リトコール酸で修飾された金ナノ粒子の肝臓癌細胞に対するアポトーシス効果

背景

ナノ材料としての金ナノ粒子（AuNPs）は、その独特の光学特性、優れた化学的安定性、および生体適合性により、多くの分野で広く適用されています[1,2,3,4,5]。そのため、ナノエレクトロニクス、ナノフォトニクス、触媒作用、センサー、バイオマーカー、およびその他の多くの分野で幅広いアプリケーションの見通しがあります[6、7、8]。 AuNPは表面積が大きく球形であるため、抗腫瘍薬の担体として使用できます[9、10、11、12]。さらに、多くのAuNP複合体は、主に癌を治療するための新しいタイプの抗腫瘍薬に使用されてきました[13、14]。抗腫瘍薬担体として、AuNP複合体は細胞機能を制御し、遺伝子発現を調節し、細胞内の分析物を検出することができます[15、16]。したがって、機能化されたAuNPの改善は、癌治療の研究における重要な傾向の1つになります[17、18、19]。

リトコール酸（LCA）は、胆汁中の高等脊椎動物の二次胆汁酸に広く存在します。胆汁酸の種の多様性は、胆汁酸欠乏症、胆石、および胆石の治療に使用できるなど、医学および他のいくつかの分野でのさまざまな種類の胆汁酸およびその誘導体の適用で報告されています[20、21、22]。肝疾患[23、24、25]。そして、いくつかの胆汁酸とその誘導体は、薬物担体として、肝疾患の治療、吸収促進剤、およびコレステロールの低下剤を標的にすることができます。 [26、27、28]。以前の報告では、LCAは肝がん細胞に対して非常に強力な抗腫瘍効果があり、細胞死のメカニズムはアポトーシスであることが示されています[29、30]。アポトーシスは生体細胞の能動死の過程であり、多細胞生物の体が体の発達を調節し、細胞の老化を制御し、内部環境を安定に保つことが重要なメカニズムです[31、32]。特に、増殖の抑制、分化、悪性度の低下、および腫瘍細胞のアポトーシスの促進は、腫瘍治療の目的です[33、34、35、36、37]。

この研究では、金NPとLCA誘導体を組み合わせることにより、生物学的標的特性を備えたAuNPを合成しました。 HepG2、SMMC-7721、QSG-7701、およびMCF-7細胞で48時間MTT法を使用して、細胞毒性を調べました。私たちの細胞毒性の結果は、AuNP @ MPA-PEG-LCAが他の癌細胞や正常細胞よりも効果的に複数の肝臓癌細胞の増殖を阻害できることを明らかにしました。アポトーシスは、ヘキスト33342染色、アネキシンV-FITC染色、ミトコンドリア膜電位（MMP）分析、およびAO / EB染色実験によって確認された、細胞増殖の阻害に関与しています。また、ROSレベルは肝臓癌細胞で増加し、AuNP @ MPA-PEG-LCAがROS生成を介したミトコンドリア機能障害を介してアポトーシスを誘導する可能性があることを示唆しています。

メソッド

資料

特に明記されていない限り、化学物質はSigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州）から購入し、さらに精製することなく使用しました。 RPMI-1640培地およびウシ胎児血清（FBS）は、InvitrogenCorporationから入手しました。 HepG2（ヒト肝細胞癌細胞）、SMMC-7721（ヒト肝細胞癌細胞）、QSG-7701（ヒト正常肝細胞）、およびMCF-7（ヒト乳癌細胞）は、上海生物科学研究所（上海、中国）。

AuNP @MPAの合成

J. Turkevich et al。によって開拓された方法に従って、平均サイズが4.0 nmのクエン酸塩でキャップされた金ナノ粒子（AuNP @ MPA）を調製しました。 [38]。簡単に説明すると、773μlの38.8mMクエン酸ナトリウム溶液と2mLの15mMのHAuCl ₄ 溶液を30mLのMilli-QH ₂ に溶解しました。 O、および溶液を25℃で撹拌した。次に、3mLの0.1MのNaBH ₄ （作りたて）を追加しました。 2時間25°Cで反応させた後、溶液は無色から淡いオレンジ色に変化しました。次に、無水エタノール中の0.01Mの3-メルカプトプロピオン酸（MPA）3mLをpH11で添加し、25°Cで2時間反応させ続けました。反応混合物を遠心分離して化合物AuNP @ MPAを得た。

