潜在的な創傷治癒用途のためのエレクトロスピニングされたキトサン-ポリエチレンオキシド/フィブリノーゲンバイオコンポジットの開発

背景

創傷管理の分野で多くの進歩があったにもかかわらず、治癒過程を強化する能力を備えた生物活性包帯はほとんど商品化されていない。この成功した製品の欠如は、多数の可溶性メディエーター、血球、実質細胞、および細胞外マトリックス（ECM）成分を含む創傷治癒プロセスの複雑さに起因する可能性があります。成長因子は、細胞の増殖、移動、および分化を促進することにより、創傷治癒プロセスにおいて中心的な役割を果たします。しかし、体内での急速な排泄と短い半減期[1,2,3]は、治癒と組織再生を促進するための成長因子療法の臨床的採用を制限してきました[4,5]。現在、治療効果（例えば、細胞の動員および分化）を達成するために、成長因子の反復的なインビボ投与が必要である。持続的で局所的な成長因子の送達が可能な創傷被覆材の開発は、治療結果を大幅に改善し、臨床的採用を加速するでしょう。

血小板由来成長因子（PDGF）は、創傷治癒のイニシエーターおよびメディエーターとして重要な役割を果たします。好中球、単球、線維芽細胞の走化性物質として作用し[6]、マトリックス沈着の調節を助けます。さらに、PDGFは線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を阻害する可能性があり、これは創傷の収縮に影響を与え、瘢痕形成を減少させる可能性があります[6]。 Regranex®のブランド名で販売されているPDGFは、現在FDAによって承認されている唯一の成長因子であり、下肢の糖尿病性潰瘍の治療を目的としています。 Regranex®ゲル（2.2μg/ cm ² ）の1日1回の局所塗布 潰瘍の）は、最小限の副作用で30％速い治癒時間をもたらすことが示されています。ただし、Regranex®の毎日の局所塗布と除去は不便であり、患者の生活の質に悪影響を与える可能性があります。

エレクトロスピニングは、生物学的に重要なポリマーを使用した生体模倣ナノファイバー足場の製造における注目すべき技術として確立されています。多数の生分解性合成（例：ポリカプロラクトン）および天然ポリマー（例：コラーゲン）が不織布ナノファイバー足場にエレクトロスピニングされ、高い表面積対体積比と多孔性特性を示します。これは、ドラッグデリバリーや創傷被覆材の用途に重要です。天然に存在するポリマー（コラーゲン、エラスチン、フィブリノーゲンなど）は、その生物活性、生体適合性、およびPDGFなどの特定の成長因子に結合する独自の能力により、特に魅力的な創傷被覆材です。 340 kDaの球状血漿タンパク質であるフィブリノーゲン（Fb）は、組織の修復と再生のための一時的なマトリックスとして機能する活性化型のフィブリンを介して、血餅形成に主要な役割を果たします。 Fbとフィブリンの欠如は、創傷治癒の欠陥と相関しています[7]。 Fbベースの製品は、生分解性、非免疫原性、および細胞遊走促進を示し、以前はヒドロゲル[8、9、10]および湿式押出ケーブル[11、12]として開発されました。ただし、これらの材料の物理的および構造的特性は、それらの臨床採用を制限しています。ヒドロゲルは、長期間使用するための構造的および機械的完全性を欠いており、湿式押出繊維は、ネイティブECM（200〜500 nm）よりも指数関数的に大きい直径サイズ（200〜250μm）を示します。 Wnek etal。ただし、エレクトロスピニングは、自然のECM構造に非常によく似たFb足場を製造する機能を提供することを実証しました[13]。得られたナノファイバーは、ヒドロゲルよりも改善された機械的特性を示しましたが、その構造は、創傷被覆材の用途に最適な機械的特性をまだ欠いていました[14]。

