全金属テラヘルツメタマテリアルバイオセンサーがタンパク質検出で超高感度を達成

要旨

本論文では、全金属メタマテリアルに基づくテラヘルツ（THz）バイオセンサーを理論的に検討し、実験的に検証した。このTHzメタマテリアルバイオセンサーは、レーザー穿孔技術によって製造されたステンレス鋼材料を使用する。シミュレーション結果によれば、このメタマテリアルセンサーの最大屈折率感度とメリット指数（FOM）はそれぞれ294.95 GHz/RIUと4.03である。次に、検出物質としてウシ血清アルブミン（BSA）を選び、このバイオセンサーの有効性を評価した。実験結果は、検出感度が72.81 GHz/(ng/mm²)、検出限界（LOD）が0.035 mg/mLであることを示した。このTHzメタマテリアルバイオセンサーはシンプルでコスト効率が良く、製造が容易であり、様々なバイオセンシング応用への大きな可能性を秘めている。

はじめに

現在、医師は患者から血清を採取し、腫瘍検出[1-3]やウイルス検出[4-6]など様々な検査を行っている。腫瘍検出の予備的手法はタンパク質検出である。なぜなら、タンパク質は多くの腫瘍マーカーの構成要素であり、これらの情報を多く含む生体分子が血清中に存在するからである。血清アルブミンは、血漿中の総水溶性タンパク質のうち最も豊富（52-62%）に存在する[7,8]。さらに、血清アルブミンの栄養的および生理学的機能により、それらは必須の生体高分子となっている。最も一般的な血清アルブミンの一つであるウシ血清アルブミン（BSA）は多くの研究分野で用いられている。したがって、BSA検出に関する研究は非常に重要である。BSAの検出と濃度決定には、電気化学的インピーダンス分光法[9]、キャピラリー電気泳動[10]、光散乱技術[11]など多くの方法がある。しかし、これらはいずれも手順が複雑、再現性が悪い、時間がかかるなどの欠点がある。したがって、新しいバイオセンサーの開発は非常に意義があり、強く求められている。

THz波はマイクロ波と赤外光波の間に位置し、エレクトロニクスからフォトニクスへの移行領域にある。光波と比較して、この帯域の光子エネルギーは非常に低いため、THz波は生体分子に電離放射線損傷を与えない。多くの生体高分子もTHz帯域に独自のフィンガープリントを持つ[12-15]。したがって、THz波はバイオセンシング分野で大きな注目を集めている[16,17]。

メタマテリアルは副波長構造で構成される人工電磁材料である。その独自の電磁共鳴には、負の屈折率[18,19]、電磁誘導透明性[20,21]、環境に対する極めて高い感度[22,23]などの特徴がある。周囲環境に敏感なメタマテリアル、特に副波長金属構造で構成されるもの[24-26]は、様々な生体分子の検出に広く用いられてきた。THz波とメタマテリアルの組み合わせは、生体医用分子の新しい検出法を提供し、ラベルフリー検出を可能にするだけでなく、既存センサーの分解能限界を更新する。さらに、少量の分析物で、化学試薬を用いずに簡単かつ迅速に検出できる。

THz周波数では、メタマテリアル製造は通常ミクロンレベルの加工法に依存する。フォトリソグラフィ[27]や電子ビームリソグラフィ[28]が主に用いられ、フォトレジストから機能材料表面へマイクロナノパターンを転写し、その後ウェット[29,30]またはドライエッチング[31,32]で最終加工を行う。これらの手順で微細パターンの構築は可能だが、残念ながらこれらの多くは高価な加工装置、高水準の操作環境、煩雑な加工手順を必要とする。レーザー穿孔[33,34]は最初の実用的なレーザー加工技術であり、レーザー加工の主要応用分野の一つでもある。レーザービームは空間と時間で高度に集中しており、レンズで集光することでスポット径をミクロンレベルまで縮小し、10⁵–10¹⁵ W/cm²のレーザー出力密度を得られる。このような高出力密度により、レーザー穿孔はほぼあらゆる材料で実行可能である。我々の知る限り、レーザー穿孔技術をメタマテリアルバイオセンサーの製造に適用したのは今回が初めてであり、メタマテリアルバイオセンサーの加工コストを大幅に削減し、実用化を促進できる。