AuNP @ MPA-PEGの合成

10.5 mg（0.0875 mmol）1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン（NHS）および7 mg（0.035 mmol）1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）を50 mM AuNP @MPA溶液に添加しました。 4-モルホリンエタンスルホン酸（MES）、および溶液を25°Cで30分間撹拌しました。次に、0.045ミリモルのNH ₂ -PEG1000-NH ₂ を加え、混合物を25℃で24時間撹拌した。反応が完了したら、混合物を遠心分離して化合物AuNP @ MPA-PEGを得た。

AuNP @ MPA-PEG-LCAの合成

超純水中の化合物AuNP @ MPA-PEGを、17 mg（0.045 mmol）のLCAを含む200μLの無水ジメチルホルムアミド（DMF）溶液に加え、反応溶液を25°Cで24時間撹拌しました。反応が完了したら、反応混合物を遠心分離して、化合物AuNP @ MPA-PEG-LCAを得た。

透過型電子顕微鏡（TEM）

AuNPの形態とサイズは、最大200kVで動作するJEOLJEM-200CXTEMで検出されました。 AuNPソリューションは銅グリッド（300メッシュ）にドロップされました。

AuNPの抗腫瘍能力アッセイ

4種類の細胞（HepG2、SMMC-7721、QSG-7701、およびMCF-7）を使用して、修飾された3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5によるAuNPの抗腫瘍能力を調査しました。 -ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）法。 0.2、0.4、0.6、0.8、および1.0 mg / mLのAuNPと元の金ナノ粒子（AuNP @ MPA）をアッセイに使用しました。各ウェルのOD570は、Tecan InfiniteM200マルチモードプレートリーダーで測定されました。

ヘキスト染色による形態の決定

AuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / mL）で24時間および48時間後、HepG2細胞を10μg/ mLのHoechst33342でセルインキュベーター内で30分間染色しました。細胞核の形態は、ライカ-SP8共焦点顕微鏡で検出されました。

細胞前期アポトーシス：アネキシンV-FITC染色

AuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / mL）で6時間後、HepG2細胞をセルインキュベーター内でアネキシンV-FITCで10分間染色し、Leica-SP8共焦点顕微鏡で観察しました。

AuNPのフローサイトメーター検出では、AuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / mL）で6時間処理した後、HepG2細胞をセルインキュベーター内でアネキシンV-FITCで10分間染色し、FACSCaliburフローサイトメーターで検出しました。 （Becton Dickinson＆Co。、ニュージャージー州フランクリンレイクス）

ミトコンドリア膜電位（MMP）の分析

AuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / mL）で37°Cで6時間処理したHepG2細胞を、10μg/ mLのJC-1（5,5 '、6,6'-テトラクロロ-1,1）とインキュベートしました。 '、3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボ-シアニンヨージド;分子プローブ）37°Cで10分間。その後、細胞はFACSCaliburフローサイトメーターで検出されました。

蛍光顕微鏡観察では、HepG2細胞をAuNP @ MPA-PEG-LCAで10分間、10μg/ mLのJC-1で処理し、Leica-SP8共焦点顕微鏡を使用して観察しました。

活性酸素種（ROS）の測定

細胞内ROSの蓄積は、2 '、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート（H ₂ DCF-DA）。 AuNP @ MPA-PEG-LCAサンプル（0.5 mg / mL）で6時間処理したHepG2細胞を、10μMのH ₂ とインキュベートしました。 DCF-DAを37°Cで30分間。そして、細胞の蛍光強度は、FACSCaliburフローサイトメーターと共焦点顕微鏡を使用して表示されました。

結果と考察

AuNPの準備と特性評価

まず、水溶性のAuNP @ MPAを調製しました（スキーム1）。図1aは、AuNP @MPAのTEM結果を示しています。 AuNP @ MPAの形状とサイズは、4.0±0.5nmのコンパクトなサイズで非常によく似た球形に見えたことが示されています。次に、AuNP @ MPA-PEG-LCAを準備しました（スキーム1）。また、粒子の形態もTEMで分析しました（図1c）。 TEM画像は、AuNP @ MPA-PEG-LCAの形態がAuNP @ MPAの形態と類似していることを示しています。また、統計分析によると、AuNP @ MPA-PEG-LCAの直径は約16nmでした。

