HIV-p24抗原をナノセンシングするための水酸化カリウム処理ポリスチレンELISA表面でのアミン-アルデヒド化学結合

背景

人間の寿命を延ばし、より健康的な生活をサポートするために、医療診断の分野では、無傷の病原体上の疾患バイオマーカーと表面抗原の検出が必要です。病原体や癌を含む生命を脅かす病気を診断するために、さまざまな検出システムが利用可能です[1,2,3,4]。プローブとセンシング戦略の範囲は、いくつかの病気を特定することが示されています[5、6]。これらの結果の中で、酵素免疫測定法（ELISA）は、HIVを含む主要な疾患を検出および診断するための確立された戦略であり、ELISAは品質管理テストと見なされています[7、8、9、10]。イムノアッセイとして、ELISAは適切な抗体を使用して抗原を検出します。この役割を果たすために、抗原はポリスチレン（PS）表面に固定化され、次にパートナー抗体（一次抗体）と相互作用し、続いて結合酵素と結合できる宿主特異的抗体（二次抗体）と相互作用します。一次抗体。最後に、これらの分子相互作用は適切な基板によって監視されます。研究者は、検出を改善するために適切なポリおよびモノクローナル抗体またはアプタマー-抗体の組み合わせを用いたサンドイッチ法を含む、さまざまなELISAベースのアプローチを使用しています[11、12、13、14]。

ELISAの感度は、抗原と抗体間の相互作用、温度、pH、PS表面への抗原付着の効率などのパラメーターに依存します。これらの要因の中で、PSプレートへの抗原または抗体の固定化は、検出限界を改善する上で重要な役割を果たします。さらに、PS表面でのタンパク質の付着と不均一な分布によってもたらされる制限は、アッセイの感度に大きく影響します[5]。タンパク質を適切に固定化することでより多くの量を得ると、PS表面で正しい配向を達成し、検出を改善できる可能性があります。 PS表面にタンパク質を適切に固定化するために、さまざまな戦略が採用されています。タンパク質または抗体は、化学的または物理的吸着または静電相互作用によってPSプレートに固定化する能力があります。 Bora etal。 [15]光化学を使用してPS表面にタンパク質を固定化し、未処理の表面と比較して最大1.5〜2倍の改善が見られました。別の研究では、ポリビニルベンジルラクトノイルアミド（PVLA）と呼ばれるポリマーを使用したPSプレートへのタンパク質の効率的な固定化が示されました[16]。ポリエチレングリコール（PEG）ベースのポリマーは、センシング表面への生体分子の効率的な固定化も提供します。ラクシュミープリヤ他[17]は、金でコーティングされた表面に2つのポリマー（PEG-b-PAAcおよびN6-PEG）とともにチオール化オリゴマーを固定化することにより、凝固タンパク質第IX因子の検出を改善しました。