本研究では、全金属メタマテリアルに基づくタンパク質検出用高感度THzバイオセンサーを提案し、理論シミュレーションと実験実証を行った。デバイスは製造が簡単でコスト効率が良く、非常に安定している。ステンレス鋼材料で構成され、レーザー穿孔技術で製造される。まず、有限積分法（CST商用ソフトウェア）を用いてこのメタマテリアルセンサーをシミュレーション・解析し、屈折率感度を算出した。次に、このTHzメタマテリアルバイオセンサーを作製し測定した。実験は、このセンサーの外部環境に対する高感度を確認した。検出物質としてBSAを選び、バイオセンサーの有効性を評価した。ヒル式を用いて実験データをフィッティングした。検出感度72.81 GHz/(ng/mm²)と検出限界（LOD）0.035 mg/mLを得た。測定はバイオセンサーの信頼性を検証するために3回繰り返された。

設計

図1aは、提案する全金属メタマテリアルTHzバイオセンサーの構造を示す。中空ダンベルパターンが、x方向とy方向に周期的に配置され、厚さ50 μmのステンレス鋼板（伝導率1.4×10⁶ S/m）上に形成される。単位構造の周期サイズP_xとP_yはそれぞれ500 μmと300 μmである。中空ダンベルの長さLと隙間Hはそれぞれ294 μmと60 μmである。中空ダンベル両端の円の半径Rは60 μmである。バイオセンサーは全金属構造設計であり、従来の誘電体基板を持たない。THz波はメタマテリアルバイオセンサー表面に垂直入射する。

a バイオセンサーの三次元アレイ図と単位構造図。構造パラメータ：P_x=500 μm、P_y=300 μm、L=294 μm、H=60 μm、R=60 μm。b バイオセンサーのシミュレーション透過率

方法とシミュレーション

有限積分法（CST商用ソフトウェア）による三次元全波電磁場シミュレーションを用いて以下のシミュレーションを行った。xおよびy方向に周期境界条件を適用し、波伝播方向のzには完全整合層を使用した。図1aの右上に示すように、入射電磁界の波数ベクトルk_zはz軸方向に伝播する平面波であり、電界と磁界はそれぞれy軸とx軸方向に偏光している。図1bに示すように、0.48 THzに透過ピークが存在した。

この共鳴ピーク発生の物理機構を調べるため、共鳴ピーク周波数におけるバイオセンサーの表面電流と磁界をシミュレーションした。図2の左側に示すように、入射電磁波はy軸方向に偏光しており、開口部両端で電荷振動を誘起し、電気双極子を生成する。電荷振動は、開口部を構成する2つの円形孔の縁に沿った逆回転電流振動を伴う。これにより、z軸方向に向き合った一対の逆向き面外磁気双極子が生じる。図2の右側に示すように、z軸方向に一対の明確な逆向き磁気双極子が端から端へ連なり、トロイダル双極子を形成する。したがって、メタマテリアルの応答は電気双極子とトロイダル双極子の組み合わせによって支配される。

0.48 THzにおけるシミュレーション表面電流分布図と磁界分布図（y=0 μm）

センサーの性能は構造パラメータの影響を受けるため、設計手順中に構造パラメータを最適化する必要がある。図3は構造サイズの変化が透過スペクトルに与える影響を示す。図3aのように、中空ダンベルの長さを290から298 μmに増やすと、透過スペクトルのピーク周波数が0.48 THzからレッドシフトする。図3bのように、中空ダンベルの隙間を56から64 μmに増やすと、ピーク周波数がブルーシフトする。LとHが増加すると、共鳴ピークはそれぞれ低周波側と高周波側へ移動し始める。円の半径を56から64 μmに、ステンレス鋼板厚を40から60 μmに変化させた場合、共鳴ピーク位置はわずかに変化するのみである。したがって、中空ダンベルの長さLと隙間Hを調整することで、メタマテリアルバイオセンサーの共振周波数を容易に調整できる。

