ドキソルビシンの超音波を介した標的化送達のための生体適合性キトサンナノバブル

背景

化学療法は現在、悪性新生物の主要な治療法として使用されており、癌患者の生存率を大幅に改善します。それにもかかわらず、化学療法薬の有効性は、全身毒性などの有害な副作用によって制限されます[1]。化学療法薬の局所送達は、標的部位での治療用量を増やし、循環薬の血漿レベルを下げることによって、それらの毒性を減らす可能性があります。その非侵襲性とターゲティング可能性により、超音波をターゲットとしたナノ/マイクロバブル破壊（UTN / MD）は、効果的なドラッグデリバリーシステムとして広く使用されています。

従来のマイクロバブルと比較して、ナノサイズの粒子は毛細管壁をより簡単に通過できるため、より効率的に標的部位に送達することができます。 NBは、肝細胞癌での使用がテストされた5-フルオロウラシルをロードしたNBなどの標的療法の研究で使用されてきました[2]。シェンら。最近、超音波を介したNBを使用してレスベラトロールを髄核細胞に送達し[3]、NBは乳がんの治療にも使用されています[4]。

UTN / MDで使用されるナノバブル（NB）は通常、ガスコアと安定化シェルで構成されています。脂質、界面活性剤、ポリマー、または他の材料がシェルの組成に使用されます。以前の研究では、さまざまなタイプのNBが作成されています。ただし、NBまたはナノ粒子を形成するために使用される化学物質の多くは、人体に潜在的な脅威をもたらします。その結果、一部のナノ粒子の輸送は、正常な組織や細胞に不十分な治療効果と毒性をもたらしました[5]。 Tween 80やグルタルアルデヒドなどの化学薬品は毒性が高く、変異原性のリスクがあるため、臨床応用が制限されます[6、7]。 NBで使用される別の材料であるPLAは、場合によっては臨床的副作用を引き起こす可能性があります[8]。この文脈では、NBの組み立てに使用される材料の生体適合性と安全性を考慮することが重要です。

多糖類キトサンは、その天然由来、生分解性、生体適合性、非常に低い免疫原性、抗菌活性、および実用性のために注目を集めています[9、10]。キトサンはキチンのN-脱アセチル化誘導体であり、地球上で最も豊富な生物学的物質の1つです[11]。さらに、以前の研究では、IFN-γの存在下で、水溶性キトサンオリゴマーがマクロファージを活性化して癌細胞を殺すことができることが示されました[12]。したがって、キトサン自体には直接的および間接的な抗腫瘍効果があり、抗がん剤の担体としてより適しています。私たちがNBで使用した他の材料は、NBで使用するための優れた候補であるレシチンとパルミチン酸でした[13]。パルミチン酸は、飽和炭素14、16、および18炭素脂肪酸の中で最も豊富なもののひとつであり、通常はアセチルCoAによって合成され、毒性が低く、生体適合性が高い[14]。レシチンは主に大豆に由来する天然の界面活性剤です[15]。以前の研究では、大豆レシチンはコレステロール低下作用があるため、健康上の利点があることが示されています。たとえば、大豆レシチンは心血管疾患のリスクを減らすのに役立ちますが、精製大豆はナイシンのカプセル化に使用できます[16、17]。この研究では、上記の材料を使用して生体適合性のあるNBを作成しました。送達のための超音波の助けを借りて、ドキソルビシン塩酸塩（DOX）をモデル薬物として使用して、ヒトミシガン癌財団-7（MCF- 7）乳がん細胞。さらに、UTN / MDに続いてDOX-NBの抗腫瘍効果も評価されました。

材料と方法

資料

この研究で説明されているNBは、コアとしてパーフルオロプロパン（C3F8、原子力産業物理化学工学研究所の特殊ガス研究開発センター、北京、中国）をコアとして使用し、キトサンコーティングをシェルとして使用して構築されました。さらに、エピクロン200（95％のジパルミトイルホスファチジルコリンを含む大豆レシチン、Lukas Meyer、ハンブルク、ドイツ）、エタノール（分析グレード、中国、ハンブルク）、塩酸ドキソルビシン（Sigma-Aldrich、ミズーリ、米国）、キトサン（100〜300 kD 、Bozhihuili、青島、中国）、およびパルミチン酸（JINDU、上海、中国）もこの研究で使用されました。 Pluronic F68は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。

