骨形成タンパク質-2（rhBMP2）をロードしたシルクフィブロイン足場は、骨組織工学における骨誘導性を強化します

背景

骨の再生能力は、それ自体で小さな骨折の修復を可能にします。骨が形成され、続いて結合し、最後に元の形状と骨の形が再構築されます。しかし、この能力は限られており、これは治療のための自家移植片または同種移植片の要件を生み出します[1]。同種移植では、免疫反応を引き起こす可能性のある別のドナーから骨を採取します。骨が患者自身の体から得られる自家移植は、免疫学的問題を引き起こしませんが、利用可能な骨の十分な量によって制限されます[2、3、4]。

組織工学は、同種移植および自家移植の免疫学的限界を克服するための潜在的な技術として認識されています。組織工学では、ヒト間葉系幹細胞や骨肉腫細胞（MG63）などの特殊な細胞を、適切な環境下で事前に作成された足場上で培養し、この細胞と足場のシステムを移植片として使用します[5、6]。

足場は、生存と増殖のために細胞に足場と生化学的ニッチを提供するために使用されます。いくつかのプロパティすなわち。足場を製造するための材料を選択する際には、機械的強度、骨誘導、生体吸収、段階的多孔性、および生体適合性を考慮する必要があります。骨誘導（骨形成の誘導）は、骨組織工学（BTE）の足場の製造に使用される材料に必要な特性の1つです[7]。骨形成因子を有する足場は、前駆細胞およびその分化を動員する可能性がある血管新生および骨形成を結合する骨組織再生プロセスを模倣するのに強力である。骨形成タンパク質（BMP）は、骨形成を誘発する成長因子のクラスであり、脱灰骨基質（DBM）およびリン酸カルシウムとともにBTEアプリケーションに提案されています[8,9,10]。

いくつかのグループが、BTEでの足場製造の潜在的な材料として、金属、セラミック、合成ポリマーと複合材料、およびシルクフィブロインの使用を報告しています。シルクフィブロイン（SF）は、その優れた機械的および生体適合性により、組織工学用途の足場製造に適した材料として報告されています[5]。現在まで、BMPとSFエレクトロスピニングナノスキャフォールドとの関連性の利点を評価するレポートは公開されていません。

ここでは、新規組換えヒト骨形成タンパク質-2（rhBMP2）結合SFエレクトロスピニングナノファイバー足場の製造を報告します。足場を純粋なSF足場の足場と比較して、骨誘導に対するrhBMP2結合の効果を解明しました。細胞生存率と細胞増殖特性も測定され、新しくより優れた骨組織工学アプリケーションのための足場の効力を確立しました。

メソッド

SF / BMP2の水溶液の調製

当初、SFはカイコの繭 Bombyx mori から分離されました。 、水溶液として。確立されたプロトコルにわずかな変更を加えました[11]。繭を100mLの0.02M Na ₂ で煮沸しました。 CO ₃ 20分間行った後、蒸留水で十分にすすいで、余分な水溶性セリシンとワックスを取り除きます。次に、抽出したフィブロインを9 M臭化リチウム溶液に60°Cで4時間溶解し、さらに水に対して4日間透析しました。最終濃度は、乾燥後に乾物を秤量することによって決定され、7％ w であることがわかりました。 / v 。次に、この溶液を、1 Lの25％ポリエチレングリコール（PEG、10,000 g mol ^-1 ）に対する透析によってさまざまなレベルに濃縮した後に使用しました。 ）室温での溶液。希釈SF水溶液は蒸留水で希釈して調製し、すべての溶液はさらに処理するまで10°Cで保存しました。組換えヒト骨形成タンパク質-2（rhBMP2）の凍結乾燥粉末をPBS（pH 3.8）に溶解しました。タンパク質溶液を0.22μmシリンジフィルターで滅菌し、水溶液として各フィブロイン溶液に連続的に攪拌しながら加えた。グルタルアルデヒドを介した架橋を使用して、BMPをフィブロインと関連付けました。簡単に説明すると、10 mLの反応混合物について、200μLのグルタルアルデヒドと40μLの12 N HClをグループ活性化剤として使用して、6％シルクフィブロインと1％rhBMP2をそれぞれ5mL架橋しました。この手順で、3つの溶液を調製しました：（i）rhBMP2（SF）を含まない3％シルクフィブロイン、（ii）0.5％のrhBMP2（SF + rhBMP2）を含む3％シルクフィブロイン、および（iii）12％シルクフィブロイン（ii）のようにrhBMP2の0.125％（4SF + rhBMP2）。これらのソリューションは、足場を製造するためのエレクトロスピニング手順で使用されました。

