rhBMP-2担持シルクフィブロイン足場材による骨誘導能の向上：骨組織工学への応用

要旨

医療応用におけるシルクフィブロイン（SF）足場材の処方に対する需要が高まっています。本研究では、SFをグルタルアルデヒドで架橋し、異なる比率の骨誘導性組換えヒト骨形成蛋白質-2（rhBMP-2）を担持させました：(i) 3% SFのみ（SF）、(ii) 3% SFに同量のrhBMP-2（SF+BMP2）、(iii) 12% SFに3%のrhBMP-2（4SF+BMP2）。これらの溶液を電気紡糸法でナノ足場材として作製し、rhBMP-2担持によるSF足場材の骨誘導能増強を評価しました。

応力-ひずみ関係から、rhBMP-2添加による繊維の機械的強度低下はなく、SF濃度上昇に伴い足場材の機械的強度が向上することが示されました。膨潤試験では、rhBMP-2担持により足場材の保水能が増大しました。ヒト間葉系幹細胞（hMSC）の生存率は担持足場材で高く、細胞毒性は認められませんでした。担持足場材では、in vitroおよびin vivoの両条件下でアルカリホスファターゼ（ALP）活性が高く、新規構造体の骨誘導能増強が確立されました。また、足場材はin vivo骨形成にも有効でした。

背景

骨の再生能力により、小さな骨折は自然治癒します。骨形成、癒合、そして元の形態への再構築の過程を経ます。しかし、この能力には限界があり、自家移植や同種移植が必要となります[1]。同種移植は別のドナーから骨を採取するため免疫拒絶反応のリスクがあります。自家移植は患者自身の骨を用いるため免疫学的問題はありませんが、採取可能な骨量に限りがあります[2-4]。

組織工学は、同種・自家移植の免疫学的限界を克服する潜在的技術と見なされています。ヒト間葉系幹細胞や骨肉腫細胞（MG63）などの特殊細胞を、事前作製した足場材上で適切な環境下で培養し、この細胞-足場材系を移植片として用います[5, 6]。

足場材は細胞の接着・生存・増殖のためのアンカーと生化学的ニッチを提供します。足場材料選定には、機械的強度、骨誘導性、生体吸収性、勾配多孔性、生体適合性などが考慮されます。骨誘導（骨形成誘導）は骨組織工学（BTE）用足場材料に求められる必須特性の一つです[7]。骨形成因子を担持した足場材は、血管新生と骨形成を連携させる骨組織再生プロセスを模倣し、前駆細胞の遊走と分化を促す可能性があります。骨形成蛋白質（BMP）は骨形成を誘導する成長因子の一群で、脱灰骨マトリックス（DBM）やリン酸カルシウムとともにBTE応用が提案されています[8-10]。

これまで、金属、セラミックス、合成ポリマー、複合材料、シルクフィブロインなどがBTE用足場材料として報告されています。SFは優れた機械的特性と生体適合性により、組織工学用足場材料として適していると報告されています[5]。しかし、BMPとSF電気紡糸ナノ足場材の相乗効果を評価した報告はこれまでありませんでした。

本研究では、組換えヒト骨形成蛋白質-2（rhBMP-2）担持SF電気紡糸ナノ繊維足場材の作製を報告します。純SF足場材と比較し、rhBMP-2担持が骨誘導に及ぼす影響を解明しました。また、細胞生存率と増殖特性を測定し、新規かつ優れた骨組織工学応用への足場材の有用性を検証しました。