透過スペクトル：a 異なる長さL、b 隙間H、c 半径R、d ステンレス鋼板厚

入射角と偏光角が透過スペクトルに与える影響を調べることも重要である。電磁波を垂直入射させ、その後入射角と偏光角を変更した。これらの角度の定義は図4aに示す。入射角はy-z平面上のθ_i、偏光角はx-y平面上のθ_pを意味する。図4bのように、入射角を0°から15°に変化させると、共鳴ピーク周波数の差はわずか9 GHzであった。図4cのように、偏光角を0°から15°に増やすと、共鳴ピーク周波数の差はほぼ0 GHzだったが、共鳴ピーク振幅が約0.1減少した。これは、バイオセンサーが入射角と偏光角の変化にほぼ非感度であることを示し、実用的なバイオセンサー応用に有益である。

a 入射角θ_iと偏光角θ_pの変更概略図。透過スペクトルとb入射角、c偏光角の関係

バイオセンサーのセンシング性能を探るため、図5aに示すようにこのメタマテリアルバイオセンサーに120 μm厚の分析物薄層を追加し、分析物の屈折率を変化させたときの透過スペクトルをシミュレーションした（図5b）。屈折率感度Sは、透過ピーク位置の変化量と屈折率単位の比（S=Δf/Δn）と定義した。分析物の屈折率が増加すると、共鳴ピーク周波数はレッドシフトした。各屈折率に対応する共鳴ピーク周波数シフトを収集した。良好な直線性が観察された。図5cのフィッティング結果は、屈折率に対する感度が294.95 GHz/RIUであることを示している。

a 120 μm厚の分析物層を持つメタマテリアルバイオセンサーモデルの断面図と上面図。b 分析物の屈折率変化がバイオセンサー透過スペクトルに与える影響。c 対応するピーク周波数シフトと屈折率の線形フィット

センシング性能はメリット指数（FOM）でも定量化された。FOMは以下のように定義される：

$${\text{FOM}} = \frac{S}{{\text{FWHM}}}$$ (1)

ここで、Sは感度、FHWMは共鳴ピークの半値全幅である。このバイオセンサーのFOMは4.03であった。

ほとんどのメタマテリアル構造では、通常誘電体材料を基板として使用する。しかし、本論文で提案するメタマテリアルバイオセンサーは、全ステンレス鋼設計の全金属メタマテリアルに基づき、空気を基板として使用する。従来の誘電体材料（ポリエチレンテレフタレート（PET）、石英、シリコンなど）と比較して、空気は最も低い屈折率を持つ。基板の役割を評価するため、これらのメタマテリアルバイオセンサーを異なる基板で再シミュレーションし、屈折率感度とFOM値を算出した。図6に示すように、基板の屈折率が増加すると、センサーの屈折率感度とFOMは減少し始めた。この結果は、より低い基板屈折率を持つバイオセンサーがより優れたセンシング性能を持つことを示している。

異なる基板を使用した場合の感度とFOM

バイオセンサーのセンシング原理をさらに調査するため、電界分布図をシミュレーションした（図7）。シミュレーション電界分布の上面図と側面図は、電界エネルギーが主にステンレス鋼穴の一部に集中していることを示した。したがって、分析物が穴内に添加されることを確実にすることが重要である。

シミュレーション電界分布。a 上面図、b 側面図（y=0 μm）

表1は、提案センサーの屈折率感度とFOMをまとめ、他の報告研究[35-37]と比較したものである。他のTHzセンサーはすべて従来のフォトリソグラフィプロセスに基づいている。我々が設計したステンレス鋼メタマテリアルバイオセンサーは、安価なレーザー穿孔技術を用いて優れたセンシング性能を発揮することがわかる。

実験

材料と試料調製

提案したTHzメタマテリアルセンサーのバイオセンシング能力を実証するため、タンパク質検出実験を行った。BSAとPBS緩衝液はともにSigma-Aldrichから購入した。BSA溶液はPBS緩衝液（pH=7.4）で調製した。