細胞株

MCF-7ヒト乳癌細胞株はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州、米国）から入手し、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）（ギブコ、カールスバッド）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養しました。 、カリフォルニア、米国）。細胞を37℃、5％CO ₂ で培養しました。 、および湿度95％。対数増殖期の細胞を実験のために採取しました。

DOXをロードしたキトサンNBの準備

前述の方法[18、19]に従ってNBを作成しました。 DOX-NBのシェルには中分子量のキトサン（100〜300 kD）を使用し、コアにはパーフルオロプロパンを使用しました。 DOX-キトサン溶液を調製するために、適切な用量のDOXを超純水に溶解し、ボルテックスミキサーで5秒間混合することにより、2 mlのDOX溶液（1 mg / mL）をキトサン水溶液に添加しました。 DOX-キトサン溶液を65°Cで1時間インキュベートしました。これとは別に、エピクロン200を含むエタノール溶液をパルミチン酸水溶液に加えた。適切な量​​の超純水を加えた後、ボルテックスミキサーを使用してパルミチン酸-エピクロン200システムをホモジナイズしました。続いて、パルミチン酸-エピクロン200システムを1.5 mLのエッペンドルフチューブ（EPチューブ）に分割し、長い細い針を備えた10 mLのシリンジを使用して、チューブ内の空気をパーフルオロプロパンに置き換えました。各チューブは、機械的振動子（Ag and Hgミキサー、西安、中国）で120秒間振動しました。次に、1.5 mL EPチューブ内のすべての液体を遠心分離チューブに注ぎ、氷浴でDOX-キトサン溶液と混合しました。続いて、混合物を-4℃で30分間インキュベートした。次に、Pluronic F68の水溶液（0.01％、 w / w ）、安定剤を、撹拌しながら上記の混合物に加えた。次に、透析精製ステップ（限外濾過遠心分離管、ミリポア、30 kDa）を実行して、残留する遊離DOXをすべて除去しました。

NBの物理的特性の観察

DOX-NBの懸濁液は、適切な量のPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を加えることによって希釈されました。次に、DOX-NBの形状を、×100の油浸対物レンズ（OLYMPUS BX41、オリンパス株式会社、日本）を備えた蛍光顕微鏡で観察および画像化しました。蛍光画像は、蛍光顕微鏡（Nikon TE2000-S、日本）を使用して評価されました。 DOX-NBの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM）（JEOL、東京、日本）でも観察されました。希釈したナノバブルの水性懸濁液をFormvarでコーティングした銅グリッドにスプレーし、4％ w で染色しました。 / v 酢酸ウラニルを10分間。次に、TEMを使用してサンプルを視覚化および画像化しました。 DOX-NBのサイズと表面ゼータ電位は、Delsa Nano C粒子サイズとゼータ電位アナライザー（Beckmann Instruments、USA）によって測定されました。すべての測定は、平均値を計算するために3回実行されました。

DOX-NBの安定性

これらのナノバブルの安定性を観察するために、DOX-NBのサイズと形態を経時的に測定しました。 DOX-NBの一部は、4°Cの冷蔵庫で24時間または48時間保管されました。他のものは6時間室温に保たれた。 25°Cでのナノバブルの安定性は、凍結乾燥したヒト血清（Seronorm™Human、ノルウェー）でも調査されました。この目的のために、1mlのDOX-NBs水性懸濁液を1mlの血清に添加し、25℃で6時間インキュベートしました。次に、すべてのDOX-NBを光学顕微鏡を使用した形態分析によって測定し、それらの構造の完全性を評価しました。 NBのサイズは、Delsa Nano C粒子サイズおよびゼータ電位アナライザー（Beckmann Instruments、米国）によって測定されました。