エレクトロスピニングによる足場の製造

足場の製造では、5.5 kV DC電源に接続されたステンレス鋼針（25G、ID 0.26 mm、Sigma Aldrich）を備えた5mLガラスシリンジに各溶液をロードしました。繊維の調製では、出口の流量を0.4 mL h ^-1 に維持しました。 シリンジポンプを使用して、毛細管の先端から15cmのギャップに保たれたアルミホイル上にエレクトロスピニングされた繊維を収集しました。サンプルはそれぞれ4時間収集されました。

走査型電子顕微鏡

準備された足場の形態学的検査のために、SEMはZeissEVO40SEMを使用して実行されました。スキャン画像をさらに処理する前に、サンプルを金でスパッタコーティングしました。ファイバーの直径の決定は、画像フレーム内の10本のランダムなファイバーの直径を平均することによって行われます。

足場の機械的特性

圧縮実験は、Instronシングルカラムテーブルトップ電気機械テスター（モデル3345、Instron、マサチューセッツ州カントン）を使用して開発された足場の機械的特性を評価するために行われました。長時間のエレクトロスピニングによって得られた直径0.2mmの繊維を使用して、25°Cおよび50％の湿度での応力-ひずみ曲線から引張強度と破断点伸びを決定しました。

腫れの研究

膨潤率を測定するために、各製剤を37°CでPBS（pH 7.4）に溶解しました。所定の時間間隔でサンプルを取り出し、電子天秤を使用して乾燥重量を測定した。平衡重量に達するまで試験を続けた。膨潤率は以下のように表されます：

ここで、 W _o =ナノファイバーマトリックスの初期乾燥重量および W _s =各時点での膨潤したナノファイバーマトリックスの重量。

細胞培養

ヒト間葉系幹細胞（hMSCs）は、製造されたナノ足場の骨誘導能を評価するために本研究で使用されました。 hMSCは、10％ウシ胎児血清と1％ペニシリンを含むDMEMで、37°C​​、5％CO ₂ で培養および維持されました。 90％のコンフルエンスが達成されるまで加湿雰囲気。次に、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、定量のために培地に再懸濁しました。

エタノールで洗浄し、UV光を30分間照射することにより足場を滅菌し、その後、PBS（pH7.4）で洗浄した。細胞を播種する前に、DMEMによる処理が足場に与えられます。 20μLの細胞懸濁液を各足場および対照として機能するプラスチックフィルムに滴下して加えた。足場は加湿雰囲気（37°C、5％CO ₂ ）で休息させました。 ）30分間。次に、足場をDMEMで21日間培養し、隔日で培地を定期的に補充しました。

細胞接着アッセイ

足場との細胞の接着能力を評価するために、接着されていない細胞の数を、わずかな変更を加えた文献の方法に従って、最初の播種の1、3、および6時間後にカウントしました[6]。細胞培地を収集し、血球計算盤で細胞数を数えた。初期播種数と非付着細胞数の差を付着細胞数とした。結果は、次の式のように付着率で表されました。

細胞毒性アッセイ

ナノファイバーマトリックスの毒性効果を測定するために、MTTアッセイを実施しました。それぞれの時間枠の後、コンストラクトをMTT溶液（1 mg mL ^-1 ）でインキュベートしました。 PBS（pH 7.4）で1:10の比率で希釈し、4時間インキュベートしたストック溶液。生細胞は、このインキュベーション期間中にMTTをホルマザン塩に変換します。 DMSOの添加によりホルマザン塩を溶解し、20分間放置した。マイクロプレートリーダーを使用して570nmでの吸光度の変化を記録することにより、ホルマザン塩に由来する吸光度を定量的に測定しました。

