ポリ（4-スチレンスルホン酸-co-マレイン酸）による金磁性ナノ粒子の安定性の向上：タンパク質検出用に調整された光学特性

要約

金磁性ナノ粒子（GoldMag）は、個々のFe ₃の性能を組み合わせた独自の物理的および化学的性能により、大きな注目を集めています。 O ₄ およびAuナノ粒子。 GoldMagをポリマーでコーティングすると、バッファーに懸濁された複合粒子の安定性が向上するだけでなく、臨床的に関連する生体分子のポイントオブケア光学テストを確立するための重要な役割も果たします。本論文では、ポリ（4-スチレンスルホン酸-co-マレイン酸）（PSS-MA）、スルホン酸とカルボン酸の両方の陰イオン基を持つ負に帯電した高分子電解質を使用して、正に帯電したGoldMag（30 nm）表面をコーティングしました。 PSS-MAでコーティングされたGoldMag複合体は、544nmに安定したプラズモン共鳴吸着ピークを持っています。このGoldMag複合ナノ粒子表面に1対の抗D-ダイマー抗体が結合しており、0.3〜6μg / mLの範囲で標的タンパク質であるD-ダイマーが検出されました。 D-ダイマー-抗体サンドイッチブリッジの形成によるGoldMagの組み立てによって引き起こされた特徴的なピークのシフトにより、検出が可能になりました。

背景

特定の磁化特性、すなわち超常磁性を利用して、磁性ナノ粒子は、薬物/遺伝子送達、磁気共鳴画像法、および生物学的アッセイなどの生物医学的用途のために広く研究されてきた[1,2,3]。 Fe ₃で構成される金磁性ナノ粒子（GoldMag） O ₄ / Auは、酸化鉄ナノ粒子の物理化学的特性を備えているだけでなく、表面の機能化が容易で、独自の光学特性などの金ナノ粒子の特性も備えています。これらの際立った特徴は、生物学の分野[4、5]、特に光学特性に基づく生体分子の検出において大きな注目を集めています。例として、王等。使用済みFe ₃ O ₄ -多重病原体検出用の光学プローブとしてのAuロッド[6]。ただし、他のナノ粒子と同様に、高い表面エネルギーにより、GoldMag粒子は互いに向かって押し付けられ、緩衝液中でクラスターを形成します。これにより、生物医学分野での光学的検出への応用が大幅に制限されます。したがって、GoldMagの凝集を防ぎ、安定したコロイド溶液を確保することが重要です。ポリマーでのコーティングに基づいてターゲット分子を検出するためにGoldMagをカスタマイズすることは、高い有用性を持っています。 GoldMagの分散度は、11-メルカプトウンデカン酸（MUA）[7]、ポリスチレンスルホン酸（PSS）[8]、ポリエチレンイミン（PEI）[9]などのさまざまな高分子有機化合物で表面修飾することで改善できることが報告されています。 MUAは、リガンド交換戦略を使用してGoldMagの表面にもたらされました。 MUAによる表面修飾により、GoldMagコロイド溶液の安定性が向上しました[7]。これらのMUA-GoldMagは、光学特性に基づくタンパク質検出に使用されています。ただし、MUAのチェーンは短すぎて、粒子の十分な分散を保証するのに十分な立体障害を提供できませんでした。さらに、MUAのカルボキシル基の密度が低いため、GoldMagに吸収できるタンパク質の量が制限されます。これらの欠点は、光学機器でのMUA粒子の適用を制限し、バイオマーカーの検出に必要な感度を制限します。

ブロックコポリマーであるポリ（4-スチレンスルホン酸-co-マレイン酸）（PSS-MA）（PSS-MA 3：1、Mw〜20,000）は、PSSとポリマレイン酸の共有結合によって作られ、スルホン酸とカルボキシレート基。多数のカルボキシル基とスルホン酸基によって提供される静電反発力、およびPSS-MAの長いポリマー鎖から生じる立体障害により、このポリマーはナノ粒子の安定性を維持するのに非常に役立ちます。実際、PSS-MAは、酸化鉄ナノ材料、パラジウム、Ag-Auバイメタルナノ構造などのナノ粒子の調製における安定剤として使用されてきました[10、11、12]。ジョンストンら。共重合体でコーティングされた酸化鉄ナノクラスターは、単一高分子のポリマーでコーティングされた酸化鉄ナノクラスターよりも高度な電気立体安定化を保証することを報告しました[13]。さらに、PSS-MAのポリマレイン酸部分にある多数のカルボキシル基により、生物医学的用途向けの生体分子による化学修飾が可能になります。