DOXの決定-NBの負荷容量

DOX濃度の標準曲線は、0.025、0.05、0.1、および0.2 mg / mLの濃度で連続DOX希釈液を使用して作成し、UV分光光度計（UV-2450、島津製作所）を使用して測定しました。続いて、ブランクNBをコントロールとして使用して480 nmでDOXローディング効率を評価し、上記で確立した標準曲線に基づいてDOX-NBのDOX濃度を計算しました。精製および測定プロセス中のDOXの光分解を回避するために、すべての手順は光から保護された状態で実行されました。続いて、DOX-NBの懸濁液を凍結乾燥機で-55°C、0.080mbar未満で1。5日間凍結乾燥しました[20]。次に、凍結乾燥したDOX-NBの重量を測定して、薬物カプセル化効率（EE）の観点から薬物負荷容量を次のように計算しました。EE= A / B ×100％、ここで A はNBにロードされたDOXの量であり、 B は溶液中のDOXの初期量です。実験は3回繰り返されました。

超音波を介したDOXリリース

DOX-NBからのDOXのinvitro放出動態は、37°C​​での透析バッグ技術により、超音波（US）の存在下および非存在下で決定されました。 DOX-NBは透析膜（Spectra / Por、カットオフ12,000–14,000 Da）で囲まれ、100rpmで振とうしながら100mlのPBSの容器に入れられました。米国のグループは、テスト前に米国（VCX400、Sonics and Materials、米国、電力密度、1.0 W / cm2、周波数、20 kHz）によって40秒間超音波処理されました[21]。 DOXの放出を最大24時間測定し、一定時間ごとに1 mlを取り出し、1mlの新しいPBSと交換しました。外部バッファー中のDOXの濃度は、UV分光光度計によって480nmで測定されました。放出実験は3回行った。

In Vitro超音波イメージング（時間強度曲線）

超音波下でのDOX-NBの米国でのイメージングと安定性は、臨床超音波スキャナーシステム（LOGIQ E9; GE、USA）でinvitroで検証されました。実験は、特定の周波数、送信電力、および超音波への曝露時間で実施されました。以前に開発された方法[19]（図5a）を利用して、DOX-NBは超音波増強を達成しました。 DOX-NBの超音波イメージングの安定性は、機械的指標（MI）が0.10、イメージング深度が4.5cmの超音波刺激にさらされた後に評価されました。米国のすべての画像は、Image Jを使用してオフラインで分析されました。その後、LOGIQ E9の組み込みソフトウェアを使用して画像分析が行われ、サンプルのグレースケール値が計算されました。 0〜15分で取得された60秒のクリップのそれぞれについて、最初に各フレームに対してモーション補正が実行され、デシベル値が取得されました。各デシベル値は、超音波照射前後のコントラスト強調の変化を反映するために時間強度曲線上にプロットされました。増強のピーク強度および持続時間は、時間強度曲線によって表された。分析中に、水サンプルに対応するバックグラウンド信号を差し引くことにより、範囲補正された後方散乱値が取得されました。

空のNBの細胞毒性アッセイ

空のキトサンNBのバイオセーフティは、Cell Counting Kit-8（CCK-8）アッセイキット（Sigma-Aldrich、USA）を使用してテストされました。アッセイの前に、MCF-7細胞を2×10 ³ の密度でプレーティングしました。 96ウェルプレートの細胞/ウェル。細胞は、キトサンNBの濃度と超音波条件を変化させることによって処理されました。キトサンNBのバイオセーフティは、MCF-7細胞を0〜30％のNBの連続濃度でインキュベートすることによって評価されました。低強度の超音波刺激装置（US10、Cosmogamma Corporation、イタリア）を使用して、70％のデューティサイクルと100Hzのパルスレートを使用して、1MHzの固定周波数で超音波刺激を実行しました。各グループは、異なる照射時間と異なる音の強さで処理されました。安全上の理由から、超音波は0.5 W / cm ² の強度で使用されました。 または1.0W / cm ² パルス長は30または60秒です（表1）。深さ、周波数、およびその他の超音波条件は、すべての超音波実験の間、一定に保たれました[22]。処理後、細胞を96ウェルプレートでさらに24時間培養しました。続いて、1％FCSを含む維持培地を使用して薬物含有培地を交換し、製造元の指示に従ってCCK-8溶液をプレートに添加しました。 37°Cでさらに2.5時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Bio-Rad、USA）を使用して、波長450nmで各ウェルの分光光度吸光度を測定しました。