細胞増殖アッセイ

足場内の細胞の増殖を測定するために、アラマーブルー（AB）色素還元アッセイを実施しました。足場をDMEMで希釈した色素で4時間インキュベートし、色素の減少を分光光度法で測定しました。 AB削減率は次のように計算されました：

ここで、ελ ₁ =570nmおよびελでのアラマーブルーのモル吸光係数 ₂ =酸化された（εにおける600nmでのアラマーブルーのモル吸光係数 _ox ）および削減（ε _赤 ）フォーム。 A λ ₁ およびA λ ₂ テストウェルの吸光度を示します。

A ’λ ₁ =570nmでのネガティブコントロールの吸光度。

A ’λ ₂ =600nmでのネガティブコントロールの吸光度。

ALPアッセイ

足場内の培養hMSCによるアルカリホスファターゼ（ALP）産生は、キットの製造元プロトコルに従って測定されました[12]。簡単に説明すると、滅菌PBS（pH 7.4）を足場の洗浄とインキュベーションに使用し、続いて1 mL Trisバッファー（1 M、pH 8.0）でホモジナイズし、氷上で3分間超音波処理しました。次に、25μLのライセートを1 mLのp-ニトロフェニルホスフェート溶液（16 mM）とともに30°Cで5分間インキュベートしました。分光光度測定は、ALPの存在下でのp-ニトロフェノールの生成を監視するために405nmで実行されました。

In vivoALPアクティビティ

それぞれ100〜120 gの体重の9匹の雄の無胸腺ヌードラットを採取し、腹部の筋肉を両側から解剖してポーチを作成しました。ヌードマウスモデルを利用して、インビボでの足場の骨誘導能を実証した。 3種類の足場（5mm×5mm）のそれぞれの1つを切り取り、別々に筋ポーチに詰めました。次に、ポーチを非吸収性の縫合糸で閉じた。手術の14日後、腹直筋を切除することによってインプラントを回収し、PBSに保存しました。筋弁を切除し、抽出バッファーでホモジナイズしてアルカリホスファターゼを放出する外植片組織を取得します。溶液のアリコート50μLをALP活性の測定に使用しました。

統計分析

すべての実験は3回行われ、提示されたデータは、特に明記されていない限り、サンプルの平均±標準偏差（SD）としてフォーマットされています。一元配置分散分析（ANOVA）は、統計ソフトウェアOrigin 6.0を使用して実行され、不確実な差異と有意な差異を評価しました。 P 0.05以下の値は、研究グループ間の有意差を意味します。

結果

足場の形態

作製した足場のSEM画像（図1）は、微細に紡がれたナノファイバー構造を示しています。 SFおよびSF + BMP2足場の繊維の平均直径は、すべての濃度で100〜900 nmの範囲で類似しているように見えます。これは、直径がエレクトロスピニングが行われた時間の関数であることがわかっているためです[13]。ナノファイバーは均一であることがわかり、BMP2コンジュゲーションによりファイバー径が不均一になりました。足場の細孔径は、作製された足場において均一であるように見え、フィブロインの濃度とは無関係であることが見出された。 SFの濃度は細孔径に大きな影響を与えません[11]。

準備された足場のSEM顕微鏡写真。 a SF。 b SF + rhBMP2。 c 4SF + rhBMP2

足場の機械的特性

ナノファイバー足場の応力-ひずみ曲線を図2に示します。BMPの添加はSF足場の機械的特性を変化させないが、製造材料（SF）の濃度の増加に伴い、マトリックスの引張特性が改善されることが観察されました。 。これは、架橋中に繊維間結合が形成されたことが原因である可能性があります。したがって、低濃度のSF繊維は、高濃度のSF繊維と比較して優れた機械的強度を示しませんでした。

