PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子：毒性評価とクルクミンの保護効果

要旨

本研究では、水熱法によりポリエチレングリコール（PEG）でコーティングしたCoFe₂O₄ナノ粒子を合成しました。形態学的解析により、約24 nmの多結晶純粋相PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子が形成されたことが確認されました。CoFe₂O₄ナノ粒子による毒性を調査し、生物学的アッセイを実施して毒性影響を評価しました。さらに、クルクミンを用いて生体における毒性の治癒効果を検討したところ、クルクミン投与後に生化学指標が解毒され、正常レベルまで改善することがわかりました。したがって、水熱法で合成されたPEGコートCoFe₂O₄は生物医学用途に利用可能であり、副作用のない天然化合物であるクルクミンを、生体におけるナノ粒子誘発毒性の治療に用いることができます。

背景

ナノ粒子（NPs）は、バルク材料とは大きく異なる独自の化学的・物理的特性を持つため、多くの利点を提供します[1]。コバルトフェライト（CoFe₂O₄）は、ナノスケールで様々な先端技術への応用が期待される重要な磁性材料の一つとして注目されています[2-5]。特に、ナノスケールで所望の物理化学的特性を発現できることから、医療分野での幅広い応用が期待される有力候補とされています。また、CoFe₂O₄は特定の用途に必要な組成、形状、サイズを制御しやすく、低コストで製造可能です。生物学的応用において、100 nm以下のCoFe₂O₄ナノ粒子の直径は、生体内での物理化学的特性や薬物動態に大きく影響します。100 nm以上の粒子は消化管の磁気共鳴造影剤として、約20 nm以下の粒子は腫瘍治療のキャリアとして用いられます。コバルトフェライトナノ粒子の臨床応用には、in vivoおよびin vitroでの生体安全性の調査が極めて重要です[6, 7]。経口或いは静脈投与された多くのナノ粒子は主に肝臓、腎臓、肺に分布し、これらの臓器に様々な炎症を引き起こします。他の材料と比較して、コバルトフェライトの生体内毒性や、クルクミンを用いた治癒効果については十分に研究されていませんが、PEGコートコバルトフェライトナノ粒子の毒性と生体安全性を調査した報告はわずかに存在します[8, 9]。

毒性の観点からは、過剰曝露による蓄積ナノ粒子の生体器官からの排除と、炎症性疾患の緊急治療が主な懸念事項です。いくつかの研究者が、ナノ粒子毒性のin vivo治療に複数の抗炎症薬を試み、これらの薬剤が体内に蓄積したナノ粒子の排泄をある程度促進し、組織炎症を軽減または消失させることを報告しています[8, 9]。Curcuma longa（ウコン）は東南アジアで炎症性疾患の治療薬として長い歴史を持つ伝統的薬用ハーブです。クルクミンの抗酸化作用、抗変異・抗腫瘍効果、発癌性特性については多数の研究が報告されています[10, 11]。クルクミンは創傷治癒、肝疾患、尿路疾患、肝炎の治療効果を持ち、Nrf2-Keap1経路を介して慢性疾患における酸化ストレスと炎症を軽減します。また、大部分の慢性疾患に関連するプロ炎症経路を抑制し、TNFの産生とTNFによる細胞シグナル伝達を様々な細胞種で阻害します。さらに、クルクミンはTNFと直接結合することで、in vitroおよびin vivoでTNFブロッカーとして作用する可能性があります[12]。

本研究では、水熱法を用いて形状とサイズが約25 nmに制御されたPEGコートCoFe₂O₄ナノ粒子を調製しました。CoFe₂O₄ナノ粒子の異なる曝露量（用量）投与後、血液検査、HE染色、生体内分布、およびクルクミンによるPEG-CoFe₂O₄ナノ粒子毒性の治療効果を検討しました。本研究は、CoFe₂O₄ナノ粒子の毒性影響を調査し、続いてクルクミンを用いて生体内でのPEG-CoFe₂O₄ナノ粒子毒性を治療する新たなアプローチを提示します。

方法

コバルトフェライトナノ粒子の調製

コバルトフェライトナノ粒子を水熱法で合成しました。硝酸鉄(III)と塩化コバルト(II)を脱イオン水に溶解し、PEGおよび水酸化ナトリウム（NaOH）水溶液と混合しました。最終ナノ粒子に不純物が混入しないよう、二重蒸留脱イオン水を溶媒として使用しました。混合物を磁気攪拌機で約30分攪拌後、オートクレーブに移し、180℃で6時間水熱反応を行いました。反応完了後、室温まで冷却し、脱イオン水で2回、次にエタノールで洗浄して過剰なPEGや未溶解塩を除去しました。最後に80℃で一晩乾燥させ、粉砕して目的のコバルトフェライトナノ粒子を得ました。この段階ではナノ粒子は非晶質であり、XRD（図2a）で確認されました。結晶化させるため、試料を500℃で6時間焼成し、結晶性PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子を得ました（XRD、図2bで確認）。

PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子の⁹⁹ᵐTc標識

PEGコートCoFe₂O₄ナノ粒子を、還元剤として塩化第二スズ（SnCl₂）を用いて⁹⁹ᵐTcで放射性標識しました。ナノ粒子を脱イオン水に分散し、超音波条件下で約0.5時間処理しました。その後、SnCl₂、アスコルビン酸、⁹⁹ᵐTcO₄⁻をナノ粒子懸濁液（コバルトフェライト約0.4重量%）に添加しました。⁹⁹ᵐTcの半減期が短い（約6時間）ため、放射能カウントは24時間以内に測定しました。混合物のpHを1.0 M NaHCO₃溶液で5〜10に調整し、PEG-CoFe₂O₄懸濁液を加えて、80℃で10,000回転/分で25分間攪拌しました。遠心分離後、上清を除き、残渣を⁹⁹ᵐTc-PEG-CoFe₂O₄として同定しました。紙クロマトグラム（生理食塩水とアセトンを展開溶媒として使用）で標識化合物の収率を測定しました。ナノ粒子の放射性標識収率は約70%で、生体内での実際の分布と代謝を反映しています。

PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子の生体内分布

体重15〜18 gのクンミンマウスを中国蘭州大学医学実験センターから入手しました。全動物を温度制御システム（21〜22℃）、照明サイクル（8:00〜20:00）の個別ケージで飼育しました。欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）および甘粛省医学実験動物センターと蘭州大学動物実験委員会のガイドラインに従い、適切な餌と水を与えました。マウスを無作為に7群（各群5匹）に分け、⁹⁹ᵐTc-PEG-CoFe₂O₄溶液を静脈投与し、投与後1、6、16、24時間で安楽死させました。心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓の組織を直ちに摘出し、大量の血液を採取しました。各組織を箔で包み、秤量後、⁹⁹ᵐTcを測定しました。データポイントは放射能の物理的崩壊で補正しました。組織分布を、湿重量1 gあたりの投与量パーセント（%ID/g）で示しました。これは、（組織放射能/総投与放射能）× 100 / 湿重量（g）で計算されます。

マウスにおけるPEG-CoFe₂O₄の用量依存性毒性

21匹のマウスを7群（各群3匹）に分けました。PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子を、125、250、350 μg/マウス（0.2 ml）の異なる用量で静脈投与し、対照群には0.9%生理食塩水を投与しました。治療群には、同用量のクルクミンを静脈投与しました。障害群は24時間後、治療群は3日後に安楽死させました。マウスから血液を採取し、約10分遠心分離して血清を得ました。血清中の総ビリルビン（TB）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニン（CREA）、シスタチンC（Cys-C）を測定しました。同時に、肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓を摘出し、10%緩衝ホルマリンで固定し、ヘマトキシリン・エオシン染色で常規組織学的処理を行いました。オリンパスMicrophot-CX41顕微鏡とデジタルカメラで組織を顕微鏡観察しました。

結果と考察

TEMおよびXRD解析

形態学的解析は、JEOL JEM-1400透過型電子顕微鏡とX線回折装置（島津XRD-7000、Cu Kα線源）で行いました。図1に、異なる分解能でのPEGコートコバルトフェライトナノ粒子のTEM像（図1a, b）を示します。約24 nmの粒子サイズで、純粋相PEGコートコバルトフェライトナノ粒子が形成されたことが確認されました。図2に調製ナノ粒子のX線回折解析を示します。図2aは調製直後の試料のXRD結果で、ナノ粒子が主に非晶質であることを示しています。しかし、試料を高温（500℃）で6時間焼成すると、ナノ粒子が結晶化し、図2bのXRD像で確認できます。平均結晶子サイズは、XRD解析（図2b）で最も強いピークの線幅拡大からDebye-Scherrer式（D = Kλ / βcosθ）[13]を用いて計算し、約22 nmでした。XRDパターンの全ピークの位置と相対強度は、JCPDFカード（カードNo. 20-1086、図2bインセット参照）に従い、立方スピネル構造の形成を支持しています。全ピークが適切に指数付けされ、追加のピークは見られず、試料に不純物がないことを示しています。TEMとXRDの両結果が、約22〜25 nmの結晶性ナノ粒子の形成を確認しています。

