グラフェン酸化物蛍光アプタセンサーによるCCRF-CEM白血病細胞の高感度迅速検出

概要

グラフェン酸化物-アプタマー複合体（GO-apt）に基づく、便利で低コスト、高感度な蛍光アプタセンサーを白血病検出用に開発した。グラフェン酸化物（GO）はカルボキシフルオレセイン標識Sgc8アプタマー（FAM-apt）をπ-πスタッキングで吸着し、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）で蛍光をクエンチングする。Sgc8標的細胞CCRF-CEMが存在しない場合、蛍光はほぼ完全にクエンチされる。逆にCCRF-CEM細胞を添加すると、クエンチされた蛍光が迅速かつ顕著に回復する。したがって、蛍光信号の変化に基づき、1×10²から1×10⁷ cells/mLの広範囲でCCRF-CEM細胞数を検出可能で、検出限界（LOD）は10 cells/mL。このGOベース蛍光アプタセンサー戦略は、がん検出に有望である。

背景

白血病は侵襲的で一般的な悪性血液疾患であり、特に小児と青少年の生存と健康を脅かす[1, 2]。正常造血細胞だけでなく骨髄や免疫系にも影響する[3,4,5]。したがって、治療と患者QOL向上のための白血病早期診断は不可欠。現在の一般的検出法は末梢血と骨髄採取後、細胞形態[6]、細胞化学[7,8,9]、免疫表現型[10, 11]、免疫組織化学[12, 13]、アプタマーベースフローサイトメトリー[14, 15]など多岐にわたる。これらは白血病細胞を検出可能だが、高コスト、低感度、複雑といった欠点がある。したがって、低コスト、高感度、簡便な白血病検出法の開発が急務である。

アプタマーは、系統的リガンド進化による指数関数的増殖（SELEX）法でスクリーニングされる短い一本鎖DNA（ssDNA）またはRNAである[16, 17]。特異的な三次構造に基づき、小分子有機物、タンパク質、さらには細胞など標的に対し強い結合親和性と高い特異性を示す[18,19,20]。また、容易に合成・修飾可能ながん検出プローブとして広く利用される[21]。アプタマー基盤の機能性ナノ材料を用いたがん検出も近年のホットトピック[22, 23]、量子ドットやシリカナノ粒子など[24]。

グラフェン酸化物（GO）は、優れた水溶性[25]、巨大比表面積、優れた蛍光クエンチング能[26, 27]など独自特性を持つ新規二次元平面カーボンナノ材料として注目されている。これらの特性により、GOは蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）における優れたエネルギー受容体と見なされ、蛍光アプタセンサーへの幅広い応用が期待される[28]。さらに、GOはπ-πスタッキング相互作用でアプタマーと結合するが、二本鎖DNAやアプタマー-標的複合体とは結合しない[19, 29, 30]。したがって、グラフェンベースアプタマーセンサーはフリーアプタマープローブと比較してアプタマー安定性を向上できる[31]。

現在、GOベース蛍光アプタセンサーによる標的検出の実現可能性に関する研究が多数報告されている[21, 32]。しかし、白血病細胞検出への応用はほとんどない。ここでは、GOとカルボキシフルオレセイン標識Sgc8アプタマー（FAM-apt）に基づく白血病細胞のシグナル「ターンオン」検出新戦略を設計した。GOとアプタマーをそれぞれ蛍光クエンチャーと標的認識剤として用いる。白血病細胞不在時、GOがFAM-aptと相互作用しほぼ全蛍光をクエンチ、検出信号オフ。標的細胞存在時、アプタマーが活発に細胞を標的化しGOから離脱、検出系で蛍光回復、信号オン。したがって、蛍光強度変化に応じて標的細胞濃度を測定可能。

実験方法

試薬

配列5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3'のFAM-aptをSangon Biotech（上海）で合成。自作Tris-HCl緩衝液（20 mM Tris-HCl pH 7.4、5 mM MgCl₂、100 mM NaCl）を使用。アプタマーをTris-HCl緩衝液で溶解。グラフェン酸化物粉末をXianfeng Nano Materials Tech（南京）から購入。すべての溶液はMilli-Q精製水（18 MΩ、Millipore）で調製。