エレクトロスピニングされたナノファイバーの応力-ひずみ関係。応力-ひずみ関係は、（a）SF、（b）SF + rhBMP2、および（c）4SF + rhBMP2足場の間で比較されました

腫れの研究

足場の時間の関数としての膨潤率を図3に示した。足場は最初は時間とともに十分に膨潤し、約380分で平衡に達した。 rhBMP2にリンクされたファイバーは、SFのみの足場と比較してより多くの水を吸収し、BMP2の結合による親水性ポケットの増加を示唆しています。 SF繊維は〜70％で平衡化され、BMP2含有繊維は〜81％水で平衡化されました。

製造された足場の膨潤特性。 SF + rhBMP2および4SF + rhBMP2で修飾した後、SF足場の膨潤特性の変化が観察されました

細胞接着アッセイ

細胞の成長と分化の誘導には、細胞の足場への付着が必要です。この研究では、hMSCが足場によく付着していることを観察し、4SF-BMP2、SF-BMP2、およびSF足場へのhMSCの付着を図4に示しました。

3つの時点での時間に対する付着率を表すヒストグラム。 （a）SF、（b）SF + rhBMP2、および（c）4SF + rhBMP2スキャフォールドの接着レベルの変化

観察された結果から除外された混合足場の付着性の喪失の懸念があった。 BMP2とのブレンドは、足場の付着能力を低下させません。図3から明らかなように、細孔径の増加（SF濃度の減少）に伴い、細胞の足場への付着が増加することがよく理解されました。 3つの製剤間のANOVAは、3時間目と6時間目の変動を大幅に区別します。ただし、1時間目には有意差は見られませんでした。

細胞毒性アッセイおよび細胞増殖アッセイ

rhBMP2結合スキャフォールドでは細胞生存率が大幅に向上し、構築されたスキャフォールドは対象のゲスト細胞に細胞毒性効果をもたらさず（図4）、細胞はすべてのスキャフォールドで比較的よく増殖しました。日数とともに生存率の増加傾向があり、SF + BMP2スキャフォールドは各時点で最小の毒性を示しました。 ANOVAは、懸念される3つの製剤の細胞生存率の値に有意差があることを明らかにしました。

4つの時点のヒストグラムとして表される細胞生存率アッセイ。細胞生存率アッセイはMTTアッセイによって実施され、結果はコントロールに対するパーセンテージとして表されます

図6から、細胞増殖を調べることができます。細胞は3つの足場調製物すべてでよく増殖し、各時点でSF + BMP2が最高でした。 SF + BMP2足場のより大きな細孔は、細胞の成長のための最大のスペースを提供していました。グループ間の差異の重要性は、ANOVAから十分に確立されました。

SF、SF + BMP2、および4SF + BMP2の4つの時点でのアラマーブルー色素減少のパーセンテージとしての細胞増殖の表現

ALPアッセイ

ALP活性は、細胞周辺の環境の骨誘導特性の標準的なマーカーです[13]。私たちの実験では、SFのみのコンストラクトと比較して、SF + BMP2コンストラクトでより高いALP活性が観察されました（図7）。 SFナノ構造の足場は、単独でも骨誘導を示すことができましたが、図7およびANOVAから明らかなように、SF + BMP2足場が問題の足場の中で最良であることが証明されました。 ALP濃度は実験の時間の経過とともに増加しましたが、SF濃度が高いコンストラクトは、SF濃度が低いコンストラクトと比較してALP活性が低くなりました。

異なる時点での3つの異なる足場製造戦略間のALP活動の表現。 （a）SF（b）SF + rhBMP2（c）4SF + rhBMP2スキャフォールド

In vivoALPアクティビティ

図8は、（a）SF、（b）SF + rhBMP2、および（c）4SF + rhBMP2の外植片のALP活性を示しています。予想通り、rhBMP2を含む治療からの外植片は、より高いALP活性を誘発しましたが、rhBMP2を含まない足場治療マウスは、より低いALP活性をもたらしました。