D-ダイマーは、架橋フィブリンの分解の安定した最終生成物であり、フィブリン形成と線維素溶解の増強に起因します[14]。血中のD-ダイマーレベルの測定は、血栓塞栓性イベントおよび心筋梗塞の診断に広く使用されています[15、16]。ここでは、特定のタンパク質の光学的検出にPSS-MA-GoldMagを使用する可能性を評価するためのモデルとしてD-ダイマーを使用しました。二重抗体サンドイッチイムノアッセイによるD-ダイマーの検出用のプローブを形成するために、PSS-MA-GoldMagに固定化するために1対の抗D-ダイマー抗体を使用しました。

したがって、本研究では、PSS-MAをGoldMagの表面改質に使用しました。これにより、磁性ナノ粒子の安定性が向上するだけでなく、ナノ粒子と二量体検出用の抗体との結合が仲介されます。

メソッド

材料と試薬

GoldMag（5 mg / mL）は、Xi’an GoldMag Nanobiotech Co.、Ltd。（Xi’an、PRC）から提供されました。ホウ酸、ホウ砂、臭化セチルトリメチルアンモニウム（CTAB）、ポリ（4-スチレンスルホン酸-co-マレイン酸）（PSS-MA）（PSS-MA 3：1、Mw〜20,000）は、米国のSigma-Aldrichから購入しました。モノクローナルD-ダイマー抗体のペア（抗体1：M-2.1.16;抗体2：M-1.2.57）はRocheから購入しました。 D-ダイマーは米国のメリディアンケミカルズから購入しました。

表面-PSS-MAで変更されたGoldMag

GoldMagは以前に説明されたように合成されました[17]。 13.3 mLのCTAB（50 mmol / L）を13.3 mLのGoldMag（約3 mg / mL）に追加しました。混合物を機械的に攪拌（200 rpm）し、超音波処理（SB-5200DTD、中国）と組み合わせて30分間行った後、超音波処理せずにさらに30分間攪拌しました。粒子を脱イオン水で完全に洗浄した。 CTAB-GoldMagは、10mLの脱イオン水と16mLの25％（ w ）に再分散されました。 / w ）PSS-MA溶液を加えた後、90分間撹拌（180 rpm）しました。修飾された粒子を脱イオン水で2回洗浄し、脱イオン水に分散させました。

特性評価

ＰＳＳ－ＭＡ－ＧｏｌｄＭａｇは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、日立Ｈ－６００、日立製作所、日本）を使用して観察された。サイズ分布は、DLS（zeta-sizer、Malvern Instruments、UK）によって分析されました。フーリエ変換赤外分光法（FTIR、Thermo Nicolet 5700、Thermo Nicolet Corporation、米国）を使用して、PSS-MA-GoldMagの官能基を特性評価しました。 Metter Toledo SDTA 851e熱重量分析装置（TGA）を使用して、PSS-MA-GoldMag間のポリマー表面シェルの割合を分析しました。 GoldMagの表面プラズモン共鳴（SPR）スペクトルは、UV-2550分光光度計（島津製作所、日本）を使用して、450〜700nmの波長範囲で記録されました。

抗Dダイマー抗体-PSS-MA-GoldMagプローブの調製

1ミリグラムのGoldMagを、75 mg / mLの1-エチル-3-（3-ジメチル-ラミノプロピル）カルボジイミド（EDC）を含む1 mLのホウ砂/ホウ酸緩衝液（0.02 M、pH 7.4）に懸濁しました。次に、100μgの抗D-ダイマー抗体を懸濁液に添加し、続いて1時間超音波処理しました。 3ミリリットルのブロッキングバッファー（0.02 Mホウ砂/ホウ酸バッファー、pH 7.4、5％BSAを含む）を混合物に加え、1.5時間インキュベートしました。外部磁場下で分離した後、抗D-ダイマー抗体-PSS-MA-GoldMag複合体を4°Cでホウ砂/ホウ酸緩衝液に保存しました。 PSS-MA-GoldMag表面での抗D-ダイマー抗体の結合は、SPR分光法と動的光散乱（DLS）測定によって確認されました。