細胞

CCRF-CEM（ヒト急性白血病リンパ芽球細胞株）、Ramos（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）、293T（ヒト胚性腎細胞株）、H22（マウス肝細胞癌細胞株）を中国科学院細胞バンク（上海）から入手。すべて5% CO₂、37°Cで培養、培地は10% FBS（HyClone）と100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン（Gibco）含有RPMI 1640。

装置

すべての蛍光スペクトルと強度をF-7000蛍光分光光度計（日立、東京）で測定記録。700 µL石英キュベット使用。カルボキシフルオレセイン（FAM）の特性ピーク波長に基づき、490 nm励起、518 nm発光で発光強度モニタリング。

原子間力顕微鏡（AFM）像はSPI3800N顕微鏡（セイコーインスツルメンツ、東京）で取得。

GO、FAM-apt、GO-apt複合体のゼータ電位をナノ粒子サイズ・ゼータ電位・絶対分子量アナライザー（Zetasizer Nano ZS、Malvern、UK）で測定。

GO、FAM-apt、GO-aptのUV-可視吸収スペクトルをNanoDrop 2000（Thermo、USA）で記録。

GO-apt蛍光アプタセンサー調製

グラフェン酸化物粉末をMilli-Q水に溶解分散、超音波処理で1 mg/mL均一黒色溶液を得た。20 mM Tris-HCl緩衝液で希釈し、20 nM FAM-aptを調製。1 µL FAM-apt（10 µM）と10 µL GO溶液（1 mg/mL）を混合、Tris-HCl緩衝液で500 µLに希釈。

細胞イメージング

CCRF-CEMとRamos細胞を6ウェルプレート（5×10⁵ cells/well）で12時間培養。冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回洗浄後、GO-apt溶液で4°C暗所30分インキュベート。3回洗浄後、4%ポリオキシメチレンで20分固定。再度PBS洗浄後、DAPI（Life Co.、USA）で5分暗所染色。3回PBS洗浄後、蛍光顕微鏡（Nikon DS-Ri1、日本）で観察。

CCRF-CEM細胞検出

CCRF-CEM細胞を遠心分離回収、1 mL PBSに再懸濁。異なる濃度（0-1.0×10⁷/mL）のCCRF-CEMをGO-apt蛍光アプタセンサーと4°C暗所30分インキュベート。インキュベーション後、560-500 nm波長域で蛍光分光法により検出。検出限界（LOD）は3σ/S計算で推定、σはGO-apt溶液の標準偏差（n=10）、Sは直線近似式の傾き[33]。

特異性アッセイ

GOベース蛍光アプタセンサーの特異性を、Ramos、H22、293T細胞で検証。各100 µL反応系に1×10⁶ cellsを含有。

統計解析

各実験を3回繰り返し。データ処理にSigmaPlot 12.5、統計解析にGraphPad Prism 6.02（GraphPad Software、San Diego、CA、USA）を使用。すべての解析で有意水準P<0.0001。

結果と考察

GO-apt蛍光アプタセンサーによるCCRF-CEM検出の原理

本研究ではGOとFAM-aptを用いてCCRF-CEM細胞検出用蛍光アプタセンサーを設計。検出原理を図1に示す。CCRF-CEM細胞不在時、FAM修飾アプタマーがπ-πスタッキングでGO表面に吸着。GOと蛍光体がエネルギー移動のために近接するため、クエンチャーとしてGOがFAM蛍光をクエンチング。CCRF-CEM細胞存在時、GO-アプタマーの弱い結合力によりアプタマーがGO表面から離れ細胞と結合、蛍光回復。したがって、FAM蛍光強度回復に応じてCCRF-CEM細胞数を検出可能。