インビトロでの細胞内薬物取り込み

DOXの細胞内取り込みは、フローサイトメトリー（Beckman Coulter、マイアミ、米国）によって決定されました。簡単に説明すると、MCF-7細胞を2.5×10 ⁵ の密度で6ウェルプレートにプレーティングしました。 10％FBSを添加したDMEM培地の細胞/ウェル。一晩培養した後、培地を同じ濃度のDOX-NBまたは遊離DOXを含む培地と交換し、細胞を超音波の有無にかかわらず処理した。細胞生存率と高いソノポレーション効率を考慮して、その後の実験では20％のDOX-NBs濃度を選択し、超音波処理は0.5 W / cm ² の強度に設定しました。 パルス長は30または60秒です。続いて、1時間のインキュベーション後、細胞培地を除去し、細胞を新鮮なPBSで3回洗浄して、遊離および非結合のDOX-NBまたはDOXを除去した。次に、遠心分離（5分、1000 rpm）によって細胞を収集し、DOXの細胞内取り込みの前に500μLのPBSに再懸濁し、FACSCaliburフローサイトメーターで分析しました。分析中、赤色蛍光を検出するためにゲートを任意に設定し、サンプルごとに10,000個の細胞を分析しました。

invitroでのMCF-7細胞に対するDOX-NBの影響

CCK-8アッセイとフローサイトメトリーを使用して、DOXの取り込み後のMCF-7細胞の増殖とアポトーシスの定量的評価を実施しました。簡単に説明すると、MCF-7細胞を96ウェルプレートまたは6ウェルプレートにプレーティングしてインキュベートし、上記の手順を使用して処理しました。増殖アッセイでは、処理した細胞を37°Cで24時間インキュベートした後、CCK-8で2時間染色し、マイクロプレートリーダーで吸光度を読み取りました。 DOX誘導アポトーシスは、次のようにアネキシンV-APCアッセイによって決定されました。6時間の処理後、各ウェルに0.5μLV-APC（Sungene Biotech、Tianjin、China）を添加して細胞を染色し、フローサイトメトリー分析を行いました。 （Beckman、Coulter、Fullerton、CA、USA）を使用して、アポトーシス細胞を定量化しました。

統計分析

すべての実験は三重に実施され、データは平均として表された。統計分析は、SPSSバージョン18.0を使用して実行されました。 p 値<0.05は統計的に有意であると見なされました。

結果

DOX-NBの物理化学的特性評価

調製されたNBは球状の形態を示した。倒立顕微鏡下では、NBの画像は離散的で無傷の球状の輪郭を示し（図1a）、これはDOX-NBの蛍光顕微鏡画像（図1b）と一致していました。 DOX-NBのソリューションの代表的なTEM画像を図1cに示します。 NBの物理的特性は、粒子サイズとゼータ電位アナライザーによって決定されました。図2に示すように、DOX-NBの平均直径は641 nm、P.I。 0.256。 DOX-NBのゼータ電位は+ 67.12±2.1mVであり、互いに反発するのに十分な高さであり、NBの凝集を防ぎ、長期的な安定性をサポートします。

光学顕微鏡で観察されたNB（倍率×1000）（ a ）およびDOXをロードしたNBの蛍光顕微鏡画像（ b ）およびDOXをロードしたNBのTEM画像（ c ）

DOXをロードしたNBのサイズ分布

DOX-NBの安定性と薬物負荷効率

DOX-NBは、4°Cで48時間懸濁液中で安定していました。室温で保存した後、DOX-NBのサイズはPBSとヒト血清の両方でわずかに大きいことがわかりました（図3）。 DOX-NBの最終的な負荷容量は64.12mg DOX / gDOX-NBであり、これはEE 54.18％に相当します。