AuNP @ MPA-PEG-LCA

の合成の概略図

a のTEM画像 AuNP @ MPA、 b AuNP @ MPA-PEG、および c AuNP @ MPA-PEG-LCA

細胞毒性の結果

AuNPの細胞毒性を調査するために、HepG2、SMMC-7721、QSG-7701、およびMCF-7細胞を選択し、AuNPおよびAuNP @MPAで48時間処理しました。また、MTTアッセイを使用して、サンプルの細胞毒性を検出しました。異なる細胞でのAuNPとAuNP @ MPAの細胞生存率を図2に示します。結果は、AuNP @MPAの細胞毒性がすべての細胞で非常に低いことを示唆しています。ただし、AuNP @ MPA-PEG-LCAは、ナノ粒子濃度の増加に伴い、複数の肝癌細胞の増殖をより効果的に阻害できますが、正常細胞や他の癌細胞への損傷は少なくなります。すなわち、HepG2およびSMMC-7721細胞に対するAuNP @ MPA-PEG-LCAの抗増殖活性はQSG-7701およびMCF-7細胞と比較して非常に高かった。

HepG2、SMMC-7721、QSG-7701、およびMCF-7細胞と48時間インキュベートしたAuNP @MPAおよびAuNP @ MPA-PEG-LCA（AuNPs）の細胞生存率

アポトーシスの誘導

アポトーシス核は、アポトーシスの一般的な指標です。示された時間AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理した後、細胞をHoechst 33342でインキュベートしました。次に、共焦点顕微鏡を使用して細胞核の形態学的特徴を観察しました。図3に示すように、コントロール細胞とAuNP @ MPAとインキュベートした細胞は、無傷で均一な細胞核染色を示します。ただし、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞のアポトーシス細胞の数は、インキュベーション時間の増加とともに徐々に増加し、細胞核は、断片化された核、凝縮したクロマチン、細胞体積の減少などの典型的なアポトーシス特性を示します。 / P>

Hoechst33342で染色されたHepG2細胞の細胞核の形態的特徴。HepG2細胞をAuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / ml）と a インキュベートしました。 0 h、 b 24時間、および c 48時間、および d AuNP @ MPA（0.5 mg / ml）を48時間インキュベートしました。アポトーシス細胞は、核の凝縮と断片化、および細胞体積の縮小を示しました。スケールバー20μm

ご存知のように、アネキシンV染色は、アポトーシスの初期段階と壊死細胞を区別することができます。アポトーシスの初期段階では、アネキシンVは、原形質膜の内面から外面に外在化する膜リン脂質ホスファチジルセリン（PS）に結合する可能性があります[39]。したがって、アネキシンV-FITC染色アッセイを介してAuNP @ MPA-PEG-LCAのアポトーシスを誘導する可能性を調査しました。図4aに示すように、コントロールの細胞膜には明らかな緑色の蛍光はありませんが、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理したHepG2細胞の細胞膜には明らかな緑色の蛍光があります。この現象は、初期アポトーシスの強力な指標です。ご存知のように、共焦点顕微鏡の画像はアポトーシスの発生を証明するだけでした。ただし、フローサイトメトリーはアポトーシスの発生を迅速かつ高感度に測定し、アポトーシス率を正確に決定することができます。したがって、フローサイトメトリーを使用してアポトーシスの段階をさらに調査しました。図4bは、フローサイトメトリーによるアポトーシス率の結果を示しています。アポトーシスのパーセンテージは、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞の約38.45％でしたが、アポトーシスのパーセンテージは、コントロール細胞では約8.16％にすぎませんでした。アポトーシスのかなりの割合は、AuNP @ MPA-PEG-LCAとインキュベートした細胞がアポトーシスを持続したことを示唆しています。

a のアポトーシスの結果 共焦点画像と b AuNP @ MPA-PEG-LCA（0.5 mg / ml）で処理したHepG2細胞のフローサイトメトリーデータ。細胞をアネキシンV-FITCで染色しました（励起は488 nm、発光は500〜560 nm）。スケールバー20μm