D-ダイマー溶液は、D-ダイマーストック溶液（40 mg / mL）を子牛の血清で希釈して調製しました。 3つの濃度のD-ダイマー（0.6、2、および6μg/ mL）を使用して、D-ダイマーと抗D-ダイマー抗体-PSS-MA-GoldMag複合体の間の反応時間を最適化しました。 10マイクロリットルの抗D-ダイマー抗体-PSS-MA-GoldMag（0.3 mg / mL）を80μLのD-ダイマー溶液（0.6、2、および6μg/ mL）と混合し、混合物を25°でインキュベートしました。 Cで10、20、30、40分。 PSS-MA-GoldMagコンポジットのSPRピークの波長は、UV-2550分光光度計を使用して読み取られました。

D-ダイマーの濃度とSPRスペクトルの変化との関係を分析するために、6、3、1.5、0.75、および0.3μg/ mLの濃度のD-ダイマー溶液を調製しました。 10マイクロリットルの抗D-ダイマー抗体-PSS-MA-GoldMag（0.3 mg / mL）を80μLのD-ダイマー溶液（6、3、1.5、0.75、および0.3μg/ mL）と混合し、混合物は25°Cで30分間インキュベートしました。 PSS-MA-GoldMagのSPRピークの波長は、UV-2550分光光度計を使用して読み取られました。

トリグリセリド、ビリルビン、およびヘモグロビンがタンパク質検出システムに干渉する可能性があるかどうかを評価するために、D-ダイマー溶液（0および3μg/ mL）を準備し、22 mg / mLトリグリセリド、0.2 mg / mLビリルビン、および2 mg / mLヘモグロビンサンプルを個別に追加しました。上記の混合物に10マイクロリットルの抗D-ダイマー抗体-PSS-MA-GoldMagを添加し、UV-2550分光光度計を使用してPSS-MA-GoldMagコンポジットのSPRピークの波長を読み取りました。

結果と考察

スキーム1は、タンパク質の比色検出のための粒子の表面修飾と機能化のために開発された手順を示しています。 PSS-MA-GoldMag構造へのPSS-MAの吸着と取り込みを研究するために、FTIR分光分析、SPR分光分析、およびTGAを実行しました。図1aは、それぞれ純粋なPSS-MA、PSS-MA-GoldMag、GoldMagのFTIRスペクトルを示しています。 3000〜3700 cm ^-1 の広くて強いバンド –CO–OH基と–SO ₂のヒドロキシル基の伸縮に対応しますポリマー鎖の–OH [18]。スルホン酸基の対称振動：（SO ₃ ⁻ ）は1037および1126 cm ^-1 でしたベンゼンのC =Cの伸縮振動は1403および1637cm ^-1 でした。 [19]。 PSS-MAのこれらの特徴的な吸収帯は、PSS-MA-GoldMagで観察され、生の粒子がPSS-MAでうまくコーティングされたことを示しています。 GoldMagの表面化学基の変化は、変更後のSPRバンドでの555から544nmへの11nmの明確な青方偏移によって確認されました（図1b）。 SPRピークの位置と幅は、表面、環境、およびナノ粒子の分散度に関連していました[20、21、22、23]。 TGA分析では、GoldMagに対する有機材料の重量比はほぼ1：4であることが示されました（図1c）。低温では、体重減少は脱水症に起因する可能性があります。温度が上昇すると、重量の減少は、修飾された粒子の表面での有機分子の酸化分解に起因する可能性があります[19、24]。変更中、CTAB-GoldMagは正に帯電し（+ 12.2 mV）、粒子表面にPSS-MAコーティングを施した後、粒子表面は負に帯電しました（-24.5 mV）（図1d）。上記のすべての結果は、PSS-MAがナノ粒子の表面にうまく付着していることを示しています。

TEMを使用して得られたGoldMagおよびPSS-MA-GoldMagの顕微鏡写真（図2a、b）は、これらの粒子が修飾後に単分散であることを示しています。粒子の表面のポリマーの層は、高解像度の電子顕微鏡画像の下ではっきりと見え、GoldMagへのポリマーのコーティングが成功したことをさらに示しています（図2b）。図2cは、PSS-MA-GoldMagの平均直径が116nmであることを示しています。 PSS-MA-GoldMag懸濁液の色はワインレッドで、ナノ粒子の安定性が良好であることを示しています（水中で1年間）。