DOX-NBの光学画像 a 室温で、 b PBS中25°Cで6時間後、および c 血清中25°Cで6時間後

InVitroでのDOX-NBによるDOXリリース

図4は、超音波処理がDOX放出に及ぼす影響を評価するために、米国での処理の存在下または非存在下でのPBS中のDOX-NBからのDOXのinvitro放出プロファイルを示しています。 DOX-NBから放出されるDOXの量は、米国のグループと米国以外のグループの間で大幅に異なっていました。 5時間後、米国グループのDOX-NBはカプセル化されたDOXの46.45％を放出しましたが、米国以外のグループではわずか9.3％でした。米国以外のグループは、24時間後にDOXの19.4％しか放出しませんでした。対照的に、DOXの80％近くが米国のグループで排出されました。結果は、米国の照射がキャビテーション効果のためにDOX-NBからのDOXの放出を促進する可能性があることを示唆しました。

超音波照射の有無にかかわらず、DOX-NBからのドキソルビシン放出（2 kHz、1.0 W / cm ² ）

DOX-NBの超音波安定性

図5bに示すように、DOX-NBはinvitroで超音波増強を達成しました。超音波デシベル値の減衰を図5cに示します。結果は、DOX-NBが良好な超音波増強を達成したことを示し、滑らかな曲線は、NB懸濁液の超音波減衰プロセスが比較的遅いことを示しています。これは、DOX-NBの超音波信号がイメージングとコントラスト強調のために十分に安定している可能性があることを示しています。

invitro実験装置の概略図（ a ）、9.0 MHzプローブ（ b ）を使用したDOXをロードしたNB（0、5、10、および15分）の超音波画像 ）および超音波造影剤およびDOXをロードしたNBの時間強度測定（ c ）

空のNBのバイオセーフティ

MCF-7細胞の生存率は、超音波検査後24時間、空のNB（DOXなし）で培養することにより測定しました。図6に示すように、空のNBは、特定の超音波強度の下で細胞の生存率に大きな影響を与えませんでした。 0.5 W / cm ² の超音波強度を使用する場合 照射時間は30秒、99.53％、80％以上のMCF-7細胞がそれぞれ10％と30％のNB懸濁液で生存しており（グループ1）、MCF-7細胞の生存率の低下は用量依存的でした。さらに、超音波強度と照射時間は、MCF-7細胞の生存率に影響を与えた他の2つの要因でした。特に、空のNBの濃度が30％の場合、MCF-7細胞は0.5 W / cm ² で処理されました。 30秒間、0.5 W / cm ² で処理したものよりも高い生存率を示しました。 60sまたは1W / cm ² 30秒間（0.84％対0.75％対0.63％）。したがって、0.5 W / cm ² の超音波強度 細胞取り込み実験には30秒/ 60秒の照射時間を使用しました。

MCF-7細胞におけるさまざまなNB濃度と音の強さのinvitro細胞毒性

DOX-NBと超音波照射によって媒介されるinvitroDOX配信の強化

DOX-NBまたは遊離DOX（等しいDOX濃度）で処理されたMCF-7細胞を固定し、それらの蛍光強度をフローサイトメトリーで測定しました。 DOX処理を受けていない細胞をブランクコントロールとして使用しました。 ＤＯＸ－ＮＢグループにおけるＤＯＸの細胞取り込みを、遊離ＤＯＸおよび対照グループのそれと比較した。図7では、DOX-NBとインキュベートしたMCF-7細胞の平均蛍光強度は、遊離DOXとインキュベートした細胞の自家蛍光よりもはるかに低く、キトサンNBへのDOXのカプセル化が細胞をDOXの取り込みとDOX-から保護できることを示しています。誘発された傷害。