作製したメタマテリアルバイオセンサーの顕微鏡像を図8に示す。メタマテリアルバイオセンサーの全体サイズは12 mm×12 mmであった。

作製バイオセンサ試料の顕微鏡写真

調製したBSA溶液の濃度は0.2、0.5、2.0、4.0 mg/mLであった。分析物は液体堆積法でバイオセンサー表面に添加した。毎回、ピペットで150 μLのBSA溶液をバイオセンサー表面に移し、40 ℃の加熱台で乾燥させた。40 ℃で加熱すると、タンパク質膜がより速く均一に形成される。異なる濃度のBSA溶液に変更するたびに、ステンレス鋼板を脱イオン水に入れ、超音波振動機で振動させ、前回のプロセスのタンパク質膜が除去され、このメタマテリアルバイオセンサー表面が清潔であることを確認した。図9は、タンパク質の添加と乾燥プロセスの写真と顕微鏡写真を示す。図9aのようにステンレス鋼板は清潔であり、図9bのようにある濃度のBSA溶液をステンレス鋼板表面に添加すると、水の表面張力の効果により溶液はこのバイオセンサー表面に留まり、穴を通過しなかった。加熱乾燥後、薄いBSA膜層が形成された（図9c）。

異なるテストステップでのステンレス鋼の写真：a 超音波洗浄・乾燥後のメタマテリアルバイオセンサー、b 150 μL BSA溶液（0.2 mg/mL）添加後、c 乾燥後；ステンレス鋼板のd側壁とe表面の顕微鏡写真（BSA添加前）；ステンレス鋼板のf側壁とg表面の顕微鏡写真（BSA溶液（0.2 mg/mL）添加・乾燥後）

ステンレス鋼の穴内部の状況を観察するため、ステンレス鋼の一方を切り取り、穴の一方を露出させて顕微鏡で観察した。図9d-gに示すように、BSA溶液を滴下・乾燥させると、薄いBSA層がステンレス鋼の穴内に添加された。これは主に、穴の直径がBSAタンパク質のサイズよりはるかに大きいためである。これは、検出対象の分析物が我々のバイオセンサーの検出感度領域に侵入できることを証明しており、このメタマテリアルバイオセンサーの感度を大幅に向上させることができる。

スペクトル測定

すべてのスペクトル測定は、連続波THz分光システム（TeraScan 1550、Toptica Photonics AG）を用いて行った。システムは、デュアルレーザー制御（DLC）スマートエレクトロニクス、2台の分布帰還（DFB）レーザー、2台のファイバ結合InGaAsフォトミキサー、4台の90°オフアキシス放物面鏡で構成される（図10）。THz波は90°オフアキシス放物面鏡でコリメートされ、試料に集光された。すべての透過スペクトルは、50-1220 GHzの間をステップサイズ40 MHz、積分時間10 ms、ファストスキャンモードでスキャンすることで取得した。THz波の偏光はダンベルリングの開口方向に沿ったものである。

実験で使用した連続波THz分光計の概略図

実験結果と考察

メタマテリアルバイオセンサーのタンパク質検出実験は、4濃度のBSA溶液で行った。実験全体を通じて、各グループのBSA溶液は低濃度から高濃度の順に添加された。すべての測定は3回繰り返された。

図11aに示すように、BSA溶液の濃度が増加するにつれて、共鳴ピーク周波数がレッドシフトした。この傾向はシミュレーション結果と一致する。共鳴強度の低下は、BSAタンパク質によるTHz波の吸収によるものである。

a 異なるBSA濃度での測定スペクトル。b BSA実験のヒルフィット

周波数シフトとBSA溶液濃度の関係は線形ではないが、これは生物学実験で一般的である[38,39]。ヒルモデルは、我々のメタマテリアルバイオセンサーと生体分子の結合能力を特徴付けることができる。したがって、ヒルモデル[40]を用いて実験データをフィッティングした（図11b）。ヒル式は以下の通りである：

$$\Delta f = \Delta f_{\max} \cdot \frac{{[\text{BSA}]^{n}}}{{K_D + [\text{BSA}]^{n}}}$$ (2)