方法

SF/BMP-2水溶液の調製

まず、カイコ（Bombyx mori）の繭から既存プロトコルに従いSFを水溶液として単離しました[11]。繭を0.02 M Na₂CO₃ 100 mLで20分間沸騰させ、蒸留水で十分に洗浄して水溶性セリシンとワックスを除去しました。抽出フィブロインを9 M臭化リチウム溶液で60℃、4時間溶解し、さらに4日間水に対して透析しました。最終濃度は乾燥後の乾燥重量から7% w/vと決定されました。この溶液を25%ポリエチレングリコール（PEG、10,000 g/mol）1 Lに対して室温で透析濃縮し、異なる濃度に調整しました。希釈SF水溶液は蒸留水で調製し、全溶液を10℃で保存しました。凍結乾燥rhBMP-2粉末をPBS（pH 3.8）に溶解し、0.22 μmシリンジフィルターで滅菌後、連続撹拌しながら各フィブロイン溶液に添加しました。グルタルアルデヒド架橋法でBMPとフィブロインを結合させました。簡潔に述べると、10 mL反応混合物に対し、6% SF 5 mLと1% rhBMP-2 5 mLを、200 μLグルタルアルデヒドと40 μL 12 N HCl（基活性化剤）で架橋しました。この手順で3種類の溶液を調製：(i) 3% SFのみ（SF）、(ii) 3% SFに0.5% rhBMP-2（SF+rhBMP2）、(iii) 12% SFに0.125% rhBMP-2（4SF+rhBMP2）。これらを電気紡糸法で足場材作製に用いました。

電気紡糸法による足場材作製

各溶液を5 mLガラスシリンジに充填し、ステンレス針（25G、内径0.26 mm、Sigma Aldrich）を取り付け、5.5 kV直流電源に接続しました。シリンジポンプで吐出流量を0.4 mL/hに維持し、毛細管チップから15 cm離したアルミ箔上に繊維を回収しました。各4時間ずつ採取しました。

走査電子顕微鏡観察

作製足場材の形態観察にはZeiss EVO40SEMを用いました。試料は観察前に金スパッタリングを行いました。繊維径は画像内のランダムな10本の繊維径を平均して求めました。

足場材の機械的特性

圧縮試験で足場材の機械的特性を評価しました（Instron 3345）。電気紡糸時間を延長して得た直径0.2 mmの繊維を用い、25℃、湿度50%で応力-ひずみ曲線から引張強度と破断伸度を測定しました。

膨潤試験

各処方をPBS（pH 7.4）に溶解し、37℃で保持しました。所定時間間隔で試料を取り出し、電子天秤で乾燥重量を測定しました。平衡重量に達するまで継続しました。膨潤率は以下の式で算出しました：

膨潤率（%）= (Ws - Wo) / Wo

ここで、Wo = ナノ繊維マトリックスの初期乾燥重量、Ws = 各時点での膨潤ナノ繊維マトリックスの重量です。

細胞培養

ヒト間葉系幹細胞（hMSC）を用いてナノ足場材の骨誘導能を評価しました。hMSCを10%胎仔牛血清、1%ペニシリン含有DMEMで37℃、5% CO₂湿潤雰囲気下、90%コンフルエントまで培養しました。トリプシン化、遠心分離後、培地に再懸濁して細胞数を定量化しました。

足場材はエタノール洗浄後、30分間UV照射で滅菌し、PBS（pH 7.4）で洗浄。培地処理後、各足場材とコントロール用プラスチックフィルムに20 μL細胞懸濁液を滴下し、37℃、5% CO₂湿潤雰囲気下で30分静置。その後、21日間DMEMで培養し、隔日で培地交換しました。

細胞接着アッセイ

細胞の足場材への接着能を評価するため、初期播種後1、3、6時間での非接着細胞数を文献法[6]に準じて測定しました。培地を回収し、血球計算盤で細胞数を計測。初期播種数と非接着細胞数の差を接着細胞数とし、以下の式で接着率を算出しました：

接着率（%）= (初期播種数 - 非接着細胞数) / 初期播種数 × 100

細胞毒性アッセイ

ナノ繊維マトリックスの毒性評価にMTT法を用いました。各時点後、MTT溶液（1 mg/mLストックをPBS pH 7.4で1:10に希釈）で4時間インキュベート。生存細胞がMTTをホルマザン塩に変換します。DMSOでホルマザンを溶解し20分放置後、マイクロプレートリーダーで570 nm吸光度を測定しました。

