電気紡糸キトサン-ポリエチレンオキシド/フィブリノゲン足場による持続的PDGF送達と創傷治癒促進

概要

創傷治癒は、増殖因子、細胞遊走、細胞外マトリックスリモデリングによって制御される多面的プロセスである。バイオアクティブドレッシングが進歩しても、送達課題により臨床実用化はごくわずかである。我々は、二重スピナレット電気紡糸プラットフォームを用いて、キトサン（CS）、ポリエチレンオキシド（PEO）、フィブリノゲン（Fb）からなるナノファイバー足場を設計した。得られたCS-PEO/Fb複合体はナノメートル級繊維、均一なポリマー分布、好ましい機械的完全性を示した。血小板由来増殖因子（PDGF）を生物活性損失なく組み込み、放出試験で初期1時間に21.6%放出後、48時間にわたる持続放出という二相性プロファイルを示した。インビトロ線維芽細胞遊走アッセイで、足場から放出されるPDGFが単回50 ng mL⁻¹投与と同等の効果を示し、Fb単独でも遊走をやや促進することを確認。複合体の水蒸気透過率（≈807 g m⁻² day⁻¹）と引張強度（≈0.3 MPa）は臨床創傷ドレッシング基準に合致。これらのデータは、CS-PEO/Fb電気紡糸足場が持続的増殖因子送達と創傷治癒促進のための堅牢でバイオアクティブなプラットフォームを提供することを実証する。

背景

創傷ケアの進歩にもかかわらず、バイオアクティブドレッシングの臨床導入は限定的である。創傷治癒カスケードは、サイトカイン、免疫細胞、マトリクスタンパク質の協調的な相互作用に依存する。増殖因子は強力だが、急速なクリアランスと短い半減期により反復投与が必要で、患者負担となる。持続的・局所的送達が可能なドレッシングは、アウトカムと導入率を劇的に改善する。

PDGFは、好中球、単球、線維芽細胞を動員し、マトリックス堆積と瘢痕形成を調節する重要な走化性因子である。FDA承認のRegranex®ゲル（2.2 µg cm⁻²）は糖尿病性潰瘍で治癒を約30%加速するが、毎日の塗布が不便。したがって持続放出システムが望まれる。

電気紡糸は、天然細胞外マトリックスを模倣するナノファイバーマットを作製する汎用的手法である。コラーゲン、エラスチン、フィブリノゲンなどの天然高分子は固有の生物活性と増殖因子親和性を持つ。しかし、フィブリノゲン単独では長期ドレッシングに必要な機械的強度に欠ける。キトサンは脱アセチルキチン誘導体で、抗菌活性を持ち、PEOとブレンドすれば電気紡糸可能。CSの陽イオン性は負に帯電したFbとのブレンドを複雑にするが、二重ノズル電気紡糸が静電的非適合性を克服し、均一複合体形成を可能にする。

実験方法

材料

すべての試薬（酢酸、CS、PEO、Fb、HFIP、BSA、DMSO）と細胞株（ヒト真皮線維芽細胞PCS-201-012）をSigma-AldrichまたはATCCから購入しそのまま使用。組換えヒトPDGF-BBをPeproTechから入手。

足場作製

CS-PEO溶液（5.5 wt%、CS:PEO=2:1）を1%酢酸に0.5% BSAと10% DMSOを加えて調製。FbをHFIP/10×EMEM（1:9 v/v）混合液に110 mg mL⁻¹で溶解。PDGFを紡糸直前に添加。二重スピナレット電気紡糸（NE-1000シリンジポンプ、18ゲージ針）で、CS-PEO 0.7 mL h⁻¹、Fb 1.0 mL h⁻¹、電圧28 kVと22 kV、回転マンドレル25 RPM、距離22 cm（CS-PEO）と12.5 cm（Fb）で実施。35-45% RHで3時間走査。