ELISAプレート表面では、PSは各炭素にペンダントベンゼン環を持つ脂肪族炭素鎖で構成されており、疎水性の表面を提供します。 PS表面のカルボキシル基は、露出したアミン基との静電相互作用を介して抗原または抗体に結合します。ただし、この結合戦略には、タンパク質の結合が低く、分子の位置が不規則であるなどの欠点があります。アミノ酸組成の数が少ない、より小さなサイズのタンパク質およびペプチドは、より少ないエピトープの利用可能性のために、PS表面に結合するのが特に困難です。さらに、センシング基板上の分子が密集している場合、プローブ間の距離が乱れすぎて、真の相互作用を行うことができないことが示されています。そのため、PSプレート上のタンパク質または抗体の結合を適切な方向に増やすと、検出限界が向上します。一般に、タンパク質はELISA表面に直接固定化されており、研究者はELISA表面へのタンパク質の固定化を改善して高性能検出を開発することに焦点を当てています。特に、PS表面での化学的機能化によるタンパク質の固定化は、この戦略を改善するために数人の研究者によって観察されています。アミンベースの化学修飾は、適切な架橋剤を介してさまざまな抗体を固定化するのに効果的です。 3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）は、アミンで使用するために検出面を変更するために一般的に使用されます。抗体は、そのCOOH基を介してアミン修飾APTES表面に固定化できます。ただし、タンパク質の固定化は、抗体のようにアミン表面に直接リンクすることはできません。特に、小さいサイズのタンパク質には適切な架橋剤が必要です。ここでは、APTESとグルタルアルデヒド（GLU）による化学修飾を使用したタンパク質の簡単なステップ固定化を紹介しました。アミン修飾表面にタンパク質を共有結合で固定化し、GLUを使用して結合しました。 GLUは、化学式CH ₂ の有機化合物です。 （CH ₂ CHO） ₂ 、そしてそれは最も効果的なタンパク質架橋剤の1つであることがわかっています[4、18、19、20]。末端に2つのアルデヒド基があります。一方の端はアミン修飾ELISA表面に結合し、もう一方の端はタンパク質または抗体に自由に結合します。一般に、ELISA表面に存在するアミンの数が少ないため、ELISA表面に小さいサイズのタンパク質またはペプチドを固定化することは非常に困難です。化学的機能化戦略では、より小さなサイズのタンパク質またはペプチドを使用して、ELISAPSプレートに材料を強力に固定化する可能性があります。私たちの方法では、リンカーとしてAPTES-GLUを使用しました。この修飾を使用することにより、あらゆるタイプの抗体、タンパク質、およびペプチドを固定化できます。この戦略の下での信号と感度の向上は、過去に調査された他の化学的戦略と比較して高くなっています[3、4]。

これらの化学物質の利点を実証するために、HIV感染の初期段階で発現する主要なヒト免疫不全ウイルス（HIV）タンパク質（p24）の1つを検出することを選択しました。 p24抗原はウイルスコアで構成されており、感染の最初の週に高レベルで存在します。したがって、HIVを早期に検出するために、p24を使用して高感度のシステムを生成することが理想的です。本明細書において、ｐ２４の検出は、上記の化学的に修飾されたＥＬＩＳＡ表面を使用して生成された。この化学的機能化戦略により、PS ELISA表面でのp24検出が数倍改善され、他の重要な臨床バイオマーカーの検出に推奨される可能性があります。

材料と方法

試薬と生体分子

組換えHIV-p24およびTatタンパク質とp24抗体は、Abcam（マレーシア）から購入しました。 3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）、グルタルアルデヒド（GLU）、およびヒト血清は、Sigma-Aldrich（USA）から購入しました。抗マウスIgG結合西洋ワサビペルオキシダーゼ（抗マウス免疫グロブリンHRP）は、Thermo Scientific（USA）から入手しました。 ELISAプレートはBectonDickinson（フランス）から調達した。 ELISA 5XコーティングバッファーはBiolegend（UK）から入手しました。ウシ血清アルブミン（BSA）およびHRP基質[3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）]は、Promega（USA）から入手しました。分析ELISAリーダーは、Fisher Scientific（マレーシア）から入手しました。

PS表面での機能化に最適なAPTESおよびGLUレベル

PS表面で使用するAPTESおよびGLUレベルの最適化は、ターゲットのHIVp24抗原を使用して実行されました。 APTESとGLUの適切な濃度を決定するために、ELISA表面を最初に1％水酸化カリウムで10分間活性化しました。次に、3つの異なる量のAPTES（0.5、1、および2％）をELISA表面に結合させ、室温（RT）で一晩インキュベートしました。その後、2つの異なる量のGLU（1および2％）をアミン修飾PS表面に適用しました。その時点で、250 nMの濃度のHIV-p24をGLU修飾表面に結合させ、残りのGLU表面を2％BSAでブロックしました。 p24抗体を1：1000希釈で導入し、抗マウスIgG-HRPをp24抗体に結合させました。最後に、これらの相互作用は、HRPの基質（3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン、TMB）を追加することによって監視されました。最適量の基質（100 mM）を加えた後、ELISAリーダーで405nmの吸光度を読み取りました。対照実験は、標的HIV-p24の非存在下で実施されました。