細胞増殖アッセイ

アラマーブルー（AB）色素還元法で足場材内の細胞増殖を測定しました。足場材をDMEMで希釈した色素で4時間インキュベートし、分光光度計で還元度を測定。AB還元率は以下の式で算出：

%AB還元 = [(εoxλ₂)(Aλ₁) - (εoxλ₁)(Aλ₂) / (εredλ₁)(A'λ₂) - (εredλ₂)(A'λ₁)] × 100

ここで、ελ₁ = 570 nmでのアラマーブルー酸化型モル消光係数、ελ₂ = 600 nmでの同還元型係数。Aλ₁、Aλ₂は試験ウェルの吸光度。A'λ₁、A'λ₂は陰性対照ウェルの吸光度。

ALPアッセイ

足場材内で培養したhMSCのアルカリホスファターゼ（ALP）産生をキットプロトコル[12]に従い測定。無菌PBS（pH 7.4）で洗浄・インキュベート後、1 mL Tris緩衝液（1 M、pH 8.0）でホモジナイズし、氷上で3分間超音波処理。溶解液25 μLをp-ニトロフェニルリン酸溶液（16 mM）1 mLと30℃で5分間反応させ、405 nmでp-ニトロフェノール生成を分光光度測定しました。

In vivo ALP活性

体重100-120 gの雄性アサイミックヌードラット9匹を用い、腹筋を両側切開してポケットを形成。各足場材（5 mm × 5 mm）を3種類ずつ筋ポケットに別々に充填し、非吸収糸で縫合。14日後にインプラントを回収し、PBSで保存。筋弁を切除し、エキスプラント組織を抽出緩衝液でホモジナイズしてALPを遊離させ、50 μL aliquotでALP活性を測定しました。

統計解析

全実験を3反復実施し、データは平均±標準偏差（SD）で表示。一元配置分散分析（ANOVA）をOrigin 6.0で実施し、有意差を検定。P < 0.05を有意としました。

結果

足場材の形態

SEM画像（図1）より、精緻に紡糸されたナノ繊維構造が確認されました。SFおよびSF+BMP2足場材の平均繊維径は、全濃度で100-900 nmの範囲で類似しており、繊維径は電気紡糸時間の関数です[13]。SFナノ繊維は均一でしたが、BMP2担持により繊維径の不均一性が生じました。足場材の孔径は均質で、フィブロイン濃度に依存しませんでした[11]。

足場材の機械的特性

応力-ひずみ曲線（図2）より、BMP添加はSF足場材の機械的特性を変化させませんでしたが、原料SF濃度上昇に伴いマトリックスの引張特性が向上しました。これは架橋時の繊維間結合形成によると考えられます。低濃度SF繊維は高濃度に比べ機械的強度が劣りました。

膨潤試験

足場材の膨潤率経時変化（図3）。全足場材は初期に均一に膨潤し、約380分で平衡に達しました。rhBMP-2担持繊維はSF単独足場材より多くの水を吸収し、BMP2結合による親水性ポケットの増大を示唆します。SF繊維は約70%で平衡、BMP2含有繊維は約81%で平衡しました。

細胞接着アッセイ

細胞の足場材への接着は細胞増殖と分化誘導の前提です。hMSCは全足場材に良好に接着し、接着率は図4に示す通りです。担持による接着能低下の懸念は払拭されました。図3より、孔径増大（SF濃度低下）に伴い接着率が上昇することが理解されます。ANOVAにより、3時間目と6時間目で有意差が認められましたが、1時間目では有意差はありませんでした。

細胞毒性アッセイと細胞増殖アッセイ

rhBMP-2担持足場材で細胞生存率が有意に向上し、細胞毒性は認められませんでした（図4）。全足場材で細胞は良好に増殖しました（図5）。生存率は経時的に上昇傾向を示し、SF+BMP2足場材が全時点で最も低毒性でした。ANOVAで3処方間の有意差が確認されました。