フーリエ変換赤外分光法、ラマン、TG解析

フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を用いて、コバルトフェライトナノ粒子の構造的特性と陽イオン分布を調べました。図3に室温での試料の赤外スペクトルを示します。一般にコバルトフェライトは、400〜600 cm⁻¹の範囲にν₁とν₂という2つの強い吸収帯を持ちます[14-16]。本研究でもこれらは明確に観察されました。高波数側のバンド（ν₁）は四面体格子サイトにおける金属-酸素（M-O）の固有伸縮振動に対応し、低波数側のバンド（ν₂）は八面体サイトにおける金属イオンの伸縮振動を表します[14-16]。これらの結果は、立方構造コバルトフェライトナノ粒子の形成を裏付けています。FTIRデータから、約3400 cm⁻¹に見られるピークは明確にPEG由来であり、PEGがコバルトフェライトナノ粒子に結合したことを確認しています。

室温ラマンスペクトルを図4に示します。190〜684 cm⁻¹の範囲で異なるピークが観察されました。高周波数の主ピーク（684 cm⁻¹）はスピネルフェライトの特性ピークで、A₁gモードに帰属し、四面体サイトにおけるFe-O結合に沿った酸素イオンの対称伸縮に対応します[17]。低周波数側のピークもスピネル構造コバルトフェライトに属します。これら全てのピークが適切なエネルギーで出現することは、PEGコート立方CoFe₂O₄ナノ粒子の形成を確認しています。

試料（CoFe₂O₄、PEG、PEG-CoFe₂O₄）の熱重量分析（TGA）を50〜600℃で行い、結果を図5に示します。これらの熱重量曲線から、CoFe₂O₄ナノ粒子は200〜300℃で、PEGは400℃以下で、PEG-CoFe₂O₄は200〜400℃の温度範囲で重量減少を示します。PEGの熱安定性は比較的低い（図右側）ですが、PEG-CoFe₂O₄の熱安定性は80%以上と見られます。純粋なコバルトフェライトナノ粒子は水に不溶ですが、親水性のPEGでコートすることで水に容易に分散します（図6）。時間経過とともに粒子が瓶底に沈殿するのは、ナノ粒子の重力によるものと考えられます。図6はPEGコートコバルトフェライトナノ粒子の溶解の時間変化を示します。本研究では、マウスへの投与前にナノ粒子を生理食塩水で完全に分散させ、マウスの様々な臓器への適切な送達を確保しました。

生体内分布試験

生体投与後の各臓器におけるナノキャリアの量を正確に定量するため、正常マウスで⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄の生体内分布を調べました。図7に示すように、PEG-CoFe₂O₄の取り込みは肝臓と脾臓で高く、これは文献[18]で報告されている、投与後1時間での放射性標識コバルトフェライトの肝臓と脾臓への取り込みが他の磁性ナノ粒子の3倍であるという結果と一致します。理由は、網内系に属する肝臓と脾臓の組織がこれらの異物粒子を多く取り込むためです。これらの臓器にはKupffer細胞があり、食作用によってナノ・マイクロ材料を体液循環から除去する主要な役割を果たしています[19]。本研究では、PEG-CoFe₂O₄の組織分布が時間経過とともに減少することが観察され、PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子が尿路排泄により時間とともに排出されることを示唆しています。腎臓はナノ粒子の尿中排泄器官です。図7では、腎臓での最大生体内分布が1時間後に観察されます[20]。血液中の蓄積は投与直後のみ高く、体内血液プールからの放射能クリアランスが比較的速いことを示しています（図7）。これはPEG鎖を持つ酸化鉄ナノ粒子が血液プールに長く留まるケースと類似しています[21, 22]。また、心臓での生体内分布は非常に低く、文献[23]の報告と一致します。脾臓は老化赤血球の破壊とヘモグロビン結合鉄のリサイクルの主要部位です[18, 24]。時間経過とともに、脾臓ではより遅いが効率的なプロセスが働き、循環からナノ粒子を除去する能力が高く、投与後1時間以降で組織放射能濃度が増加することが観察されました。PEG-CoFe₂O₄の肺への取り込みは本研究全体で無視できるレベルでした（図7）。同様の結果が文献[23]で報告されています。これは、マイクロ凝集体が肺毛細血管に不可逆的にトラップされないことを示しています[23, 25, 26]。