エレクトロスピニングされたフィブリノーゲン足場の機械的特性を改善するために、追加のポリマーを導入してナノファイバーを強化することができます[15]。具体的には、キトサン（CS）、 N -キチンの脱アセチル化誘導体は、創傷被覆材の用途で望ましい抗菌特性を生み出すことが示されています[16、17]。 CSは、強力な抗菌剤であることに加えて、骨再生誘導法[18、19]、経皮薬物送達[20]、幹細胞分化[21]、止血鉗子[22]などのさまざまな生物医学的用途にエレクトロスピニングされています。キトサンはポリカチオン性であるため、一般的な溶媒を使用したエレクトロスピニングには大きな困難があります。これらの困難を克服し、電気紡糸性を改善するために、CSはポリ（ビニルピロリドン）[23]、ポリ（エチレンオキシド）（PEO）[16]、およびポリ（ビニルアルコール）[24]などの他のさまざまなポリマーと混合されています。同様に、CSのポリカチオン性は、強力な静電相互作用のために、Fbとの単一の足場への組み合わせの成功を制限しています。この作業では、この制限は、用途の広いデュアルノズルエレクトロスピニングシステムを利用することで克服されました。得られたナノファイバー足場は、さまざまな物理化学的特性を使用して分析されました。新規の組み合わせCS-Fbナノファイバー足場は、PDGFを送達でき、創傷治癒に必要な線維芽細胞の移動に影響を与えるのに効果的である可能性がある、生物活性および生体模倣創傷被覆材の実行可能な候補を提示すると仮定しました。

メソッド

資料

酢酸（氷酢酸、≥99.85％）、CS（低分子量、75〜85％脱アセチル化）、PEO（MW 300,000 g / mol）、Fb（タイプIS、65〜85％タンパク質）、1,1,1 3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）、およびウシ血清アルブミン（BSA、≥96％）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、EMD Millipore（Billerica、MA、USA）から購入しました。ヒト皮膚線維芽細胞（PCS-201-012）および細胞培養試薬は、American Type Culture Collection（Manassas、VA、USA）から購入しました。キャリアフリーの組換えヒト血小板由来成長因子-BB（rhPDGF-BB）は、PeproTech（Rocky Hill、NJ、USA）から購入しました。すべての試薬は試薬グレードであり、さらに精製または変更することなく使用されました。

エレクトロスピニングされたキトサン-ポリエチレンオキシド/フィブリノーゲン複合足場の調製

キトサン-PEO原液は、CSとPEOをBSA（0.5％ v ）を含む1％酢酸に溶解して作成しました。 / v ）およびDMSO（10％ v / v ）CSとPEOの質量比が2：1で、総ポリマー含有量が5.5 wt。％になるようにします。以前に記載されたように[16]、CSをエレクトロスピニングする能力を改善するためにポリエチレンオキシドが添加された。フィブリノーゲンストック溶液（110 mg / mL）は、Fbを1部の10×イーグル最小必須培地（EMEM）と9部のHFIPに溶解して作成しました。 CS-PEOおよびFbストック溶液を完全に溶解するまで室温で撹拌しました。ロードされた足場の場合、エレクトロスピニングの直前にPDGFを各ポリマー溶液に混合しました。エレクトロスピニングされたCS-PEO / Fb複合ナノファイバー足場は、マルチノズルエレクトロスピニングシステムを使用して製造されました（図1）。溶液は個別にロードされ、18ゲージの紡糸口金とNE-1000シリンジポンプ（New Era Pump Systems、ニューヨーク州ファーミングデール）に接続された使い捨てシリンジを使用して、0.7および1.0 mL h <の流量でシステムに機械的にポンプで送られました。 sup> -1 それぞれCS-PEOとFbの場合。 25 RPMで回転するマンドレルコレクターは、CS-PEOの場合は22 cm、Fbの場合は12.5cmの距離で紡糸口金の先端の間に配置されました。製造プロセス中に、CS-PEOおよびFbポリマー溶液の紡糸口金チップにそれぞれ28および22kVのDC電圧が印加されました。製造されたナノファイバー足場は、生物学的アッセイのために18 cmのガラスカバースリップ上に収集されるか、透過性と引張強度の分析のためにマンドレルから直接切り取られました。すべてのエレクトロスピニング実験は、室温および相対湿度35〜45％で3時間実施されました。 PDGFを含むサンプルはデシケーター内で-20°Cで保存され、アンロードされた足場は製造後、室温でデシケーター内に保存されました。

デュアルスピナレットエレクトロスピナーの概略図

ナノファイバーの形態と直径

電気紡糸されたナノファイバー足場を金でスパッタコーティングし、電界放出走査型電子顕微鏡（FESEM）（Zeiss Sigma VP-40、ドイツ）を使用して観察した。足場ごとに20枚の顕微鏡写真を撮り、製剤ごとに3つの個別に回転させた足場を分析しました。平均ナノファイバー直径は、ImageJ（NIH、メリーランド州ベセスダ）を使用して顕微鏡写真ごとに5つのランダムな点を測定することによって計算されました。足場の処方ごとに合計100回の測定が行われました。

