加したDMEM/F-12培地で、37℃、5% CO₂条件下で培養した。培地は3日ごとに交換した。細胞をPBSとトリプシン-EDTAで剥離し、すべてのアッセイで1 × 10⁵ cells/mLの密度で各基板に播種した。

経年処理

機械的経年処理で咀嚼条件を模擬：試料を37℃の人工唾液中に置き、80 Nの三点曲げ負荷を2 Hzで10⁵サイクル印加した（プロトコル[12, 13]に従う）。

細胞生存率

生存率を2、24、48、72時間でアラマーブルー試験（DMEM中10%）で評価した。インキュベーション後、500 μLの染料を加え、4時間インキュベートし、蛍光を測定（励起530 nm、放射580 nm、Synergy H4マイクロプレート分光光度計、BioTek）。実験は3ラン×3反復で実施。生存率（%）＝（処理ウェル吸光度）／（対照ウェル吸光度）。

酸化ストレス

反応性酸素種（ROS）レベルを、反応性酸素種アッセイキット（名古屋慈恵会医科大学生物工学研究所）を用いた化学発光法で定量した。

細胞接着

HGFを経年前後の試料表面で2時間培養した。固定後、核をDAPI（Yeasen）で染色し、Carl Zeiss LSM 510倒立蛍光顕微鏡で撮影した。接着率を、×200倍率で5視野（450 μm × 450 μm）のランダム視野における接着細胞数/播種総細胞数として算出した。

細胞形態

2時間インキュベーション後、G/Z表面上の細胞を固定し、ロダミンファロイジン（1:100、3% BSA）でF-アクチンを染色した。Zeiss LSM 510で撮影。形態はSEM（Philips XL-30 ESEM）でも観察した。試料をガラスカバースリップにマウントし、DAPIで対抗染色した。

口腔粘膜刺激性試験

ウィスターラット雄10匹に、片側頬粘膜に経年G/Z、反対側に未経年G/Zを埋入（YY/T 0127.13-2009準拠）。2週間後、肉眼的に頬粘膜を検査し、頬粘膜をH&E染色で組織学的に検査した。刺激指数を対照スコアから試験スコアを引いて算出した。

統計解析

生存率、酸化ストレス、接着性のプールデータを一元配置分散分析（SPSS 22.0）で評価。有意水準はP < 0.05とした。

結果

グレード層構造

グレード層厚は平均0.9-1.0 mm。SEM画像（図1a, b）は、残留ガラス、ガラス被覆ジルコニア粒子、粒界ボイドからなる表面を示し、これらは強力なコア-ベニア接着を促進する特徴である。EDSマッピング（図1c）は、深部に向かってZr濃度が増加し、Si、Al、Laが減少する勾配を示し、意図した組成勾配を確認した[4]。

G/Zの物理化学的特性。a 構造図。b SEM画像。c 機能的グレード層のEDS分析

細胞生存率

代謝活性は経年G/ZとY-TZPで72時間時に有意に低下した（P < 0.00001）（図2a）。2、24、48時間ではいずれの材料でも有意な低下は見られなかった。G/ZとY-TZPの生存率は、経年前後を問わず全時間点で有意差がなかった（P > 0.05）。データは図2aにまとめた。

経年前後のG/ZとY-TZPの生体適合性。データは平均±SD、n=5を示す。a 経年および未経年試料処理HGFの細胞生存率。b ROS産生。c 細胞接着率。対照群との有意差：^#P < 0.01；^*P < 0.05

酸化ストレス

経年G/ZとY-TZPで72時間時にROSが有意に上昇した（P < 0.00001）。早期時点では有意差なし（P > 0.05）。G/ZとY-TZPは、経年前後を通じて同等のROSレベルを示した（P > 0.05）。

細胞接着

接着率は経年後にG/ZとY-TZPの両方で上昇した（図2c）。経年前後を問わず、両材料間に有意差はなかった（P > 0.05）。経年前後のY-TZPとG/Zへの細胞接着代表画像を図3に示す。