異なるpH値の緩衝液中のGoldMagおよびPSS-MA-GoldMagの光学特性の安定性は、SPR分光法によって分析されました[7]。図3aに示すように、GoldMagをpH 6.0〜9.0のホウ砂/ホウ酸緩衝液に懸濁すると、SPR特性のピークが555nmから長波長にシフトしました。緩衝液の組成もGoldMag懸濁液の安定性に影響を与えます。 GoldMagをPBバッファー（pH 7.4）、ホウ砂/ホウ酸バッファー（pH 7.4）、およびNaCl溶液（10 mM）に懸濁した場合、脱イオン水中のものと比較して、SPR特性ピークの位置がより高い波長（558 nm）に移動しました。（550 nm）（図3c）。ただし、PSS-MA-GoldMagを電解質溶液またはpH値の異なる緩衝液に分散させた場合、特徴的なSPRピーク（545±2 nm）は大きく変化しませんでした（図3b、d）。 Xia etal。およびStorhoffetal。ナノ粒子の凝集により、SPRスペクトルがより長い波長にシフトする可能性があることも報告されています[25、26]。 GoldMagおよびPSS-MA-GoldMagのゼータ電位も測定されました（図3e、f）。低いゼータ電位（±30 mV未満）は粒子の凝集を引き起こすことが報告されています[27、28]。 GoldMagをPBバッファー（pH 7.4）、ホウ砂/ホウ酸バッファー（pH 7.4）、NaCl溶液（10 mM）に懸濁した場合、GoldMagのゼータ電位は-16.7±1.1 mV、-14.3±2.1 mV、および-8.9±でした。それぞれ1.5mV。 GoldMagのゼータ電位は、粒子をpH 6.0〜9.0のホウ砂/ホウ酸緩衝液に懸濁した場合、-14.2±1.7 mV、-17±1.1 mV、13.9±1.7 mV、および-18.1±1.6mVでした。ただし、PSS-MAがGoldMagに付着すると、さまざまな電解質溶液およびさまざまなpH値でゼータ電位が劇的に低下します。すべての場合において、ゼータ電位は-30mV未満でした。これらの結果は、PSS-MAによるGoldMagの表面修飾により、緩衝液の組成およびpH値の変化に対する耐性が大幅に向上し、高レベルの分散性が保証されることを示しています[29]。

タンパク質とPSS-MA-GoldMagの相互作用を調べるために、EDCを介したタンパク質アミノ基とポリマーのカルボキシル基の反応により、抗D-ダイマー抗体をPSS-MA-GoldMagと結合させました。図4aに示すように、PSS-MA-GoldMagと抗D-ダイマー抗体の反応後にSPRピークの赤方偏移が観察されました。これは、ナノ粒子への抗体の結合を示しています[30、31]。粒子の平均直径が116nmから130nmに増加したことで、PSS-MA-GoldMagに対する抗D-ダイマー抗体の導入が確認されました（図4b）[24]。 PSS-MA-GoldMag懸濁液にさまざまな量の抗D-ダイマー抗体（20〜200μg）を添加した後、SPS-MA-GoldMagの光学特性に対する抗体の質量の影響をSPR分光法で評価しました。図4cに示すように、SPRピークは変化せず、抗体の添加量に関係なく548±3.0nmに保たれました。