表面化学の特性評価

飛行時間型イオン質量分析（ToF-SIMS）を使用して、足場の表面化学とポリマー成分の寄与を分析しました。 ToF-SIMSは、高エネルギーのBi ₃ を照射することにより、材料の最上部のナノメートル層の化学組成を評価する、高感度で詳細な表面分析手法です。 ²⁺ 超高真空下のクラスター[25、26]。次に、材料表面から放出された二次イオンフラグメントは、それらの原子質量電荷比（m / z）に基づいて分析され、全体的な表面化学組成を推測するために使用されます。

ToF-SIMS分析は、ビスマス液体金属イオンガン（30 kV）を備えたToF-SIMS IV（Ion-ToF GmBH、ドイツ）を使用して、Evans Analytics Group（EAG、カリフォルニア州サニーベール）によって実行されました。機器は、各サンプルから3つの正および負のイオンスペクトルを取得するイオンマイクロプローブモードで操作しました。選択した正および負のイオンを50×50μmのラスター領域に2048×2048ピクセルの画像解像度でマッピングして、足場のポリマー成分のマッピングを提供しました。各二次イオンのカウントを記録されたイオンの総数で割って10,000を掛けたものとして定義される正規化された強度が、各フラグメントについて報告されました。独立して製造された6つのサンプルの表面上の3つの異なる場所の平均を分析しました（ n =6）。 ToF-SIMによって分析されたCS-PEOおよびFbポリマーの分布は、足場全体を代表するものでした。

CS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFb足場の水接触角は、米国材料試験基準（ASTM）D7334-08に従って決定されました。ナノファイバー足場をガラスカバースリップ上にエレクトロスピニングした。蒸留水（2μL）の1滴を足場の表面に塗布し、KrüssDSA10MK2 Drop Shape Analyzer（Krüss、ハンブルク、ドイツ）を使用して30秒以内に接触角を測定しました。各サンプルの異なる場所で測定を3回繰り返し、平均接触角を計算しました。 6つの独立したエレクトロスピニングされた足場が分析されました（ n =6）。

機械的一軸引張強度

エレクトロスピニングされた足場の機械的特性は、1 mm min ^-1 のひずみ速度で250Nロードセルを備えたInstron®E3000ElectroPuls（Instron、マサチューセッツ州カントン）を使用して室温で測定されました。 。サンプルの厚さは、Keyence 3Dレーザー走査顕微鏡VK-200（Keyence、イリノイ州アイタスカ）によって6つのランダムな位置で測定されました。引張試験に使用した足場の厚さは93.8±7.4μmでした。試験前に、足場を40×25mmの長方形の試験片に切断しました。得られたデータは、応力-ひずみ曲線として報告およびプロットされました。引張応力は、試験片の断面積に対する力の比率として定義され、ひずみは、元の長さに対する長さの変化として定義されました。ヤング率、引張応力、および破断時のひずみの計算は、配合ごとに平均10個のサンプルの応力-ひずみ曲線から得られました。

水蒸気移動率

CS-PEO / Fb足場の水蒸気移動速度は、ASTM E96 / E96M乾燥剤法に従って測定されました。製剤ごとに合計6つの独立したエレクトロスピニング標本を調製し、室温および相対平均湿度58.2±5.2％で再利用可能なシリカゲル乾燥剤を含む試験容器の開口部に配置しました。水蒸気透過度（WVTR）は、48時間にわたってさまざまな時点で測定されたテストコンテナの重量から計算されました。

ここで G テストコンテナの重量の変化を表します t は経過時間であり、 A は足場の断面積です。

インビトロ細胞生存率

足場の間接的な細胞毒性は、ISO10993-5標準試験法[27、28]から採用されたアプローチに基づいて評価されました。ヒト皮膚線維芽細胞は37°C、5％CO ₂ で培養されました 無血清線維芽細胞培地で、3日ごとに更新します。細胞がコンフルエンスに達したら、トリプシン処理して12ウェルプレートに播種しました（10,000細胞/ mL）。翌日、培地が補充され、ナノファイバー足場が導入されました。細胞増殖は、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-（2,4-ジスルホフェニル）-2H-テトラゾリウムナトリウム（WST-1）細胞増殖アッセイを使用して120時間にわたって監視されました。

