メラノーマ治療における標的パクリタキセル送達とイメージングのための¹³¹I標識PLGA-リピッドナノ粒子

要旨

葉酸（FA）共役ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）-リピッド複合体（FA-PL）を、難溶性抗がん剤パクリタキセル（PTX）の標的送達ナノキャリアとして開発し、FA-PLPナノ粒子を得た。さらに、放射性トレーサーとして¹³¹Iを用いてFA-PLPナノ粒子を標識（FA-PLP-¹³¹I）し、細胞取り込み活性、in vivo血中循環、生体分布を評価。FA-PLP-¹³¹Iナノ粒子は球状形態で優れた安定性、狭い粒径分布（165.6および181.2 nm）、平均ゼータ電位-22.1 mVを示した。共焦点レーザー走査顕微鏡で、標的分子FAがメラノーマB16F10細胞へのPLP-¹³¹I取り込みを促進することを確認、ガンマカウンターによる¹³¹I活性測定での細胞取り込み率でも裏付けられた。PTX非含有FA-PL-¹³¹Iは軽微な細胞毒性、良好な生体適合性示し、FA-PLP-¹³¹Iは遊離PTXおよびPLP-¹³¹I比で効率的な細胞生存率抑制を示した。静脈投与後、遊離PTXの血中半減期（t₁/₂=5.4±0.23 h）がFA-PLP-¹³¹Iで18.5±0.5 hに延長。FA標的化により、FA-PLP-¹³¹Iの腫瘍取り込みはPLP-¹³¹I比4.41倍、遊離PTX-¹³¹I比12.8倍高かった。さらに40日間治療後、FA-PLP-¹³¹Iは遊離PTXおよびPLP-¹³¹I比で改善された腫瘍増殖抑制効果示し、再発なし、顕著な全身in vivo毒性なし。結果は¹³¹I標識PLGA-リピッドナノ粒子が標的薬物送達とin vivo薬物追跡に同時適用可能であることを実証。

背景

最も攻撃的な皮膚がんの一つであるメラノーマは、メラノサイトの悪性転化に由来する[1,2]。容易な再発と高い転移可能性により、転移性メラノーマ患者の5年生存率はわずか10%。現在、メラノーマ患者の最も一般的治療は化学療法だが、望ましくない重篤な副作用、低バイオアベイラビリティ、貧弱な腫瘍選択性、用量制限的全身毒性を伴う[3,4]。

パクリタキセル（PTX）は、イチイ属（Taxus）の乾燥根、枝、葉、樹皮から得られる天然植物抽出物[5,6]で、卵巣癌や肺癌など複数腫瘍に有効な抗腫瘍活性示す[7-9]。またヒトメラノーマにも有効と報告[10,11]。しかし、上記化学療法薬の欠点に加え、臨床ではクリモフォールELと無水アルコール（1:1、v/v）混合物がPTX希釈媒体として用いられ、過敏症など重篤副作用誘発可能[12,13]。したがって、化学療法薬の水溶性と腫瘍蓄積性向上、末梢曝露低減、in vivo毒性最小化の新戦略開発が喫緊課題。近年の生体適合性薬物ナノキャリア開発はPTX生理的安定性向上の可能性提供[14-16]。さらに、標的分子をナノキャリアに共役化することで、腫瘍細胞表面受容体介在標的効果により化学療法薬を腫瘍部位に選択的送達、末梢曝露低減可能[17-19]。

本研究では、葉酸（FA：腫瘍標的分子）を共有結合で連結し、化学療法薬PTXをカプセル化したポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA）-リピッド複合体をメラノーマ治療用に調製。さらに、放射性マーカー¹³¹IでPLGA-リピッドナノ粒子を放射性標識し、in vivo挙動を明確評価。¹³¹Iは負のβ放出、物理的半減期、幅広い崩壊特性により臨床で一般的な放射性標識として使用[20-22]。¹³¹I標識PLGA-リピッドナノ粒子（FA-PLP-¹³¹I）の形態、安定性、分散性をin vitro評価。さらに、¹³¹I放射能測定によりFA-PLP-¹³¹Iの細胞取り込み、血中循環、生体分布を調査。また、FA-PLP-¹³¹Iの標的抗がん効果をin vitro/in vivoで検討。結果、FA-PLP-¹³¹Iが化学療法薬用潜在的腫瘍薬物送達ナノキャリアとして汎用性あるナノプラットフォームとなり得ることを示唆。

実験方法

材料

ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)（PLGA、MW: 5,000-15,000、ラクチド:グリコリド 50:50）とクロラミンTをSigma Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入。Na¹³¹IをAtomic Hitech（北京、中国）から入手。PTX（99%）と4',6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI）をAladdin Chemical Reagent Co., Ltd.（上海、中国）から購入。ホスファチジルコリン90-95%含有大豆レシチン、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[葉酸(ポリエチレングリコール)-2000]（DSPE-PEG₂₀₀₀-FA）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[カルボキシ(ポリエチレングリコール)-2000]（DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH）をAvanti（Alabaster, AL, USA）から入手。全細胞培養試薬をSigma Aldrichから購入。

FA-PLPナノ粒子の調製

FA-PLPナノ粒子を自己組織化ナノプレシピテーション法[23]で合成。詳細：PTX 10 mgをエタノール1 mLに溶解、PLGA 2 mgをジクロロメタン1 mLに溶解。混合後、レシチン/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA（4:1）エタノール水溶液（4 wt%）を4時間かけて室温で穏やかに撹拌しながら滴下添加。混合液を濾過し、ミリポア超遠心濾過チューブで脱イオン水で3回洗浄し、非担持薬と有機溶媒除去。対照として、DSPE-PEG₂₀₀₀-FAをDSPE-PEG₂₀₀₀-COOHに置換し同法でFA分子非グラフトナノ粒子調製。精製FA-PLPナノ粒子を4°C保存し後続実験使用。

¹³¹I標識FA-PLPナノ粒子の調製

放射性FA-PLP（FA-PLP-¹³¹I）ナノ粒子をクロラミンT酸化法[24]で調製。FA-PLP（1 mg/mL）1 mL、500 μCi Na¹³¹I（FA-PLPへグラフト可能最大放射能）、5 mg/mLクロラミンT 100 µLをpH 7.5リン酸緩衝液中で室温10分反応。反応を5 mg/mL亜硫酸ナトリウム200 µL添加で停止。¹³¹I標識PLPとPTXも同手順で調製。ミリポア遠心チューブで精製し、濾液でガンマ活性検出されなくなるまで遊離Na¹³¹I除去。ガンマカウンター（LKB gamma 1261; LKB Instruments）で放射性標識収率と純度分析。

特性評価

UV-vis吸収スペクトルをUV-vis分光光度計（UV7502、上海先進光電技術有限公司、上海、中国）で記録。透過型電子顕微鏡（TEM）像をZeiss LIBRA 120 TEMで取得。ナノ粒子のサイズ、ゼータ電位、分散指数（PDI）を動的光散乱（DLS）解析でZetasizer Nano ZS（Malvern Instruments）測定。光学写真をNikon D3200デジタルカメラで撮影。

細胞培養

マウスメラノーマ細胞株B16F10を中国科学院上海細胞バンク（上海、中国）から入手。DMEM（10%胎仔牛血清、100 U/mLペニシリン/ストレプトマイシン、5% CO₂、37°C、湿潤）で培養。

In vitro取り込みアッセイ

時間依存性in vitro取り込みアッセイで¹³¹I標識化合物の最適細胞結合効率時間決定[25]。B16F10細胞を24ウェルプレートに1×10⁵ cells/well播種、コンフルエントまで培養。放射性ヨード標識サンプル（¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I）をDMEM培地調製し各ウェル添加。0.5、1、2、4、6時間インキュベーション後、PBSで3回洗浄しガンマカウンター（中国科学院嘉支部イノベーション有限公司）で放射能測定。取り込み値（%）を先行文献[25]に従い算出。また、ナノ粒子を蛍光色素フルオレセインイソチオシアネート（FITC、Sigma）標識しB16F10細胞とインキュベート。細胞蛍光像を市販共焦点レーザー走査顕微鏡（FV1200、Olympus、東京、日本）で撮影。

In vitro細胞毒性アッセイ

MTT細胞生存率アッセイで対照ナノキャリアPL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹I、および遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹IのB16F10細胞に対する細胞毒性検討。B16F10細胞を96ウェルプレートに24時間播種、PL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹I（PLGA-リピッド0-100 μg/mL）、または遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I（PTX濃度0-40 μg/mL）曝露24時間。実験は三重測定。全データを平均±SDで表示。

動物モデル

3-5週齢Balb/cマウスを上海スラック実験動物有限公司（上海、中国）から購入。全動物実験は復旦大学動物ケア・使用委員会承認、NIH実験動物ケア・使用ガイドライン準拠。

B16F10細胞（1×10⁶）をPBS懸濁しマウス右側側腹部に皮下注射。カリパーで腫瘍体積測定、体積=(長径×短径²)/2で計算。腫瘍体積~80 mm³到達時、マウスを実験群へ無作為割付。

血中循環と生体分布試験

健常Balb/cマウスにPTX-¹³¹IとFA-PLP-¹³¹Iを静脈内注射（100 µL、10 μCi/マウス、5 mg/kg）。マウス尾部から約10 µL血液採取し血中循環測定。ガンマカウンターで血中放射能測定。ナノ粒子生体分布検出のため、B16F10腫瘍保持マウスにPTX-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹Iを同用量注射、24時間後屠殺。主要臓器を秤量回収しガンマカウント。

In vivo腫瘍化学療法

B16F10腫瘍保持Balb/cマウスに生理食塩水150 µL、遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹Iを注射（同PTX濃度、5 mg/kg）。カリパーで4日ごとに腫瘍サイズと体重測定。相対腫瘍体積をV/V₀（V₀は治療開始時腫瘍体積）で計算。約40日治療後、マウス屠殺し主要臓器回収、4%ホルマリン固定、パラフィン包埋・切片、ヘマトキシリン-エオシン染色、デジタル顕微鏡観察。

結果と考察

¹³¹I標識FA-PLPナノ粒子の調製と特性評価

FA-PLP-¹³¹Iナノ粒子合成スキームをFig.1に示す。簡略：FA-PLPナノ粒子を自己組織化ナノプレシピテーション法で合成、放射性FA-PLP（FA-PLP-¹³¹I）をクロラミンT酸化法で調製[23,24]。PTXをPLGA-リピッド複合体でカプセル化、PEGylationによりシェル表面に共有結合グラフトFA。最後に¹³¹Iをナノ粒子外表面にグラフト。TEM像でFA-PLP-¹³¹Iナノ粒子が球状形態、狭い粒径分布（165.6-181.2 nm）示し、動的光散乱で確認（Fig.2a, b）。ゼータ電位-39.1~-3.2 mV範囲（Fig.2c）。遊離PTXとFA-PLP-¹³¹I（同PTX濃度）のUV-visスペクトルで同一特徴ピーク233 nm示し（Fig.2d）、PTXがFA-PLP-¹³¹I内にカプセル化され、カプセル化がPTX吸光度に影響与えないこと示唆。計算上、FA-PLP-¹³¹I中のPTXカプセル化効率56.35±1.6%。PTX-¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹Iの放射性標識収率はそれぞれ45.6±2.3、52.1±4.1、48.9±1.9、56.3±2.5、54.8±2.7%。

FA-PLP-¹³¹Iナノ粒子の合成

a FA-PLP-¹³¹IのTEM像。b 粒径とc ゼータ電位（DLS解析）。d 遊離PTXとFA-PLP-¹³¹Iの吸収スペクトル

安定性はナノ粒子医療応用の必須要件[26]。4週間保存後、水、細胞培地、胎仔牛血清、PBS中のFA-PLP-¹³¹Iで平均サイズ、ゼータ電位、PDI指数に変化なし（Fig.3a-c）、優れた安定性と分散性示す。また、マウス血漿37°CでのFA-PLP-¹³¹I放射性標識安定性検出（Fig.3d）、7日以内に15%未満の脱ヨウ素化。

a, b 水、DMEM、PBS、胎仔牛血清（FBS）等異なる媒体でのFA-PLP-¹³¹Iコロイド安定性とc PDI試験。d マウス血漿37°CでのFA-PLP-¹³¹I放射性標識安定性曲線、保存2週間以内

In vitro細胞取り込み

Fig.4にガンマカウンター測定によるB16F10細胞での¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹Iの時間依存性取り込み示す。FA-PLP-¹³¹IとFA-PL-¹³¹Iが全測定時点で他試料より高い取り込み値示し、時間とともに増加。FA-PLP-¹³¹Iの6時間取り込み値は¹³¹I比3.12倍、PLP-¹³¹I比23.4倍高く、フルオレセイン標識FA-PLP-¹³¹IとPLP-¹³¹Iナノ粒子でインキュベートしたB16F10細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡像（追加ファイル1: Figure S1）と一致。これら結果はFA-PLP-¹³¹Iの高い細胞取り込み示し、B16F10細胞へのFA介在標的効果に起因すると考えられる。

B16F10細胞での¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹Iの時間依存性取り込み

In vitro細胞毒性

対照ナノキャリアPL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹Iの細胞毒性をMTTアッセイで検証。24時間処理後、PL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹I処理細胞の生存率は対照と類似（Fig.5a）、良好な生体適合性示す。また、FA-PLP-¹³¹Iは同PTX濃度で遊離PTXとPLP-¹³¹IよりB16F10細胞増殖抑制効果高い（Fig.5b）、優れた細胞標的化学療法示す。結果、FA-PLP-¹³¹Iが放射線毒性・細胞毒性なしに高い化学療法効果持つこと実証。

a 24時間PL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹I処理後のB16F10細胞生存率。b 遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I異なる濃度24時間インキュベート後のB16F10細胞生存率

血中循環と生体分布試験

放射性標識はナノ粒子in vivo定量的・正確追跡で蛍光イメージングより信頼性高いと報告[27,28]。¹³¹I標識FA-PLPナノ粒子を調製し、ガンマカウンター測定で血中循環と生体分布含むin vivo挙動調査。遊離PTX血中半減期（t₁/₂=5.4±0.23 h）がFA-PLP-¹³¹Iで18.5±0.5 hに延長（Fig.6a）、ナノ粒子カプセル化によるもので腫瘍標的蓄積に有利[29-31]。次に、B16F10腫瘍保持マウスでの遊離PTX-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I生体分布を注射1日後調査（Fig.6b）。FA-PLP-¹³¹IとFA-PL-¹³¹Iが明確な腫瘍取り込み増強示し、それぞれPLP-¹³¹I比4.41倍、遊離PTX-¹³¹I比12.8倍。これはFA-PLP-¹³¹IとFA-PL-¹³¹Iの血中循環延長とFA標的効果起因と考えられる。また、肝臓と脾臓もナノ粒子代謝による正常代謝臓器として比較的高い取り込み示す[32,33]。

a 静脈内注射後FA-PLP-¹³¹I血中循環曲線。b B16F10腫瘍保持マウスでのPTX-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I、PLP-¹³¹I生体分布

In vivo腫瘍化学療法

遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I処理群で生理食塩水対照群比腫瘍増殖抑制観察（Fig.7a）。全体として、約40日治療後、全処理群中FA-PLP-¹³¹Iが再発なしで最も効果的に腫瘍増殖抑制。予想通り、FA-PLP-¹³¹Iの血中循環有意延長とFA介在腫瘍標的蓄積促進起因。さらに腫瘍標的蓄積はPTX末梢曝露低減し全身毒性最小化。予想通り全治療期間で体重減少認めず（Fig.7b）、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓含む主要臓器で全群明確な組織学的病変なし（Fig.7c）。

a 相対腫瘍体積とb 体重（生理食塩水対照、遊離PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I尾静脈注射後）。b 体重...（重複）。c 心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓含む主要臓器の代表的ヘマトキシリン-エオシン染色像。スケールバー=100 µm

結論

要約すると、メラノーマ標的化学療法用薬物送達キャリアとして¹³¹I標識PLGA-リピッドナノ粒子を合成。¹³¹I放射能測定によりFA-PLP-¹³¹Iナノ粒子のin vitro/in vivo挙動を研究。得られたFA-PLP-¹³¹Iは優れた分散性、コロイドおよび放射性標識安定性示す。対照ナノキャリアPL-¹³¹IとFA-PL-¹³¹Iも良好な生体適合性。PTXカプセル化後、FA-PLP-¹³¹IはFA標的効果により細胞毒性なしでB16F10細胞増殖抑制最も効果的。さらにFA-PLP-¹³¹IはPTX血中循環有意延長し標的腫瘍領域へ効果的蓄積。thus, FA-PLP-¹³¹Iは優れた腫瘍増殖抑制と優れたin vivo生体適合性示す。結果は汎用性あるFA-PLP-¹³¹Iナノキャリアが信頼性ある薬物追跡剤として、また腫瘍標的療法への応用可能性を強調。