PSS-MA-GoldMagに結合させた後の抗体の活性を評価するために、PSS-MA-GoldMagに抗体のペア（抗体1と抗体2）を固定化することにより、プローブAとプローブBを調製しました。それぞれ。 2種類のプローブとD-ダイマー間の相互作用をSPR分光法で分析しました。最良の反応時間は、プローブAに3つの濃度のD-ダイマー（0.6、2、および6μg/ mL）を添加した後、40分間のSPRピークの最大値の変化を観察することによって得られました。図5aに示すように、表面プラズモンバンドの有意なシフトは、PSS-MA-GoldMagが抗原-抗体サンドイッチブリッジ間の架橋を介して経時的に凝集した結果として観察されました。低濃度（0.6μg/ mL）では、SPRスペクトルに20分から40分までの有意な変化はありませんでした。これは、0.6μg/ mL以下の濃度のD-ダイマーの反応には20分で十分であることを示しています。ただし、中濃度および高濃度のD-ダイマー（2および6μg/ mL）を使用すると、波長は30分増加し続けました。これは、最適な反応時間が30分であることを示しています。図5bに示すように、複合粒子のSPRスペクトルは、λ_maxからの表面プラズモン共鳴の明確な赤方偏移を明らかにしました。 =550から570nmで、D-ダイマーの濃度が0.3から6μg/ mLに増加すると、特徴的なピークの強度が低下します。これは、プローブA上の抗体1および抗体2とのD-ダイマーの交差によって引き起こされるPSS-MA-GoldMagの凝集によって引き起こされます。PSS-MA-GoldMagの凝集は、金の光学特性の変化をもたらしました。 PSS-MA-GoldMagの一部です。江ら。およびLietal。また、ナノゴールドの凝集により、ナノ粒子のSPRスペクトルが赤方偏移および境界になる可能性があることも報告されています[32、33]。ただし、D-ダイマーと抗体1の間の相互作用がナノ粒子の集合につながることができなかったため、図5dでは赤方偏移は観察されませんでした。さらに、プローブAに添加されたD-ダイマーの量が0.3μg/ mLと低い場合でも、識別可能な赤方偏移（5 nm）が観察されました。これは、検出限界が診断カットオフ値（0.5このバイオマーカーのμg/ mL）。 SPRスペクトルのピーク位置とD-ダイマー濃度の間の線形関係は、0.3〜6μg / mL（ r ）の範囲で見つかりました。 ² =0.9944）（図5c）。

図6に示すように、それぞれトリグリセリド、ビリルビン、ヘモグロビンの存在下で、PSS-MA-GoldMagのSPR特性ピークに有意なシフトは見られませんでした。この結果は、私たちのタンパク質検出システムがトリグリセリド、ビリルビン、およびヘモグロビンとの干渉反応を持たないことを示しています。

これらの結果は、PSS-MA-GoldMagがタンパク質固定化のための有望な磁性ナノ粒子であり、抗体1-標的タンパク質-抗体2を介して粒子表面にサンドイッチブリッジを形成できることを示しています。これにより、PSS-MA-GoldMagは使用材料として価値があります。バイオマーカーのポイントオブケア光学的検出において。

この研究では、PSS-MAが最初にGoldMagの変更に使用されました（スキーム1）。 GoldMagの表面にPSS-MAを導入すると、緩衝液中での安定性が大幅に向上しました。 PSS-MAの長いポリマー鎖によって引き起こされる立体障害に加えて、PSS-MAのカルボキシル基とスルホ基はナノ粒子間の静電反発を引き起こします[29]。これにより、PSS-MA-GoldMagの安定性が大幅に向上します。粒子表面の多数のカルボキシル基は、生体分子との結合の要件を満たしています。

結論

本研究では、PSS-MAでGoldMagをコーティングするための簡単で迅速な方法が報告されました。結果は、PSS-MAの導入により、GoldMagのコロイド安定性と分散度が大幅に改善されたことを示しています。粒子は、広いpH範囲の緩衝液で良好な安定性を示します。さらに、カルボキシル基の存在は、タンパク質をナノ粒子に結合させるオプションを提供します。 D-ダイマーとその抗体をモデルとして、抗原と抗体-ナノ粒子複合体の架橋により光学特性を調整できることがわかりました。結果は、PSS-MAで修飾されたGoldMagが、イムノアッセイに基づく光学的検出の非常に有望な候補として役立つ可能性があることを示しています。

略語

DLS：: 動的光散乱
FTIR：: フーリエ変換赤外分光法
GoldMag：: 金磁性ナノ粒子
MUA：: 11-メルカプトウンデカン酸
PEI：: ポリエチレンイミン
PSS：: ポリスチレンスルホン酸
PSS-MA：: ポリ（4-スチレンスルホン酸-co-マレイン酸）
SPR：: 表面プラズモン共鳴
TEM：: 透過型電子顕微鏡
TGA：: 熱重量分析装置

水溶性α-NaGdF4/β-NaYF4：Yb、Erコアシェルナノ粒子の合成と発光特性電気抵抗率の低いUV硬化インクジェット印刷された銀ゲート電極

ナノマテリアル