線維芽細胞の視覚化

ヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン処理し、CS-PEO、Fb、およびCS-PEO / Fb足場に播種しました。 37°Cおよび5％CO ₂ で24時間インキュベーションした後 、細胞を洗浄し、LIVE / DEAD™細胞生存率キット（ThermoFisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）でメーカーの仕様に従って染色しました。さらに、ファロイジン-Atto 565（SigmaAldrichおよび4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI; ThermoFisher Scientific）を製造元の仕様に従って染色することにより、ヒト線維芽細胞の足場への接着および付着を評価しました。画像を観察し、倒立共焦点顕微鏡（Nikon C1、C1EZ、Melville、NY、USA）を使用して撮影。

インビトロ分解

CS-PEO / Fbナノファイバー足場の分解は、線維芽細胞基本培地（FBM、ATCC）で、37°C​​および5％CO ₂ で実施されました。 。足場をFBMに浸し、1、6、24、または48時間インキュベートしました。各足場の初期乾燥重量を記録した。各時点で、足場を洗浄し、凍結乾燥し、再度秤量した。足場の劣化は次の式から計算されました：

ここで W ₀ は足場の初期重量であり、 W _t は、それぞれの時点での足場の重量です。

PDGFのリリースと検出

インビトロ分解実験中の特定の時点から収集された溶出液を、rhPDGF-BB特異的ELISAキット（R＆Dシステム、ミネソタ州ミネアポリス）を使用してアッセイした。検出された吸光度の値は、PDGF濃度を決定するための製造元の指示に従って、標準と比較されました。検出されたPDGFの量は、使用された対応する足場の重量（mg）に正規化されました。

血小板由来成長因子の放出の移動特性

ヒト皮膚線維芽細胞の遊走は、PDGFの生物活性を評価するためにORIS™細胞遊走アッセイキット（Platypus Technologies、ウィスコンシン州マディソン）を使用して評価されました。簡単に説明すると、マイトマイシンC（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）で処理した線維芽細胞をトリプシン処理し、メーカーが提供するストッパーを含む96ウェルプレートに播種し、37°でインキュベートしました。 Cおよび5％CO ₂ 一晩。翌日、ストッパーを取り外して移動ゾーンを作成し、そこにさまざまな時点で収集した100μLの溶出液を追加してさらに24時間インキュベートしました。作りたての50ng mL ^-1 PDGFおよび基底線維芽細胞培地をそれぞれ陽性および陰性対照として使用した。線維芽細胞の遊走は、50 ng mL ^-1 によって誘発された遊走と比較して、倍数変化として表されました。 PDGF治療。研究は、3つの負荷濃度（2、4、および8μg/ mL）の3つの独立した実験で3回実施されました。

統計分析

連続データは、平均値±標準偏差として表されました。グループ平均間の差異は、一元配置分散分析（ANOVA）を使用して分析されました。テューキーの多重比較検定を使用して、平均のグループの中でどの平均が統計的に異なるかを判断しました。統計的有意性はαに設定されました =0.05。すべてのデータは、GraphPad Prism（サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して分析されました。

結果と考察

さまざまなポリマーの組み合わせにより、得られる複合材料の特性が大幅に向上することが示されています[29、30]。組み合わせポリマーシステムは、足場の強度、柔軟性、生分解、および薬物放出動態の調節を効果的に可能にします。これらは、創傷被覆材の用途にとって重要なパラメーターです。ただし、独自の複合材料の作成は、構成ポリマー間の固有の化学的相互作用によって制限される可能性があります。たとえば、負に帯電したFbと正に帯電したCSを混合すると、ポリマー沈殿物が形成されることが観察されました。この観察結果は、さまざまな溶媒条件下で強い静電相互作用を持つ分子について十分に文書化されています[31、32、33]。その結果、CS-Fbポリマー複合足場の製造には、前述のように、二重押出エレクトロスピニング技術の使用が必要でした[34]。

CS-PEO / Fbナノファイバーの形態

CS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFbスキャフォールドの平均繊維径は、それぞれ269.9±68.4、202.3±113.2、および351.1±101.7 nmでした（図2）。興味深いことに、CS-PEO / Fb複合足場は、CS-PEOまたはFb足場よりも細いナノファイバーを示しました。繊維径サイズの減少は、同時に帯電したポリマージェットによって生成される追加の静電力が原因である可能性があります[35、36、37]。したがって、これらの力によって引き起こされるポリマージェットの互いに離れる反発は、紡糸口金間の距離と堆積時間の両方を増加させる可能性がある。結果として生じる堆積時間の延長は、繊維の伸びとより細い繊維の形成を引き起こすことが知られている曲げ不安定性の増加と相関しています。