MMPの減少

ミトコンドリアは、シトクロムCやアポトーシス誘導因子などのアポトーシス促進因子を放出する可能性があるため、アポトーシスにおいて重要な役割を果たします[40、41、42]。そこで、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用して、MMPの変化を調べました。図5aは、共焦点顕微鏡によってAuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたJC-1標識HepG2細胞の蛍光画像を示しています。対照のHepG2細胞には明らかな赤色のJC-1蛍光と健康なミトコンドリアがあり、JC-1凝集の存在を示していることがわかります。ただし、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞では緑色蛍光が多く、膜の崩壊が起こったことを示しています。アポトーシス細胞におけるミトコンドリアの破壊は、JC-1がミトコンドリア内に蓄積するのではなく、細胞全体に分布することを示しています。そして、単量体型として、存在する散乱JC-1は緑色に蛍光を発します。 MMPの変化をさらに定量化するために、フローサイトメトリーによってJC-1で染色されたHepG2細胞を評価しました。フローサイトメトリーによってAuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞とコントロール細胞で記録された代表的なJC-1赤/緑比シグナルを図5bに示します。赤/緑の比率は、JC-1染色細胞の定量分析からAuNP @ MPA-PEG-LCAで処理された細胞で有意な減少を示したが、対照細胞では有意な増加を示したことを観察できます。 MPA-PEG-LCAはHepG2細胞にアポトーシスを誘導する可能性があります。

a 共焦点顕微鏡および b で観察したJC-1標識細胞の蛍光画像 フローサイトメトリーによって分析されたMMPに対するAuNP @ MPA-PEG-LCAの効果

ROSに対するAuNP @ MPA-PEG-LCAの影響

誰もが知っているように、アポトーシスは細胞内ROSレベルの増加によって引き起こされる可能性があり、これはアポトーシスの誘導に関与する強力な証拠でもあります[43]。ミトコンドリア機能障害がROSの生成に関連しているかどうかをさらに調査するために、H ₂ で染色されたHepG2細胞のROSレベルを測定しました。 共焦点顕微鏡およびフローサイトメトリーを使用したDCF-DA。図6aに示すように、H ₂ の緑色蛍光の強度 DCF-DAは、コントロール細胞と比較して、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞の有意な増加を示しています。つまり、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理されたHepG2細胞のROSの含有量が大幅に増加しました。次に、細胞中のROS含有量の定量分析をフローサイトメトリーによって調べた。図6bに示すように、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理した細胞では、対照細胞と比較して高い蛍光強度が検出されました。これは、AuNP @ MPA-PEG-LCAで処理した細胞のROS含有量が高いことを示しています。 。データは、ミトコンドリアの機能障害がおそらくROSの生成に関連していることを示唆しました。これらの結果は、ROSの生成がアポトーシスを誘導するAuNP @ MPA-PEG-LCAにおいて重要な役割を果たしていることを予備的に示しています。

HepG2細胞をAuNP @ MPA-PEG-LCAで6時間処理した後のROS生成の分析。 HepG2細胞のROSの含有量は、 a によって調査されました。 共焦点顕微鏡（488nmでの励起と530nmでの発光）および b フローサイトメトリー（488nmでの励起と525nmでの発光）

結論

要約すると、複数の肝がん細胞の増殖を阻害できる平均直径16.0nmのAuNP @ MPA-PEG-LCAを合成しました。 AuNP @ MPA-PEG-LCAは、アポトーシスによる細胞の増殖を効果的に抑制しました。これは、核染色、JC-1染色、MMP分析、およびアネキシンV-FITC染色実験によって証明されました。フローサイトメトリー研究では、肝臓癌細胞におけるAuNP @ MPA-PEG-LCA停止は、それらのアポトーシス挙動をさらに証明します。したがって、AuNPは、ROSを介したミトコンドリア機能障害を介してアポトーシスを効率的に誘導でき、予備的な機構研究において、肝臓癌細胞のプログラム細胞死を促進するのにより効果的です。

略語

AuNPs：

金ナノ粒子

DMF：

ジメチルホルムアミド

EDC：

1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩

FBS：

ウシ胎児血清

H ₂ DCF-DA：

2 '、7'-ジクロロフルオレセインジアセテート

HepG2：

ヒト肝細胞癌細胞

JC-1：

5,5 '、6,6'-テトラクロロ-1,1'、3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボ-シアニンヨージド

LCA：

リトコール酸

MCF-7：

ヒト乳がん細胞

MES：

4-モルホリンエタンスルホン酸

MMP：

ミトコンドリア膜電位

MPA：

3-メルカプトプロピオン酸

MTT：

3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド

NHS：

1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオン

PEG：

ポリエチレングリコール

PS：

ホスファチジルセリン

QSG-7701：

ヒトの正常な肝細胞

ROS：

活性酸素種

SMMC-7721：

ヒト肝細胞癌細胞

TEM：

透過型電子顕微鏡