CCRF-CEM細胞検出用GO-apt蛍光アプタセンサーの概略図

蛍光クエンチングと回復

GOによるFAM-apt蛍光クエンチングとCCRF-CEM細胞存在時の蛍光回復の連続プロセスを蛍光分光光度計で観察。GO-蛍光アプタマーベースセンシングの全プロセスを図2aに示す。25 nM Tris-HCl緩衝液中のFAM-apt蛍光スペクトルはFAM存在により強い蛍光強度（図2a、曲線a）。しかしGO添加で蛍光強度が著しく低下（図2a、曲線b）、GOがアプタマーと近接吸着時に効率的に蛍光クエンチングすることを示唆。驚くべきことに、5×10⁶ CCRF-CEM細胞添加でクエンチされた蛍光が適時に回復（図2a、曲線c）。一方、GO非共役FAM-aptはCCRF-CEM添加で明らかな変化なし（図2a、曲線d）。CCRF-CEMは非蛍光細胞（図2a、曲線e）；したがって蛍光回復は主にアプタマーがグラフェン表面から解離し蛍光基が露出することによる。FAM標識Sgc8アプタマーとCCRF-CEMの異なる条件下での蛍光発光スペクトル統計解析を実施（図2b）。

Go-aptによるCEM細胞検出の実現可能性。a 異なる条件下でのFAM-aptとCCRF-CEM細胞の蛍光発光スペクトル：（a）FAM-apt、（b）FAM-apt+GO、（c）FAM-apt+GO+CCRF-CEM、（d）FAM-apt+CCRF-CEM、（e）CCRF-CEM；FAM-apt（20 nM）；GO（25 μg/mL）；CCRF-CEM（1×10⁶ cells）。励起490 nm。b 異なる条件下でのFAM-aptとCCRF-CEMの蛍光発光スペクトル統計解析。NS 有意差なし。****P<0.0001

GO-apt蛍光アプタセンサーの特性評価

設計検証のため均一分散GOを取得。図3aで厚さ1.17 nmのGOシートがAFMで典型的二次元外観を示すことがわかる。一方、厚さ1.94 nmのGO-aptではFAM-aptがGO表面に吸着成功。FAM-aptとGOのゼータ電位はそれぞれ-11.35と-23.90 mV、GOが非共有結合でFAM-aptと相互作用するとゼータ電位絶対値が増大（図3b）。これらの結果はアプタセンサー構築成功を示す。図3cでGOが234 nmに強い吸収（芳香族C=C結合のπ-π*遷移由来）、FAM-aptはDNA配列（260 nm）とFAM（503 nm）の吸収バンドを示し、GO添加でレッドシフトと503 nm吸収増大。これはFAM-aptがGO表面に吸着し、GOと染料の2つのπ系間で基底状態電子相互作用が生じるためと推測。したがってGO-apt構築成功を示す。

GO-aptの特性評価。a GOとCEM-aptのAFM像。b FAM-apt、GO、CEM-aptの表面ゼータ電位。エラーバーは±SD（n=3）。c UV-可視吸収スペクトル：（a）GO、（b）FAM-apt、（c）GO-apt

細胞蛍光顕微鏡観察

剥離FAM-aptの細胞レベル特異的結合を直接可視化するため、CCRF-CEMとRamos細胞をGo-aptでインキュベートし蛍光顕微鏡で解析。蛍光スペクトル実験と一致し、FAM-aptがGo-aptから離れCCRF-CEM細胞に結合し蛍光染色するが、Ramos細胞には結合しない（図4）。

GO-apt混合後のCCRF-CEMとRamos細胞蛍光顕微鏡像。核はDAPI染色。スケールバー25 μm

CCRF-CEM検出の実験条件最適化

蛍光アプタセンサーの優れた性能を得るため、蛍光クエンチングと回復時間を最適化。FAM-aptとGO、およびCCRF-CEM細胞存在下の均一GO溶液中FAM-aptの動力学的挙動を、クエンチングと回復時間関数として蛍光強度モニタリングで調査（図5a, b）。図5aでGO存在下でのFAM-apt蛍光クエンチングの時間依存性を観察。FAM-aptがGO表面に急速吸着し、その後エネルギー移動、同時に蛍光強度が有意に低下し2分後緩やかに。対照的にCEM-apt形成とGO表面からの放出はより遅い。インキュベーション時間30分以上で蛍光強度がプラトーに到達（図5b）。これらの時間依存実験は、GOが優れたクエンチャーとしてFAM-apt蛍光を急速クエンチし、CEM存在下で徐々に蛍光を回復することを明確に示す。