アミングループへのアルデヒド結合の最適化

GLUがアミン修飾表面を結合するための適切なインキュベーション時間を決定するために、2つの異なるインキュベーション時間が観察されました。 ELISA PS表面をAPTESで修飾した後、GLUを3時間固定化し、独立して一晩インキュベートした後、250nMのHIV-p24抗原をGLU修飾表面に固定化しました。残りの手順は、前の実験で示したように実行されました。

GLU修飾表面上のHIV-p24抗原とGLUプレミックスHIV-p24抗原付着の比較検出

ELISA表面でHIV-p24抗原を検出するために、GLUを使用した2つの異なる表面修飾アプローチを比較しました。最初の方法（方法1：アミン-GLU-p24）では、PS表面を最初に2％APTESを使用してアミンで修飾し、2％GLUを表面に添加してプレート表面をアルデヒド基でつなぎ、次に100 nMHIV-p24抗原が追加されました。 2番目のアプローチ（方法2：アミン-GLUプレミックスp24）では、表面をアミンで修飾した後、GLU-p24（2％GLUを100 nMのHIV-p24抗原と混合し、RTで30分間維持）を行いました。追加した。最後に、p24抗体を使用して検出を行いました。他のステップは、上記で説明したように実行されました。対照実験は、標的HIV-p24の非存在下で実施されました。

検出限界：従来型と化学修飾されたELISA

検出限界を確認するために、さまざまな濃度のp24を0.5〜500 nMで滴定し、従来の方法と方法1および2を使用して評価しました。

従来の方法

HIV-p24抗原を最初に1％ELISAコーティングバッファーで希釈し、ELISA表面に添加し、4°Cで一晩維持した後、残りの領域を2％BSAでRTで1時間ブロックしました。その後、p24抗体の1：1000希釈液を加えて1時間インキュベートし、次に抗マウス-IgG-HRPの1：1000希釈液をELISA表面に加え、1時間静置しました。最後に、HRP基質（TMB）を追加し、ELISAリーダーを使用して405nmの波長で測定しました。

メソッド1

異なる濃度のHIV-p24抗原が、APTESおよびGLUで修飾された表面に添加されました。抗原が固定化された後、残りのステップは、従来のELISAに記載されているように続いた。洗浄は、各固定化ステップの間に5回実行されました。 ELISAリーダーを使用して405nmの波長で吸光度を記録し、写真を撮りました。

方法2

APTES修飾ELISAプレート上で、GLUと事前に混合されたさまざまな濃度のp24が固定化されました。従来のELISAに使用された他のすべてのステップに従った。洗浄は、各固定化ステップの間に5回実行されました。 ELISAリーダーを使用して405nmの波長で吸光度を記録し、写真を記録した。対照実験は、標的HIV-p24の非存在下で実施されました。

APTES修飾表面でのHIV-p24抗原の特異的検出

アッセイの特異性を確認するために、2つの異なるコントロール実験を行いました。 HIV-p24抗原の代わりに、1％GLUとプレミックスしたヒト血清またはHIV-TATタンパク質を使用し、APTES修飾表面に添加しました。他のすべてのステップは、上記で説明したように実行されました。対照実験は、標的HIV-p24の非存在下で実施されました。