図6より細胞増殖を確認。全足場材で細胞は良好に増殖し、特にSF+BMP2で各時点最高値を示しました。SF+BMP2足場材の大きな孔径が細胞増殖スペースを最大限提供したと考えられます。群間差の有意性はANOVAで確認されました。

ALPアッセイ

ALP活性は細胞周囲環境の骨誘導性を示す標準的マーカーです[13]。本実験では、SF+BMP2構造体でSF単独構造体より高いALP活性を観察しました（図7）。SFナノ構造足場材単独でも骨誘導能を示しましたが、図7およびANOVAより、SF+BMP2足場材が最も優れていました。ALP濃度は経時的に上昇しましたが、SF濃度が高い構造体では低濃度構造体に比べALP活性が低下しました。

In vivo ALP活性

図8は(a) SF、(b) SF+rhBMP2、(c) 4SF+rhBMP2のエキスプラントALP活性を示します。予想通り、rhBMP-2含有処置群で高いALP活性、rhBMP-2非含有群で低い活性を示しました。

考察

足場材ベースの組織工学は再生医療での可能性を実証し、BTEツールとして着実な進歩を遂げてきました。先行研究では、微細構造と物理的特性がin vitro作製細胞-足場材構造体を骨組織へ転換する上で重要であることが示されています[14-16]。

最適な機械的特性（孔径、引張強度等）と生体適合性は、細胞定着と組織化のための重要な特徴です[17]。本研究では、BTE用足場材の作製・評価において、提案材料の有益な特性を組み合わせました。SFが強靭で生体適合性の高いプラットフォームを提供する一方、担持rhBMP-2が新規骨芽細胞形成を誘導します。SFは骨芽細胞増殖[18]や靭帯、腱、軟骨、骨、肝臓、皮膚、気管、角膜、神経、鼓膜、膀胱などの組織再生[19, 20]において様々な処方で広く研究されています。

本研究ではSFとSF+rBMP-2の水溶液を用いました。有機溶媒ではSF分解が懸念されるため、水溶液が好ましいとされています[18]。電気紡糸SF繊維は均一な繊維径と相互連結した多孔構造を持つと先行報告されており[21, 22]、本研究結果と合致します。本足場材でもビーズ状構造は観察されませんでした[21]。先行報告ではブレンド増加に伴い純SF繊維径が減少するとされています[11, 21]が、本研究ではブレンドによる径減少は観察されませんでした。ただし、rBMP-2のSF繊維への不均一な結合により、ブレンド繊維の均一性は損なわれました。

十分な機械的強度は組織足場材に必須です。本実験では純SFブレンドでナノ繊維の柔軟性が向上し、先行報告でもSFと他材料のブレンドによる機械的特性改善が報告されています[21, 23]。したがって、本足場材は組織工学応用に必要な機械的強度と柔軟性を備えています。

組織工学用足場材は、細胞接着、増殖促進、骨誘導、低細胞毒性が求められます。SF足場材の無細胞毒性と増殖促進作用は先行報告で確立されており[21, 24]、本研究結果もこれに合致します。

rhBMP-2は骨誘導特性により複数グループでBTEに利用されています[25-27]。これらの研究では、BMP-2含有足場材上で培養した細胞が高いALP活性（骨誘導のバイオマーカー）を示すことが明らかにされています。BMP-2結合効果は培養時間経過とともにより明確になります。KimらはBMP-2担持多孔性マイクロスフィアを用い、同様の骨誘導増強を観察しています[25]。

結論

rhBMP-2含有SF系繊維足場材の作製に成功しました。これらの足場材は均質で、十分な機械的特性と生体適合性を備えています。さらに、rhBMP-2担持により足場材に骨誘導能が付与されました。in vivo応用評価でも、骨組織工学応用に適していることが確認されました。

略語

ALP:

アルカリホスファターゼ

BTE:

骨組織工学

hMSCs:

ヒト間葉系幹細胞

rhBMP2:

組換えヒト骨形成蛋白質-2

SF:

シルクフィブロイン