ここで、最大ピーク周波数シフトΔf_maxは飽和値、[BSA]はBSA溶液濃度、nはヒル係数、K_Dは解離定数である。

図11bのフィッティング曲線を用いると、ヒル係数nは0.83、解離定数K_Dは2.87 mg/mLと計算された。さらに、Δf_maxは約166 GHzであり、飽和濃度での最大ピーク周波数シフトを示した。共鳴ピーク周波数のヒルフィッティング結果は、実験の信頼性と正確性を確認した。

バイオセンサーの感度Sは以下のように導出された[41]：

$$S = \frac{{\Delta f_{\max}}}{{\delta_{\max}}}$$ (3)

ここで、Δf_maxは166 GHz、δ_maxはBSAの表面密度である。δ_maxは以下により決定された[41]：

$$\delta_{\max} = \frac{{M_{\text{BSA}}}}{{N_A \times P_{\text{BSA}}^{2}}}$$ (4)

ここで、M_BSA=66,430 g/molはBSAの推定分子量[42]、N_A=6.02×10²³ mol⁻¹はアボガドロ定数、P_BSA=6.96 nm[43]はBSA分子1個の平均長さである。δ_maxは2.28 ng/mm²であり、バイオセンサーのBSA検出感度は72.81 GHz/(ng/mm²)となった。

ヒルモデルで得られたK_Dは、解離定数がBSAと強く関連していることを示した。BSAの検出限界（LOD）C_limは以下の式で計算した[44]：

$$C_{\lim} = K_D \times \frac{{S_f}}{{\Delta f_{\max} - S_f}}$$ (5)

ここで、S_fは分光分解能2 GHzである。式(5)は、解離定数が小さいほど検出限界が低くなることを示している。したがって、C_limは0.035 mg/mLと計算された。

表2は、我々のバイオセンサーのBSAセンシング性能と報告研究を比較したものである。実験では、最低BSA濃度0.2 mg/mLで10.8 GHzの周波数変化が得られた。参考文献[45-47]と比較して、同一BSA濃度で比較的大きな周波数変化を達成した。ヒル式をメタマテリアルバイオセンサーのデータ解析に適用し、算出されたLOD 0.035 mg/mLは参考文献[45]よりも大幅に優れていた。これらすべてが、提案する全金属THzメタマテリアルバイオセンサーが多くの生物学的・化学的応用で優れた性能を発揮することを予測させる。

ステンレス鋼バイオセンサーの優れたセンシング性能に基づき、将来的には特定の抗体で修飾し、特定の抗原検出を実現できる。また、ステンレス鋼バイオセンサーの厚さはわずか50 μmである。マイクロ流体技術とTHz分光法の発展により、将来的にはインビボリアルタイム測定への応用が期待される。

結論

結論として、全金属メタマテリアルに基づくTHzバイオセンサーを用いてタンパク質濃度を測定した。バイオセンサーはステンレス鋼製で、レーザー穿孔技術で作製された。CST電磁シミュレーションソフトウェアを用いて計算された最大屈折率感度とFOMは、それぞれ294.95 GHz/RIUと4.03であった。試料は連続波THz分光計で特性評価された。実験結果は、BSA分析物溶液に対して、検出感度と検出限界がそれぞれ72.81 GHz/(ng/mm²)と0.035 mg/mLであることを示した。このバイオセンサーは、小型、高検出感度、低検出限界、再利用可能、製造容易、コスト効率良いという利点を持つ。これらの研究成果は、将来の生体分子検出と疾病診断への応用において非常に意義深い。

データおよび資料の入手可能性

すべてのデータは制限なく完全に入手可能です。

略語

THz:

テラヘルツ

RI:

屈折率

FOM:

メリット指数

BSA:

ウシ血清アルブミン

PET:

ポリエチレンテレフタレート

DLC:

デュアルレーザー制御

DFB:

分布帰還

LOD:

検出限界