結果と考察

酵素免疫測定法（ELISA）は、研究者が適切な抗体を使用してさまざまな生体分子を特定するのに役立つ効果的な免疫測定法です。分析物（タンパク質、ペプチド、抗体、およびアプタマー）の高度な固定化[21、22、23]および分子（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体のFc領域）を捕捉する能力[24、25]は、劇的に改善することができます。検出の限界と分析の特異性をサポートするのに役立ちます。これを念頭に置いて、いくつかのタイプの研究は、ELISA表面を化学的に修飾して、適切に配向されたプローブまたは分析物をより大量に捕捉することに焦点を合わせています。一般に、抗体またはタンパク質は、PSのカルボキシル基とタンパク質または抗体のアミン基との間の静電相互作用を介してELISAPS表面に固定化されます。ただし、この方法は、結合の制限により、より高い感度と特異性を達成するのに十分な効率ではありません。この根本的な問題を克服するために、今回の調査では、効率的なタンパク質固定化のために、3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）とグルタルアルデヒド（GLU）を使用して化学的に機能化されたELISA表面を準備しました。図1aに示すように、水酸化カリウムで活性化されたPS表面は、APTESを使用してアミンで修飾され、GLUで架橋されてタンパク質に結合しました。水酸化カリウム処理がない場合、PS表面に付着するAPTESの最適レベルは、初期吸着を強化し、APTESのより高い結合を引き起こす極性水素結合アクセプターがないため、大幅に低くなります。図1bは、パートナー抗体を使用した化学修飾ELISA表面での固定化タンパク質の検出案を示しています。

化学的に修飾されたELISAの概略図（ a ）。 ELISA表面は、水酸化カリウム処理後にAPTESとGLUを使用して化学的に修飾されました。抗原はGLU修飾表面に固定化されました。 b 固定化された抗原は、そのパートナー抗体によって検出されました

この検出戦略に関する証拠を収集するために、p24と呼ばれるヒト免疫不全ウイルス（HIV）からの重要なタンパク質を使用したいと考えました。 HIV-p24抗原は、HIV感染の初期段階で発現する可能性のあるタンパク質のひとつであり、他のウイルス系で明らかにされているように、宿主系で増殖します（図2）。無傷のHIVは、キャプシドを覆うエンベロープに糖タンパク質を持ち、HIV-p24抗原はキャプシド領域に存在します（図3a）。 HIV-p24抗原を検出する前に、最初に化学リンカーの濃度を最適化して、ELISA表面でHIV-p24抗原を捕捉しました。 ELISA表面でAPTESとGLUのさまざまな濃度と組み合わせを調査し、250nMのHIV-p24抗原の一定濃度を使用して結果を評価しました。図3bおよびcに示すように、1％でのAPTESおよびGLUの適用は、飽和レベルのHIV-p24抗原結合を示しました。 APTESの存在が1％未満の場合、非特異性が増加するため（対照実験と比較して）、結合吸光度（OD）は2％APTESと同じ時間レベルで低くなりました。 GLUの場合、2％レベルは0.25の吸光度でHIV-p24抗原の良好な検出を示し、同時に、コントロール実験（HIV-p24なし）は最高の吸光度（0.16）を示します。最適な1％APTESおよびGLUは、対照実験で最低の吸光度（0.08）を示し、HIV-p24抗原の特異的検出中に最高の吸光度（0.22）を示します。この結果は、APTESとGLUの増加に伴い、残りの遊離アミン表面（APTESに由来）とアルデヒド表面（GLUに由来）で抗体を捕捉できるために発生しました。この結果は、上記の場合に自由表面領域がBSAでブロックされた場合でも同じです。メソッドをさらに微調整するために、バックグラウンドシグナルを最小限に抑えるためにBSA濃度を上げることも試みました。ただし、APTESとGLUの濃度が高い場合でも、生物付着が発生しました。これらの結果に基づいて、最適化された条件は、実験で使用された1％APTESおよびGLUです。

HIVと宿主細胞の相互作用。 HIV増殖の一般的な戦略が示されています

a 無傷のHIV構造。 p24抗原が示されています。 b APTESとGLUの最適化。 APTES（0.5、1、および2％）とGLU（1および2％）をさまざまな組み合わせで使用して、HIV-p24抗原の一定濃度（250 nM）を検出しました