DOXをロードしたNB（US1 0.5 W / cm ² ）によるMCF-7細胞でのDOX送達のフローサイトメトリー分析 30 s、US2 0.5 W / cm ² 60 s）

ただし、超音波照射により、DOX-NBとインキュベートしたMCF-7細胞でのDOX取り込みが著しく増加しました。 DOX-NBは、超音波照射の助けを借りて、より多くのDOXをMCF-7細胞に送達することができます。対照的に、遊離DOXとインキュベートしたMCF-7細胞でのDOX取り込みは、超音波照射下でわずかに増加しただけでした。結果は、DOX-NBとインキュベートしたMCF-7細胞におけるDOXの取り込みが、超音波照射下で遊離DOXとインキュベートした細胞の取り込みよりもはるかに高いことを示唆しました。

さらに、DOX-NBとインキュベートしたMCF-7細胞でのDOX取り込みは、照射時間が長くなるとわずかに増加しました。これは、DOX-NBの破裂が増加し、MCF-7細胞の膜に一時的な細孔が生成されたことが原因である可能性があります。

超音波照射によるDOX誘発腫瘍細胞の増殖とアポトーシスの増強

超音波支援DOX-NB送達の抗癌効果を調査するために、MCF-7細胞の生存率をCCK-8アッセイとフローサイトメトリーを使用して測定しました。結果は、DOX-NBsグループのMCF-7細胞の生存率が超音波なしのDOXグループのそれよりも高かったことを示しています。一方、DOX-NBsグループのMCF-7細胞の生存率は、局所超音波照射を行ったDOXグループの生存率よりも有意に低かった。 DOX-NBsグループの細胞生存率（21.0±2.2％、 p <0.01）は、超音波照射なしの遊離DOXグループよりもはるかに高く（6.4±0.7％）、ドラッグデリバリーベクターとして、NBがDOXによる血液循環の細胞増殖の低下を改善することを示唆しています。

さらに、細胞生存率の比率は、DOX-NBのみで処理された細胞（21.0±2.2％、 p <）と比較して、DOX-NB + USで処理された細胞（3.1±0.8％、2.2±0.9％）で有意に減少しました。 / i> <0.01）、遊離DOXのみ（6.4±0.7％）、および遊離DOX +超音波（4.1±0.8％、3.8±0.6％）（図8）。データは、DOX-NBs + USがMCF-7細胞におけるDOXの細胞毒性効果を有意に増強したことを示しました。 DOX-NBs + USグループは、MCF-7細胞において、遊離DOXおよび遊離DOX +超音波グループよりも高い細胞毒性を示しました。

異なるグループの細胞生存率の比較

遊離DOX +超音波群の細胞生存率（4.1±0.8％）は遊離DOX群のそれ（6.4±0.7％）よりも低かった。したがって、超音波はまた、遊離DOXで処理されたMCF-7細胞の生存率を低下させました。細胞生存率は、細胞をDOX-NBs +超音波（60 s）で処理した場合は2.2±0.9％であり、DOX-NBs +超音波（30 s）で処理した場合（3.1±0.8％）よりも低く、より長いパルス長（60秒）は、DOX-NBの配信においてより効率的でした。

さらに、MCF-7細胞のアポトーシスは、超音波照射の有無にかかわらず、遊離DOXまたはDOX-NB処理の6時間後にアネキシンV染色によって評価されました。遊離DOXの存在下でのアポトーシスMCF-7細胞の割合は4.4±0.9％でしたが、同様の比率が遊離DOXと超音波（30 s、60 s）で処理された細胞で観察されました。超音波支援DOX-NBの送達は、遊離DOXグループと比較してアポトーシス細胞の割合を有意に増加させました（45.7±1.1％対4.4±0.9％、 p <0.01）。さらに、超音波照射なしのDOX-NBsグループのアポトーシス細胞の割合は、遊離DOX治療グループのそれよりも低かった（3.2±0.9％対4.4±0.9％）。細胞生存率アッセイと一致して、これらのデータは、超音波支援DOX-NBs送達がDOXの抗癌効果を増強したことを示しました。