エレクトロスピニングされた足場の代表的なFESEM顕微鏡写真。 a CS-PEO、平均直径269.9±68.4nm。 b CS-PEO / Fb、平均直径202.3±113.2nm。 c Fb、平均直径351.1±101.7 nm（ n =100）

ToF-SIMSと水接触角による表面化学の特性評価

CS、Fb、およびPEOスキャフォールドからのToF-SIMSスペクトルを図3に示します。通常、固有の化学指紋種を使用して、個々のポリマー成分を区別できます。ただし、CSとFbの化学的類似性により、窒素含有種が多数ありました（C ₃ H ₆ いいえ ⁺ 、CH ₄ N ⁺ 、CN ⁻ 、およびCNO ⁻ ）両方のスペクトルに存在するため、ポリマーを互いに区別することが困難になります。ただし、Fbが足場に組み込まれた場合、CN ^- の総数 およびCNO ⁻ 種は増加しましたが、他の断片は変化しないか減少しました。したがって、CN ^- の変化を調べる およびCNO ⁻ Fbの間接的な検出を可能にするフラグメント強度。同様に、C ₂ の増加 H ₅ O ⁺ （45 m / z）イオンを使用して、複合足場内のPEOのエチレンオキシドフラグメントを特定しました。

代表者 a ポジティブで b 自然のままのCS（上）、Fb（中央）、およびPEO（下）の負イオンToF-SIMSスペクトル。丸で囲んだイオンフラグメントを、化合物を識別するための一意のフィンガープリントとして使用しました

複合足場内のFb成分の存在と分布を解明するために、CNO ^- およびCN ⁻ イオンは、ヒートマップを取得するために、元のスキャフォールドと複合スキャフォールドの50×50μmラスター上にマッピングされました（図4a、b）。同じマッピング手法がC ₂ で実行されました H ₅ O ⁺ PEO分布を決定します（図4c）。ヒートマップ強度の増加は、FbまたはPEOのポリマー含有量の増加と相関していました。 CNO ^- の強度を観察しました 、CN ⁻ 、およびC ₂ H ₅ O ⁺ 複合足場の50×50μmラスター領域全体に均一に分布していました。足場の厚さ（93.8±7.4μm）と層ごとの繊維の堆積により、表面組成は足場全体を代表するものと予想されます。したがって、ToF-SIMデータは、CS-PEO / Fbナノファイバー足場がデュアルスピナレットエレクトロスピニングを使用して製造される場合、個々のコンポーネントが複合足場全体に均一に堆積することを示唆しています。

a のToF-SIMSマッピング CNO ⁻ 、 b CN ⁻ 、および c C ₂ H ₅ O ⁺ 50×50μmラスター領域にわたるさまざまな足場上のイオンフラグメント

エレクトロスピニングされたCS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFb繊維状足場の水接触角は、それぞれ44.2°±5.1°、61.4°±7.6°、および115.7°±16.2°であると決定されました（図5）。水接触角に基づくと、CS-PEOおよびCS-PEO / Fb足場は親水性（> 90°）でしたが、Fb足場は疎水性（<90°）でした。 CS-PEO / Fb複合足場の水接触角は、そのコンポーネントの表面特性の間にある表面特性を示しました。これは、CS-PEOとFbが製造中に均一に堆積したことを示唆しています。ポリマー表面の表面特性は、タンパク質と接着因子の沈着に重要な役割を果たします。具体的には、重要な細菌付着因子が疎水性表面でより容易に発生することが知られており、細菌のコロニー形成を促進します[38]。そのため、CS-PEO / Fbの親水性は、細菌の付着を阻止するのに役立つ可能性があります。

ガラス基板、CS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFb足場の表面での脱イオン水の挙動

CS-PEO / Fb足場の機械的一軸引張強度

一軸引張試験は、平均厚さが93.8±7.4μmのナノファイバー足場で実施されました。結果の要約を表1に示し、対応する応力-ひずみ曲線を図6に示します。一般に、複合材料の機械的特性は、その最も弱い成分と相関しています。結果は、Fbのみの足場は創傷被覆材の用途に理想的な機械的特性を持たないことを示唆しています。これは、より機械的に安定した製品を得るためにCS-PEOを組み込むことの重要性を強調しています。