APTESとGLUの最適化の後、GLUをAPTESで修飾された表面にリンクするためのインキュベーション時間も調整しました。図4aに示すように、GLUを一晩インキュベートすると、短いインキュベーション時間（3 h）と比較して最高の吸光度が得られます。この結果は、GLUがAPTES修飾表面に結合するためのインキュベーション時間が不十分なために発生します。最終的に、抗体は残りのAPTES表面に結合することができます。 GLUのインキュベーション時間が長くなると、この化合物はAPTES表面を完全に覆う可能性があります。この飽和により、GLU表面でのタンパク質の固定化が促進され、アッセイの感度が向上します。 250 nMのHIV-p24濃度では、GLUを一晩インキュベートすると、ほぼ2倍の吸光度が得られます（図4a）。

GLUの潜伏期間の最適化。 a 3時間のインキュベーション期間と1％APTES修飾表面で1％GLUを使用した一晩のインキュベーションを持つように最適化されています。 b 従来型、APTES-GLU-p24（方法1）、およびAPTES-GLUプレミックスp24（方法2）の3つの異なるアプローチによる125 nMp24の検出

GLUを一晩インキュベートした後、吸光度が増加し、p24が特異的に検出されたため、本物のシグナルが高くなったため、同様の条件を使用してさらに実験を行いました。この場合、GLUをAPTES修飾表面に固定化してから、タンパク質を付着させました（方法1）。また、別のアプローチも試しました。まず、1％GLUを125 nMのHIV-p24抗原と混合し、次にこの混合物をアミン修飾PS表面に添加しました（方法2）。驚いたことに、方法2で使用した濃度と同じ濃度のHIV-p24抗原（OD 0.161から0.23）で吸光度が増加しました。タンパク質をプレミックスとしてGLUに結合させると、ほとんどすべてのタンパク質がGLUに結合することができ、この混合物はアミン修飾表面に容易に吸着します。ただし、タンパク質が事前に固定化されたGLU表面に結合することを許可された場合、GLUのアルデヒド基のほとんどは利用できませんでした。図4bは、混合方法が、より高い吸光度で同様の濃度（125 nM）のHIV-p24抗原の検出を示していることを示しています。さらに、方法1と2は、同じ濃度のHIV-p24抗原の下で、従来の方法と比較して高い吸光度を示しました。

検出ステップを完全に最適化した後、検出限界を見つけるために、HIV-p24抗原をピコメートルからナノモルの範囲（500pMから500nM）で滴定しました。 3つの異なる方法、すなわち、従来のAPTES-GLU-p24（方法1：APTESに固定化されたp24とそれに続くGLU修飾）、およびAPTES-GLUでプレミックスされたHIV-p24（方法2：p24とGLUのプレミックスに続く）を比較しました。同じ濃度のp24でAPTESに固定化することにより）。図5に示すように、p24の検出限界は、従来のELISAでは30nMであることがわかりました。方法1では、従来のELISAと比較して検出限界が8倍（4 nM）改善されました。この結果は、化学修飾されたPS表面を使用した場合、タンパク質の固定化が均一な配置で安定しており、ELISA表面へのタンパク質の従来の吸着と比較して固定化率も非常に高かったためです。 Vashist etal。 [12]は、APTES修飾ELISA表面への抗体のより高い固定化が、従来のELISA [12]と比較して劇的に改善された検出レベルと関連していることをすでに示しています。彼らの研究では、APTESのアミンは抗体のカルボキシル基に結合することができ、そのようにして、ELISA表面に抗体を化学的に固定化しました。この方法を使用すると、抗体をそのカルボキシル基を介してELISA表面に固定化することしかできませんが、タンパク質ベースの抗原固定化はAPTESでは不可能です。そのために、ELISAPS表面にタンパク質を固定化するGLUリンカーを導入しました。これらの化学的リンカーにより、タンパク質だけでなく抗体も、アミンカップリングを介してグルタルアルデヒド上のアルデヒドに化学的に結合しました。 ELISA基質への生体分子の非特異的付着は、対照実験を使用してモニターされた。対照実験は、標的分子（HIV-p24）なしで実施されました。標的がないと、p24に特異的な抗体は表面に結合できないため、酵素結合二次抗体もELISA表面に固定化されません。この場合、基質（TMB）を追加したときに、吸光度の変化を見つけることができません。