経年前後のG/ZとY-TZPへの細胞接着。a 経年G/Z。b 未経年G/Z。c 経年Y-TZP。d 未経年Y-TZP

細胞形態

蛍光イメージングにより、細胞が経年および未経年G/Zの両方に接着し、経年表面でより伸展・扁平化が促進されることが明らかになった（図4a-c）。SEMでは、両表面でよく伸展した多角形細胞と広範な微絨毛が確認された（図5a, b）。

経年前後のG/Z上でのHGFの接着、伸展、形態（蛍光顕微鏡観察）。a, b 経年G/Z。c 未経年G/Z。基板上で72時間培養後、フィラメント状アクチン（F-アクチン、赤）と核（青）で染色固定

経年前後のG/Z上でのHGF形態のSEM像（培養72時間後）。a 経年G/Z。b 未経年G/Z。元倍率：×2000

口腔粘膜刺激性試験

経年および未経年G/Zの肉眼的・顕微鏡的刺激スコアはともに0であり、刺激性なしを示した。組織病理学的にも粘膜変化なしを確認（図6a, b）。

経年G/Z（a）および未経年G/Z（b）で処理した粘膜の病理検査

考察

金属セラミック合金は、金属イオン溶出への懸念からメタルフリー代替材へ移行しつつある[14-18]。セラミック改良研究が多い中、G/Zシステムは金属成分を追加せずにジルコニアの性能を高める有望なアプローチを提供する。本研究は、G/Zが経年後もY-TZPと同等の生体適合性を維持することを実証した。これは現実的な口腔環境を模擬した条件下での結果である。

経年変化により、両材料で72時間時の細胞増殖が低下した。これは経年後に生体適合性が低下するとの報告[20]と一致し、改善するとの報告[21]とは対照的である。この差異は経年プロトコルの違いに起因する可能性が高い。我々のプロトコル（80 N負荷、2 Hz、10⁵サイクル、37℃人工唾液中）は臨床的咬合力と温度を模倣しており、経年効果の現実的な評価を提供する[22]。

観察された生存率低下とROS上昇は、イオン拡散とt-m変態による局所応力が細胞完全性を損なうことを反映している可能性がある[6, 23]。

興味深いことに、経年変化は両材料の接着性を向上させたが、相対的接着率は変わらなかった。経年後に粗化・親水化した表面がタンパク質吸着を促進し、細胞接着を改善したと考えられる[27-29]。同等の接着性は、G/Zの表面特性が経年後も好ましいままであることを示唆する。

インビボ刺激性試験では組織学的変化がなく、G/Zの粘膜接触における安全性を支持する。浸透時に導入される少量の単斜晶相は、Al₂O₃浸透Y-TZPに関する先行研究[30]で示されたように、機械的完全性を保ちながら生体適合性を維持する可能性がある。

他のガラス-ジルコニア複合材料もインビトロおよびインビボで良好な生体適合性とバイオアクティビティを示している[31-33]。本知見は、グレードナノガラス/ジルコニアシステムへのエビデンスを拡張し、機械的強度、審美性、生物学的安全性を両立する材料を提供する。

結論

細胞生存率、接着性、形態、酸化ストレス、粘膜刺激性を含む生体適合性評価により、G/Zは経年前後でY-TZPと同等の性能を示した。これらの結果は、G/Zを歯科補綴材料の有力候補として位置づける。これらの予備的知見を確認するため、さらなる包括的なインビトロおよびインビボ研究が必要である。

略語

DAPI:

4',6-ジアミジノ-2-フェニルインジールジヒドロクロリド

F-アクチン:

フィラメント状アクチン

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

グレードナノガラス/ジルコニア

SEM:

走査型電子顕微鏡

t-m:

四方晶から単斜晶

Y-TZP:

イットリウム安定化四方晶ジルコニア多結晶体