形態

FESEM（Zeiss Sigma VP-40）で金蒸着試料を撮像、ImageJで繊維径を定量（n=100/足場）。CS-PEO/Fb繊維は平均202±113 nm、CS-PEO単独（270±68 nm）とFb単独（351±102 nm）より細い。

表面化学

ToF-SIMS（Bi₃²⁺、30 kV）で特徴イオン（CNO⁻、CN⁻、C₂H₅O⁺）を50×50 µmラスターでマッピング、CS-PEOとFbの均一分布を確認。

水接触角

ASTM D7334-08に従い2 µL蒸留水で測定。CS-PEO/Fbは親水性の61.4±7.6°、CS-PEO（44.2±5.1°）とFb（115.7±16.2°）の中間。

機械試験

単軸引張試験（Instron E3000、1 mm min⁻¹）を40×25 mmストリップ（厚さ94±7 µm）で実施、応力-ひずみ曲線取得。CS-PEO/Fbはピーク応力0.31±0.02 MPa、Fb単独（0.12±0.01 MPa）を上回る。

水蒸気透過率

ASTM E96に従いシリカゲル乾燥剤で測定。CS-PEO/Fbは806.5±56.1 g m⁻² day⁻¹、臨床的望ましい範囲（≈2000 g m⁻² day⁻¹）内。

細胞毒性

間接WST-1アッセイ（ISO 10993-5）で120時間評価。48時間で有意な増殖抑制なし、72時間でわずかな低下、CSアセチル化度の影響と推測。

細胞接着

足場表面上の線維芽細胞をLive/Deadとファロイダン-DAPI染色で観察。健全な形態と、フィブロネクチン塗布対照と同等の強固な接着を確認。

分解性

FBM（37°C、5% CO₂）中でインキュベート。初期1時間のバースト後、線形質量減少、≥48時間完全性維持。

PDGF放出

ELISAで累積放出量を定量：2、4、8 µg mL⁻¹担持でそれぞれ1.8±0.7、4.4±1.8、11.4±4.8 ng mg⁻¹。初期1時間で21.6%放出の二相性パターン。

線維芽細胞遊走

ORIS™遊走アッセイで、PDGF担持足場からの溶出液が単回50 ng mL⁻¹ PDGF投与と同等の遊走誘導を示し、48時間持続。Fb単独でもやや遊走促進。

結果と考察

二重スピナレット電気紡糸がCS-PEOとFbを均一ナノファイバーマトリックスに融合し、静電的非適合性を克服。複合体での繊維径減少はジェット反発増加、堆積時間延長、曲げ不安定性誘導による微細化に起因。

ToF-SIMSマッピングで均一表面組成確認、水接触角で細菌付着を抑制しつつタンパク質吸着を支持する親水性表面を示唆。機械試験でCS-PEO統合がFb固有の弱さを補い、創傷ドレッシングに適した引張強度を回復。

WVTR測定でCS-PEO/Fbが湿潤創傷環境の治療ウィンドウ内、滲出液管理と酸素透過性を両立。細胞毒性アッセイで残留HFIPや高DA CS濃度の影響は最小限、臨床転用に受け入れ可能な生物学的安全性プロファイル。

PDGF放出プロファイルは望ましい二相性：初期バーストで約21%放出、その後制御された線形放出で48時間生物学的関連濃度を維持。この持続送達はRegranex®の毎日のドレッシング交換を不要にし、患者コンプライアンス改善の可能性。

機能アッセイで放出PDGFが走化性活性を保持、単回高用量治療と同等の線維芽細胞遊走を達成。Fb固有の走化性特性の付加効果が更なる細胞リクルートを強化、相乗的メカニズムを示唆。

結論

電気紡糸CS-PEO/Fbナノファイバー足場は、キトサンの抗菌性と機械的利点、フィブリノゲンの生物活性を兼ね備え、機能的PDGF持続送達を可能にする。ナノスケール構造、適切なWVTR、機械的堅牢性により、反復増殖因子投与の不便さなしに線維芽細胞リクルートと治癒を加速する次世代創傷ドレッシングの有望候補となる。