HIV-p24抗原の検出限界。 p24は0.5から500nMまで滴定されました。従来のアプローチと方法1および2の3つの異なるアプローチが採用されました

検出限界を改善するために、APTES修飾表面への固定化ステップの前にGLUとHIV-p24抗原をプレミックスしようとしました。 GLUとHIV-p24抗原のプレミックスは、ELISA表面でのタンパク質の固定化が進むにつれて改善すると予想されました。 GLUをHIV-p24抗原とプレミックスすると、GLUに対するアルデヒドの結合率が高くなります。この混合物をELISA表面に加えると、固定化率が向上します。 Dixit etal。 ELISAプレートに固定化する前に抗体とAPTESを事前に混合すると、ELISA表面への抗体の固定化が強化され、検出限界が増加することがわかりました[12]。私たちの研究では、予想通り、固定化前にGLUとHIV-p24抗原をプレミックスすると、検出限界が1 nMに改善され、検出限界が30であった従来のELISAの30倍になりました。 nM。私たちの戦略では、検出限界が改善されただけでなく、HIV-p24抗原のすべての濃度の吸光度も改善されました。 250 nMのp24で、吸光度が0.35であることが観察されました。これは、同じ濃度のHIV-p24抗原を使用した従来のELISAのほぼ2倍です。すべてのHIV-p24抗原濃度で、HIV-p24抗原の信頼できる検出から明らかなように、従来のELISAと比較して吸光度に大きな違いが見られました（図5）。

アッセイの特異性を評価するために、2つの異なるコントロール実験でテストを実行しました。ヒト血清とHIV-TATを選択し、使用前にHIV-p24抗原の代わりにGLUと混合し、それらの特異性を評価しました。図6に示すように、ヒト血清とHIV-TATの場合、有意な吸光度はありません。ただし、250nMのHIV-p24抗原は、吸光度の明らかな増加を示しました。この結果は、化学修飾されたELISA表面でのHIV-p24抗原の特異的検出をより高い感度で確認しています。

HIV-p24抗原の特異的検出。 HIV-p24の代わりに、ヒト血清とHIV-TATタンパク質を使用して特異性をチェックしました

結論

ELISA表面へのタンパク質または抗体のより高度で適切な固定化は、検出限界を劇的に改善します。ここでは、APTESとGLUの支援を受けて、ELISAPS表面に結合するタンパク質または抗体の量を固定化するための興味深い化学的機能化法を紹介しました。検出を実証するために、HIVのp24抗原を使用しました。検出限界は、従来のELISAと比較して30倍改善されました。現在の調査からのさらなる発展は、他の感知表面で同様の化学ベースの改善につながる可能性があり、より少ない存在量で異なる抗原を検出するのに役立ち、医療診断の進歩を表すでしょう。

略語

APTES：

3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン

BSA：

ウシ血清アルブミン

COOH：

カルボン酸

ELISA：

酵素免疫測定法

Fc：

結晶化可能なフラグメント

GLU：

グルタルアルデヒド

HIV：

ヒト免疫不全ウイルス

HRP：

西洋ワサビペルオキシダーゼ

IgG：

免疫グロブリン

OD：

1つの光学密度

PEG：

ポリエチレングリコール

PS：

ポリスチレン

PVLA：

ポリビニルベンジルラクトノイルアミド

TMB：

3,3 '、5,5'-テトラメチルベンジジン