実験条件最適化。a GOによるFAM-apt（20 nM）Tris-HCl緩衝液中蛍光クエンチングの時間依存性。b CCRF-CEM（1×10⁶）によるGO溶液中FAM-apt蛍光回復の時間依存性。c GO濃度のFAM-apt蛍光強度への影響：CCRF-CEM不在（曲線a）と存在（曲線b）時。d 1×10⁶ CCRF-CEM細胞によるFAM-apt蛍光強度比（F/F₀）のGO濃度依存性。励起490 nm

CCRF-CEM検出に対する蛍光アプタセンサー感度を高めるため、反応系のGO濃度最適化が不可欠。図5cが戦略を明確に示す：異なるGO濃度でのFAM-apt蛍光強度への影響、CCRF-CEM不在（曲線a）と存在（曲線b）時。図5cから、GO添加で蛍光バックグラウンドが有意に低減。図5dで1×10⁶ CEM細胞によるFAM-apt回復蛍光のGO濃度依存性。図5dから、GO濃度20 µg/mLでF/F₀比（F₀とFはCCRF-CEM不在時と存在時の518 nmでのFAM蛍光強度）が最大値13.0354。したがって20 µg/mLを最適GO濃度と判定。

GO-apt蛍光アプタセンサーによるCCRF-CEM検出

良好な実験結果を得るため最適条件でCCRF-CEM検出を実施。図6aでCCRF-CEM数が0から1×10⁷に増加するにつれ蛍光強度も増加。さらにF/F₀が1×10²-1×10⁷範囲でCCRF-CEM数に明確な線形依存性（図6b）。線形回帰式：Y(F/F₀)=3.2608×log C-5.1892（CはCCRF-CEM数）、回帰係数R²=0.9922。検出限界は10 cells/mL未満と見なされる。したがってGOベース蛍光アプタマーセンシングは広い検出範囲を持ち、CCRF-CEM検出用理想的バイオセンサーとして利用可能。他手法と比較し高感度（表1）[34,35,36,37,38,39]。

Go-aptによるCEM細胞検出。a 異なる濃度CCRF-CEM細胞存在下でのGO-apt蛍光アプタセンサー蛍光発光スペクトル。b 蛍光強度比（F/F₀）とCCRF-CEM細胞濃度の線形関係

GO-apt蛍光アプタセンサーの特異性

GO-apt蛍光アプタマーの特異性を、Ramos、H22、293T細胞で検証。各100 µL反応系に1×10⁶ cells含有。図7でCCRF-CEMが他対照群より高い蛍光強度を示す。結果は設計蛍光アプタセンサーが高特異性を持つことを明確に示す。

CEM検出用蛍光アプタセンサーの特異性。CEM細胞、Ramos細胞、H22細胞、293T細胞存在下でのGO-apt蛍光アプタセンサー蛍光強度比（F/F₀）（各1×10⁶）、F₀とFは518 nmでの検出細胞不在時と存在時の蛍光強度。励起490 nm

結論

CCRF-CEM細胞検出用の便利で低コスト、高感度な蛍光アプタセンサーを開発した。この戦略は、グラフェンと一本鎖DNAのπ-πスタッキングによる非共有結合相互作用とグラフェンの優れた蛍光クエンチング性能を巧みに利用。アプタマーと比較し、CEM-アプタマー複合体のGOへの結合が弱いため、グラフェンによりクエンチされた蛍光が徐々に回復。最適条件下で検出限界は100 cells/mL未満と見なされる。したがって、優れた性能に基づき、蛍光アプタセンサーは腫瘍細胞検出に広い展望を持つ。

変更履歴

略語

AFM:

原子間力顕微鏡

CEM-apt:

CCRF-CEM-アプタマー複合体

FAM-apt:

FAM標識Sgc8アプタマー

FRET:

蛍光共鳴エネルギー移動

GO:

グラフェン酸化物

GO-apt:

グラフェン酸化物-アプタマー複合体

PBS:

リン酸緩衝生理食塩水