CS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFbスキャフォールドの応力-ひずみ曲線。データは、独立して作成された10個の足場を表しています

CS-PEO / Fb足場の水蒸気移動率

WVTRは、創傷環境の理想的な湿度を維持する上で重要な役割を果たします。これは、細胞の肉芽形成と上皮化にプラスの影響を与えます[39、40]。より高いWVTR値は、蒸発と滲出による急速な創傷脱水と相関しており、体温を低下させ、代謝を増加させる可能性があります。逆に、極端に低いWVTR値は、滲出液の蓄積、治癒の阻害、および感染のリスクの増加と相関しています。 Lamke etal。正常な皮膚のWVTRを204±12g m ⁻² と報告しました 日 ^-1 279〜5138 g m ⁻² 日 ^-1 傷の状態に応じて、傷ついた皮膚の場合[41、42]。創傷の上皮化と治癒の促進には、2028.3±237.8 g m ^-2 の理想的なWVTR 日 ^-1 報告されています[43]。 CS-PEOおよびFbスキャフォールドのWVTRは、693.2±95.7および686.1±44.17 g m ^-2 でした。 日 ^-1 、 それぞれ。手付かずの足場よりも理想的なWVTRに近いものの、CS-PEO / Fb足場（806.5±56.1 g m ^-2 日 ^-1 ）それでも理想的なWVTRを下回りました（図7）。足場の物理的パラメータを操作すると、WVTRが改善され、報告された理想的な速度をよりよく模倣できる可能性があります。

エレクトロスピニングされたCS-PEO、CS-PEO / Fb、およびFbスキャフォールドの水蒸気移動速度。エラーバーは標準偏差を表します（ n =6、* p

ヒト皮膚線維芽細胞のinvitro細胞生存率

キトサン-PEO / Fb足場は、最初の48時間の間、ヒト線維芽細胞に対して有意な増殖効果を示しませんでした（図8）。それでも、72時間での長期暴露は、足場なしの対照と比較して、統計的に有意な増殖の減少をもたらしました。結果は、足場によって示される細胞増殖の阻害があり、それは時間とともに累積する可能性があることを示唆している。

FbおよびCS-PEO / Fbエレクトロスピニング足場（ n ）に曝露した場合のヒト皮膚線維芽細胞増殖の比較 =9、* p <各時点で「足場制御なし」と比較して0.05）

増殖能の低下は、CSに関連するアセチル化（DA）の程度が原因である可能性があり、CSは正電荷を介して強い細胞相互作用を示すことが示されています[44]。 Younes etal。 CS（> 50％DA）で処理された膀胱癌細胞は24時間後に生存率を大幅に低下させ、CSの細胞毒性が増殖に影響を与える可能性のあるDAに直接関連していることを示唆しています[45]。この効果はまた、invitro実験条件に分離される可能性があります。以前の研究では、CSの生分解生成物は代謝経路を介して除去される可能性があるため、CSはinvivoで無毒であることが示されています[46]。エレクトロスピニングプロセスからの残留HFIPも、観察された細胞毒性に寄与する可能性があります。ただし、同じ細胞毒性は、HFIPでも調製されたエレクトロスピニングされた純粋なFb足場では観察されませんでした。 HFIPは、揮発性が高いため、製造プロセス中にエレクトロスピニングされた足場から排除された可能性があります。繊維系に組み込まれた残留HFIPが、ヒトの皮膚線維芽細胞への時限曝露中に放出された場合、細胞生存率の観察可能な低下が明らかになります。

LIVE / DEADアッセイと細胞接着

図9a–cは、フィブロネクチンでコーティングされたガラス、無負荷のCS-PEO / Fb足場、およびPDGFを負荷した（4μg/ mL）CS-PEO / Fb足場の表面に播種された皮膚線維芽細胞の分布と生存率を示しています。培養24時間後、生細胞と比較して最小限の死細胞が観察されました。 PDGFをロードしたスキャフォールドとアンロードしたスキャフォールドの間に識別可能な違いは見られませんでした。

Confocal micrographs of fibroblasts seeded on a 、 d fibronectin-coated glass; b 、 e unloaded CS-PEO/Fb scaffold;および c 、 f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

略語

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Platelet-derived growth factor

PEO：

ポリエチレンオキシド

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate