革新的ヌクレオシド-リピッドナノキャリアによるソラフェニブ送達の向上と毒性低減

概要

チロシンキナーゼ阻害剤であるソラフェニブのがん治療への応用は世界的に標準的な化学療法オプションであるが、この薬剤の低水溶性（< 5 μM）、毒性、副作用といった課題を解決する新たな戦略が必要とされている。この文脈で、ナノキャリアの利用がこれらの欠点を克服するために現在研究されている。本稿では、ハイブリッド・ヌクレオシド-リピッドで安定化された新タイプのソラフェニブベースナノ粒子を報告する。固体リピッドナノ粒子（SLN）は、ヌクレオシド-リピッドの電荷に応じて負または正のゼータ電位を示した。透過型電子顕微鏡観察により、ソラフェニブ負荷SLNは約200 nmの平行六面体ナノ粒子であることが明らかになった。肝臓がんと乳がんを含む4種類の細胞株を用いた生物学的検討の結果、ソラフェニブベースSLNは遊離薬剤と比較して抗がん活性が向上していた。重要なことに、高濃度ソラフェニブ（> 80 μM）を含むSLNでがん細胞を培養した後の位相差顕微鏡像では、すべてのケースでがん細胞が完全に死滅していた。これらの結果は、ヌクレオシド-リピッドベースSLNが薬物送達システムとしての潜在性を有することを強調している。

背景

ネクサバール™の商品名で販売されているソラフェニブは、疎水性のキナーゼ阻害剤[1]であり、進行性腎細胞がん（RCC）[2]、肝細胞がん（HCC）[3]、進行性甲状腺がんの治療に承認されている。ソラフェニブには透過膜受容体、細胞内チロシンおよびセリン/スレオニンキナーゼなどの複数の標的タンパク質キナーゼがあり、アポトーシスを誘導することも示されている。作用機序として、ソラフェニブは腫瘍血管新生（VEGFRおよびPDGFRシグナル阻害を通じて）および腫瘍細胞への直接作用により、多標的に腫瘍増殖を抑制すると報告されている[4, 5]。メラノーマ[6]、甲状腺[7]、膵臓[5]、肝細胞がん、白血病[8]など多くの組織学的がん種で悪性細胞増殖抑制効果が実証されている。しかし、低水溶性、毒性、副作用がソラフェニブの多くの臨床応用を制限している。これらの問題に対処するため、液晶ナノ粒子[11]、ナノエマルション[12]、シクロデキストリン修飾多孔性シリコンナノ粒子[13]、薬物溶出ナノコンポジット[14]、ポリエレクトロライトベースナノ粒子[15]、クルクミン自己組織化ナノ粒子[16]など、いくつかのソラフェニブ製剤が現在研究中である。しかし、ソラフェニブを負荷したリピッドナノ粒子（LN）はあまり研究されていない[17, 18]。

本稿では、ヌクレオシド-リピッド[20-22]で安定化されたソラフェニブベース固体リピッドナノ粒子（SLN）[19]の最初の例を報告する。クロマトグラフィー研究により、正負に帯電したヌクレオリピッド（DOTAUとdiC₁₆dT）が薬物送達応用に必要な安定性と純度を持つことが示された[23, 24]。シンプルなナノプレシピテーション法により、正電荷（SLN⁺）または負電荷（SLN⁻）を持つSLNが形成される（図1）。調査したすべてのSLNが、異なるヒト癌腫に対するソラフェニブの細胞毒性効果を増強し、水溶性と抗がん活性の面からソラフェニブの限界を克服できることを示している。

SLN製剤の模式図。陰イオン性ヌクレオチド-リピッドであるチミジン3'-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸)（diC₁₆dT）、陽イオン性ヌクレオシド-リピッドDOTAU（2',3'-ジオレイル-5'-デオキシ-5'-トリメチルアンモニウム-ウリジン）、本研究で使用したソラフェニブの化学構造（左）。ナノプレシピテーションにより得られる平行六面体形状のSLNの模式図（右）。ヌクレオリピッド（diC₁₆dTまたはDOTAU、それぞれSLN⁻とSLN⁺に対応）とソラフェニブを用いる。模式表現はDOTAUソラフェニブ負荷ナノ粒子を示す透過電子顕微鏡（TEM）像から適応（インセット、バー500 nm）

方法

化学試薬

メタノール（MeOH）、ギ酸（FA）、ギ酸アンモニウム（AFNH₄）はVWR Chemicals（フランス）製で、すべてHPLCグレード。HPLCグレード水（最低抵抗率18.2 MΩ）はELGA Milliporeシステム（フランス）で自家製。DOTAU（CAS番号：868226-06-6）とdiC₁₆dT（CAS番号：1160002-70-9）は文献[23-25]のプロトコルに従い自社で合成。ソラフェニブ、4-[4-[[4-クロロ-3-(トリフルオロメチル)フェニル]カルバモイルアミノ]フェノキシ]-N-メチルピリジン-2-カルボキサミド（CAS番号：284461-73-0）はSynVec https://synvec.fr（Ref# D114250414）から購入。

クロマトグラフィー研究

ヌクレオリピッド（DOTAUとdiC₁₆dT）およびソラフェニブのSLN中での定量のため、逆相UHPLC（超高速液体クロマトグラフィー）法を開発した。HPLC注入前に、ナノ粒子水溶液をエタノールで5倍および10倍に希釈し、それぞれヌクレオリピッドとソラフェニブを定量した。

Dionex-Thermo Scientific（米国）製UHPLC UltiMate 3000クロマトグラフィーシステムを使用。四元バルブシステムによるカラム選択機能付きポンプ、サーモスタット付きオートサンプラー、サーモスタット付きカラム室で構成。分離にはSyncronis C18カラム（50 × 2.1 mm、1.7 μm）を用いた。移動相は70/30 MeOH/25 mM酢酸アンモニウム（pH 7.4）（A）と26.5 mM酢酸アンモニウム/MeOH（pH 7.9）（B）。流量0.2 mL/min、勾配プロファイル：0-2分 0-100% B、2-20分 100% B。カラム温度25 °C。検出波長はソラフェニブとdiC₁₆dTで267 nm、DOTAUで257 nm。注入量1 μLで、ソラフェニブ0.6 ng、両ヌクレオリピッド15 ngの定量限界を達成。ソラフェニブ、DOTAU、diC₁₆dTのエタノール中標準曲線は追加ファイル1：図SI1、SI2、SI3に示す。

ソラフェニブナノ粒子の調製

ソラフェニブ10 mgをエタノール1 mLに溶解し、ヌクレオリピッド（diC₁₆dTまたはDOTAU）10 mgをエタノール1 mLに溶解させた。ヌクレオリピッド溶液100 μL、ソラフェニブ溶液100 μL、エタノール800 μLを室温で混合し、磁気攪拌下で蒸留水10 mLに滴下添加した。溶液を25 °Cで90分間超音波浴にかけた。エタノールを30 °Cで減圧除去し、体積を1 mLに調整。この溶液を6 mm超音波プローブ（Vibracell 75186）で10分間、振幅100%、パルス2秒/5秒で2回超音波処理した。1 mLを蒸留水30 mLに対して3回×15分間透析した。体積を2 mLに調整し、特性評価、定量、安定性試験用に保存。また、ヌクレオリピッドなしで同じプロトコルで対照実験を行った。

透過型電子顕微鏡（TEMおよびEDX）

ナノ粒子をネガティブ染色法で観察。ナノ粒子懸濁液10 μLをカーボン被覆銅グリッドに10分間置き、乾燥後、水中2.5%（w/w）酢酸ウラニルで2分間染色した。試料を日立H-7650電子顕微鏡で観察。エネルギー分散型X線分光法は、Quantax-X-Flash SVE 6を搭載したTECNAI透過型電子顕微鏡で実施。

粒子サイズとゼータ電位測定

粒子ゼータ電位とサイズはZetasizer NanoZS（Malvern）で測定。ナノ粒子40 μLを水400 μLに希釈し、25 °Cで測定。

細胞毒性解析

HuH7とHepG2はDMEM-Glutamax（10%胎仔牛血清添加）で単層培養。MDA-MB-134とT-47DはRPMI（10%胎仔牛血清添加、T-47Dのみ非必須アミノ酸1X、グルコース0.45%、インスリン10 mg/L、ピルビン酸ナトリウム1X）で単層培養。すべての培養試薬はInvitrogen製。96ウェルプレートに10⁴ cells/wellを90 μL完全培養液で播種し、37 °C、5% CO₂で24時間培養後、SLNまたはソラフェニブ10 μLを培養液に添加。ソラフェニブ（CAS番号：284461-73-0）は0.1% DMSO含有培養液に溶解。これらの条件下では、沈殿なしの遊離ソラフェニブ最大濃度は5 μMであるのに対し、ソラフェニブ負荷SLNではDMSOなしで最大120 μMまで試験可能。4日間培養後、ホルマザンベース増殖アッセイ（CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit、Promega）で細胞生存率を評価。各ウェルに試薬溶液20 μLを添加し、37 °C、5% CO₂で30分間インキュベート後、Berthold分光光度計で492 nmの吸光度を測定。結果は以下の式で生存率（%）として表現：\(\frac{{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{treated}\ \mathrm{cells}-{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}}{{\mathrm{OD}}_{492}\mathrm{of}\ \mathrm{untreated}\ \mathrm{cells}-{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}}\)。

細胞生存率試験

HuH7を「細胞毒性解析」節と同様に培養。ソラフェニブ負荷SLN⁺を様々な濃度（0、1、5、10、25、50、100 μM）で4日間インキュベート後、ライブ/デッド細胞生存アッセイ（Invitrogen）で細胞生存率を測定。簡単に言うと、培養液を除去し、付着細胞をHanks平衡塩液（HBSS）で1回洗浄。2 μM カルセインアセトキシメチルエステルと4 μM エチジウムホモマー-1を含むHBSS 200 μLを各ウェルに添加し、37 °C、5% CO₂で45分間インキュベート。染色後、HBSSで1回洗浄し、倒立蛍光顕微鏡で顕微鏡観察。死細胞割合は蛍光活性細胞ソーティング（FACS）解析で評価。4 μMエチジウムホモマー-1溶液で染色後、トリプシン処理し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で遠心分離（1000 rpm、5分）により2回洗浄。BD製LSRFortessaフローサイトメーターでデータ取得し、DIVAソフトウェアで解析。70%メタノールで処理した死細胞サンプルを対照とした。

結果と考察

SLNの合成と特性評価

ヌクレオリピッドの無毒性と自己組織化特性は、ソラフェニブのような疎水性薬物のカプセル化に理想的な両親媒性アジュバントとなる。本研究では、ソラフェニブの低水溶性という特性に対処し、多くの場合その臨床使用を制限している抗がん活性を向上させるため、シンプルなナノプレシピテーション法を開発した。水溶性について、ソラフェニブの疎水性、複素環、水素結合機能がヌクレオリピッドとの相互作用とナノオブジェクト形成を促進すると仮定した。また、ソラフェニブ負荷SLNは、ソラフェニブの細胞内取り込み量を増やすことで抗腫瘍活性を高めると期待された。実際、以前のシスプラチンナノ粒子に関する研究で、シスプラチンの抗腫瘍活性増強ががん細胞内への薬物内在化量増加によるものであることを実証している[23][1]。ナノプレシピテーションプロセスは3ステップ：(i) ソラフェニブを40 °Cでエタノールに溶解（10 mg/mL、100 μL）し、等当量のヌクレオリピッド（陰イオン性ヌクレオチド-リピッドdiC₁₆-3'-dT[チミジン3'-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-リン酸)]または陽イオン性ヌクレオシド-リピッドDOTAU[23][2',3'-ジオレイル-5'-デオキシ-5'-トリメチルアンモニウム-ウリジン]、エタノール中10 mg/mL、100 μL）を添加；(ii) エタノール溶液1 mLを室温で蒸留水10 mLに滴下添加；(iii) その結果得られた懸濁液を蒸発させ余分なエタノールを除去し、超音波処理した。

クロマトグラフィー研究

新規製剤の薬物負荷能力を評価するため、逆相UHPLC法を開発した。このHPLC法により、ソラフェニブとヌクレオリピッドの同時分離が12分で達成され、SLN中の化合物の個別定量が可能になった（追加ファイル1：図SI1-4）。

ソラフェニブ/ヌクレオリピッドの質量比である負荷率は、ソラフェニブ/DOTAU製剤（SLN⁺）で50%、ソラフェニブ/diC₁₆dT製剤（SLN⁻）で80%を達成。ソラフェニブの封入収率はそれぞれ約55%と75%であった。ヌクレオリピッドなしで行った対照実験では、ソラフェニブの約90%が製剤の各工程で失われた。これはおそらくソラフェニブの水中低溶解性によるもの。この結果は、ヌクレオリピッドがソラフェニブの溶解とSLNの安定化に必要であることを示している。

物理化学的研究

動的光散乱（DLS）実験によりSLN形成を評価。正負両方のヌクレオリピッド（diC₁₆dTとDOTAU）が水溶液中で類似した非球形の平行六面体ナノ粒子を形成し、単分散性（ポリ分散性指数PDI = 0.202と0.289、サイズ = 335.2と304.4 nm、それぞれ図2および追加ファイル1：図SI7）。予想通り、SLNベースオブジェクトのゼータ電位はヌクレオリピッドの極性ヘッドに依存（ζ = +59.1 mVと-54.9 mV、SLN⁺とSLN⁻、追加ファイル1：図SI10）。TEMイメージングとSLN⁻のEDX取得によりナノ粒子中のソラフェニブ存在を検証。図2e、fにスポットIとIIを示す。図2fのスポットIは塩素原子の発光（スポットI、図2e、f）を示し、ソラフェニブの存在を示唆（図2fの化学構造参照）。塩素はスポットIにのみ存在し、スポットIIには存在しない（図2f）。

SLNの特性評価。DOTAUによるソラフェニブナノ粒子の形態を示す透過電子顕微鏡（TEM）像（a）とインセット（b）。サイズ327×172 nmのDOTAUベースSLNの例（矢印）、DLSで測定された平均サイズ304 nmを確認（d）。c diC₁₆dT-SLNを示すTEM像の例（矢印、それぞれ330×500 nm）。(e) SLN⁻のTEM像。I & IIスポットはEDX取得を行った位置。(f) I & II位置でのEDXスペクトル。破線は塩素原子の発光を強調、Iにのみ存在。ソラフェニブ分子の化学構造も提示。両スペクトルはTEM銅グリッド由来のCu原子発光（8 keV）で正規化

重要なことに、対照実験ではヌクレオリピッドなしでソラフェニブをナノプレシピテーションしてもナノオブジェクトは生成されず、ヌクレオリピッドがSLNの形成と安定化を可能にすることを実証した。

安定性研究

SLN⁺とSLN⁻のコロイド安定性をDLSとゼータ電位で2温度で測定（図3aおよび追加ファイル1：図SI10）。diC₁₆dTベース製剤の場合、SLN⁻のサイズは4 °Cと37 °Cの両方で30日後も変化せず、これらのナノ粒子の高い安定性を示す（追加ファイル1：図SI9）。この安定性は、diC₁₆dTとソラフェニブ間の相互作用（水素結合、π-πスタッキング、電荷/電荷相互作用）の性質で説明できる。一方、DOTAUベース製剤では、SLN⁺はDLS研究により4 °Cで30日間安定であった（図3a）が、37 °CではサイズとPDIの増加が観察された（図3a）。SLN⁺で37 °Cで観察されたこの相対的な不安定性は、ソラフェニブとDOTAUの両方の正電荷間の斥力クーロン相互作用で説明できる。興味深いことに、コロイド安定性研究は、SLNの安定化に用いるヌクレオリピッドによって、生理環境へのソラフェニブの安定性、ひいては放出速度を変調可能であることを示している。この安定性変調は、必要とされる放出キネティクスに応じて魅力的となり得る。

SLNの安定性研究。SLN⁺のコロイド安定性（a）とSLN⁺中のソラフェニブとDOTAUの経時的化学安定性（4 °Cと37 °C）（b）。PDI、ポリ分散性指数

コロイド安定性と並行して、新しいクロマトグラフィー法を用いて（追加ファイル1：図SI4参照）、SLNベース製剤中のソラフェニブ、DOTAU、diC₁₆dTの化学安定性を4 °Cと37 °Cで経時的に調査。両温度での動力学研究を図3bおよび追加ファイル1：SI5に示す（DOTAU-SLNとdiC₁₆dT-SLNそれぞれ）。結果は、SLN⁻の場合、ソラフェニブとdiC₁₆dT分子が両温度で少なくとも1ヶ月間安定であり、長期的な化学安定性を示す。一方、SLN⁺製剤では経時的にDOTAUの減少が観察された。まず4 °Cでは、7日間で約12%、30日間で20%の損失。温度上昇ではDOTAU安定性が低下し、37 °Cでは7日間で55%、30日間で最大95%の損失。このようなヌクレオリピッド間の化学安定性の違いは、以前の安定性研究でもすでに示されていた（追加ファイル1：図SI6参照）。

生物学的研究

SLNの細胞毒性を細胞の代謝活性と形態で評価。MTTアッセイにより、遊離ソラフェニブ（0.1% DMSO中）と薬剤負荷SLN（図4）を、2種の肝細胞がん（HuH7、HepG2）と2種のルミナルB型乳がん（MDA-MB-134、T-47D）の4細胞株で比較。まず、遊離ソラフェニブの最大溶解度に近い濃度（遊離ソラフェニブ5 μM、ソラフェニブ/DOTAUナノ粒子2.8 μM、ソラフェニブ/diC₁₆dTナノ粒子4 μM）では、両SLNとも遊離ソラフェニブより細胞生存率をより強く抑制した。図4bに示すMDA-MB-134細胞での細胞生存率試験では、遊離ソラフェニブの活性が水溶性によって制限される（[ソラフェニブ] = 5 μMで細胞生存率100%）のに対し、SLN⁺とSLN⁻でそれぞれIC₅₀値15 μMと50 μMが観測された（図4b）。HuH7でのFACS研究では、約50 μMのIC₅₀が得られた（追加ファイル1：図SI12、SI13）。位相差顕微鏡像では、未処理またはソラフェニブ処理細胞と比較して、SLN⁻およびSLN⁺処理細胞層の密度が低下しており、細胞形態に変化はない（追加ファイル1：図SI11）。次に、より高濃度のSLN（[ソラフェニブ] = 120 μMと84 μM、SLN⁻とSLN⁺それぞれ）で同様の実験を行い、遊離ソラフェニブの溶解度限界（5 μM）と比較した。これらの条件下では、両SLNとも4つのがん細胞株に強い細胞毒性効果を示した（図5）。位相差顕微鏡像では、SLN⁻（図5C1-4）とSLN⁺（図5D1-4）で細胞破片が観察され細胞死を示唆するのに対し、遊離ソラフェニブ（図5B1-4）では細胞が生存している。ルミナルB型乳がん細胞（図5C1-2およびD1-2）で両SLNの強い抗腫瘍効果が観察されたことは注目に値する。これまで報告されていなかったこの抗腫瘍効果は、SLNのおかげでソラフェニブの新たな治療応用の可能性を開く。

ソラフェニブまたはSLNの細胞毒性効果。 a 遊離ソラフェニブまたはソラフェニブSLNの細胞毒性比較（4細胞株：2ルミナルB乳がん、2肝細胞がん）。MTSアッセイで3ウェルずつ定量。遊離ソラフェニブ5 μM、NPソラフェニブ/DOTAU（SLN⁺）2.8 μM、NPソラフェニブ/diC₁₆dT（SLN⁻）4 μM。 b 遊離ソラフェニブ（溶解度限界）、SLN⁺（グレー）、SLN⁻（黒）存在下での細胞生存率アッセイ（MDA-MB-134細胞）

対照、遊離ソラフェニブ、SLN間の細胞形態比較。4種のヒト癌細胞株（肝細胞がんHuH7、HepG2、ルミナル乳癌MDA-MB-134、T-47D）における様々な条件下の細胞毒性を示す位相差顕微鏡像。A) ソラフェニブなし（対照実験、A1-A4はMDA-MB-134、T-47D、HuH7、HepG2細胞株）。B) 5 μM遊離ソラフェニブ存在下で4日間培養。C、D) SLN⁻およびSLN⁺存在下で培養（ソラフェニブ濃度としてそれぞれ84 μMと120 μM）

結論

ソラフェニブの効率的なカプセル化と送達を可能にするヌクレオリピッドベースの新規アプローチを報告する。本研究は、ソラフェニブを高負荷した2タイプの固体リピッドナノ粒子（SLN）の形成を実証した。これらのSLNは負または正のゼータ電位を示し、平行六面体形状を有する。DLSとHPLC研究により、SLNの安定性は使用するヌクレオリピッドによって変調可能であることが明らかになった。重要なことに、SLN⁺とSLN⁻の両製剤は、ソラフェニブの水溶性を劇的に向上させる（濃度120 μM以上）。このようなSLNは、水中での溶解性不足によって制限される遊離ソラフェニブと比較して、4つのがん細胞株（肝臓がんと乳がん）でより優れた抗腫瘍活性を示す。4つのがん細胞株で記録された位相差顕微鏡像は、120 μM SLN⁻または84 μM SLN⁺でインキュベートした際に劇的な細胞死を示す。したがって、この薬剤は肝臓がん（ソラフェニブの動注化学療法への使用など）や乳がんの新たな治療選択肢となり得る。我々の知る限り、本報告はルミナルB型乳がんに対するソラフェニブの使用を示した最初の研究であり、SLNアプローチの有用性を実証している。総じて、本稿で報告された結果は、ヌクレオシド-リピッドベースSLNが薬物送達システムとしての潜在性を有することを強調している。

略語

AFNH₄:

ギ酸アンモニウム

DLS:

動的光散乱

FA:

ギ酸

HCC:

肝細胞がん

HPLC:

高速液体クロマトグラフィー

LNs:

リピッドナノ粒子

MeOH:

メタノール

PDI:

ポリ分散性指数

RCC:

腎細胞がん

SLNs:

固体リピッドナノ粒子

UHPLC:

超高速液体クロマトグラフィー