処理後に得られた外植片のインビボALP活性。ヌードマウスモデルを利用して、invivoでの足場の骨誘導能を実証しました

ディスカッション

足場ベースの組織工学は、再生医療におけるその可能性を証明し、BTEのツールとして目覚ましい進歩を遂げました。以前の研究では、invitroで操作された細胞足場構造を骨組織に変換する際のマイクロアーキテクチャと構造の物理的特性の重要な役割が確立されています[14、15、16]。

最適な機械的特性（細孔径、引張強度など）とコンストラクトの生体適合性は、細胞のコロニー形成と組織化のために考慮すべき潜在的な特徴です[17]。提示された作業は、骨組織工学のために提案された材料の有益な特性の組み合わせを利用した骨組織工学のための足場の製造と特性評価について説明しています。 SFは適切に強力で生体適合性のあるプラットフォームを提供しますが、埋め込まれたrhBMP2は新しい骨細胞の形成を誘導します。 SFは、骨芽細胞の増殖[18]と、靭帯、腱、軟骨、骨、肝臓、皮膚、気管、角膜、神経、耳介、膀胱などの組織再生[19、20]のさまざまな製剤でいくつかのグループによって広く研究されています。

SFの分解は有機溶液中で好ましくないため、SF溶液の調製には有機溶媒よりも水溶液が好ましいため、SFおよびSF + rBMP2の水溶液を研究に使用しました[18]。エレクトロスピニングされたSF繊維は、均一な直径の繊維の均質な構造を持っていることが以前に報告されており、メッシュは非常に多孔性であり、相互接続および交差接続された細孔があり、これも私たちの研究と密接に一致しています[21、22]。私たちの足場および以前に報告されたもの[21]のSF繊維におけるビーズ様構造の形成の観察はありませんでした。純粋なSF繊維の直径は、ブレンドの増加とともに減少することが以前に報告されました[11、21]。ただし、ブレンドによる直径の減少は観察されませんでした。しかし、おそらくrBMP2のSF繊維への不均一な結合が原因で、混合繊維では繊維の均一性が乱されました。

十分な機械的強度は、組織の足場に不可欠な特性です。純粋なSFをブレンドすると、実験でナノファイバーの柔軟性が向上しました。以前のレポートでも、SFを他の材料とブレンドして、使用可能なブレンド生体材料を生成すると、機械的特性が向上するという同様の傾向が明らかになりました[21、23]。したがって、私たちが製造した足場は、組織工学アプリケーションで必要とされる本質的な機械的強度と柔軟性を備えています。

組織工学用の足場は、その上に細胞を付着させることができ、細胞増殖と骨誘導を促進し、細胞毒性が最も低く、受容性が高い必要があります。 SF足場に関する以前の報告では、その非細胞毒性および細胞増殖活性が確立されており[21、24]、私たちの研究は以前に報告された結果とほぼ一致していました。

その骨誘導特性のために、rhBMP2はいくつかのグループによって骨組織工学で利用されています[25、26、27]。これらの研究は、BMP2を含む足場上で培養された細胞が、骨誘導のバイオマーカーであるより高いALP活性を持っていることを明らかにしました。 BMP2の関連付けの効果は、インキュベーションの時間が進むにつれてよりよく対照的でした。キムらBMP2に関連する多孔性ミクロスフェアを利用し、骨誘導の同様の増強を観察しました[25]。

結論

rhBMP2を含むSFベースの繊維状足場の作製に成功しました。これらの足場は均質であり、適切な機械的特性と生体適合性を持っていることがわかりました。製造された足場の骨誘導能に起因するさらなるrhBMP2関連。足場は、in vivoアプリケーションでさらに評価され、骨組織工学を含むアプリケーションに適していることがわかりました。

略語

ALP：

アルカリホスファターゼ

BTE：

骨組織工学

hMSC：

ヒト間葉系幹細胞

rhBMP2：

組換えヒト骨形成タンパク質-2

SF：

シルクフィブロイン