PEG-CoFe₂O₄の用量依存性毒性

PEG-CoFe₂O₄の潜在的毒性を明らかにするため、マウスでin vivo生化学試験を行いました。生理食塩水とPEG-CoFe₂O₄の混合溶液を異なる量（150、250、350 μg）で投与し、24時間後にマウスを安楽死させました。血液検査では、血液を採取し約10分遠心分離して血清を得ました。肝臓と腎臓の機能マーカーであるCys-C、CREA、ALT、AST、TB、BUNに焦点を当て、各パラメータを対照群と比較しました（SPSSソフトウェア使用、p < 0.05で有意差あり）。結果を図8に示します。ALT、BUN、CREAで曝露群と対照群の間に有意差が見られました。TBとCys-Cは主に腎機能のバイオマーカーですが、PEG-CoFe₂O₄ 150 μg/マウス曝露で有意に減少し、250 μg/マウスで増加、350 μg/マウスで正常レベルに戻りました。これは、PEG-CoFe₂O₄曝露がある程度まで腎機能に影響するが、組織を著しく損傷しないことを示唆しています。肝機能のバイオマーカーであるASTは、全用量で対照群と比較して有意に減少し、腎臓よりも肝機能により影響を与える可能性を示しています。これらの結果から、PEG-CoFe₂O₄ 250 μg/マウスの用量が比較的大きなダメージを示すため、更なる解析と実験ではこの用量を使用しました。

PEG-CoFe₂O₄毒性に対するクルクミンの効果

本研究では、PEG-CoFe₂O₄のダメージ効果による炎症を軽減するためにクルクミンを用いました。クルクミンのPEG-CoFe₂O₄毒性に対する効果を調べるため、治療群マウスの生化学指標と組織組織学を測定しました。生化学指標には、治療群マウスの血清中のBUN、CREA、Cys-C、ALT、AST、TBが含まれます。BUN、CREA、Cys-C、ASTは、曝露群と比較してクルクミンの異なる用量で有意に減少しました。一方、150 μg/マウスのクルクミン用量では、ALT、AST、CREAが対照群と比較して正常レベルに戻りました（図9）。TBとALTでは、全クルクミン用量で曝露群と比較して有意に減少しました。図9の結果は、クルクミンがマウスにおけるPEG-CoFe₂O₄のダメージに対して肯定的な治療効果を示し、異なる用量のクルクミンがより良い治療効果を示すことを示しています。本研究は、クルクミンの肝酵素（ALT、AST）と腎酵素（BUN、CREA、Cys-C、TB）の血清レベルに対する保護効果を調査しました。PEG-CoFe₂O₄は、対照群と比較してALT、AST、BUN、CREA、Cys-C、TB酵素の血清レベルを有意に上昇させましたが、クルクミン投与後はほぼ正常レベルに近づきました。壊死や細胞膜損傷によりこれらの酵素が血中に放出されますが、血清レベルは肝臓と腎臓の機能に関連しています。クルクミン投与群ではこれらの酵素量が減少し、PEG-CoFe₂O₄ナノ粒子の毒性に対するクルクミンの保護効果を示しています。これはクルクミンの抗酸化作用による酸化ストレス軽減によるものです。さらに、TNF-αとIL-1は肝壊死の誘導に関与するため、クルクミンはマクロファージによるTNF-αとIL-1の分泌を阻害することで毒性効果を軽減できます[11]。これらの知見は文献[27]の報告と一致します。

肝臓、腎臓、脾臓の病理組織学的解析も行い、ナノ粒子投与による毒性影響の有無を検証しました。各マウスの臓器を摘出し、10%ホルマリンで処理後、パラフィン包埋しました。5 μm厚の切片をヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色し、顕微鏡観察しました。結果として、解析した臓器に病理組織学的な有意な変化は認められませんでした（図10）。肝臓と脾臓の検査では、臓器構造がコバルトフェライトナノ粒子投与によって影響を受けないことが示されました。これは2つの理由が考えられます。第一に、ナノ粒子サイズが比較的大きい（24 nm）、第二に、コバルトフェライトナノ粒子の投与量が少ない（150、250、350 μm）上、24時間後に安楽死させたため、臓器機能には影響しても構造には影響しなかった可能性があります。これは文献[28]で報告されたケース（20 mg/kg、本研究より高用量、7日間投与）や、文献[29]で臓器に組織学的変化が見られなかったケースと類似しています。

結論

本研究では、水熱法を用いて24 nmのPEGコートコバルトフェライトナノ粒子を合成しました。異なる用量のPEGコバルトフェライトナノ粒子を用いてマウスの様々な臓器における毒性を詳細に調査し、続いてクルクミンによる治癒効果を検討しました。CoFe₂O₄ナノ粒子の毒性を確認するため生物学的アッセイを実施しました。クルクミン治療後、生化学指標に肯定的な変化が見られ、正常レベルに戻るか大幅に減少しました。本研究は、水熱法で合成されたPEGコートCoFe₂O₄が優れた薬物キャリアモデルとなり得ること、また副作用のない天然化合物であるクルクミンが、生体における毒性治療や他の疾患治療に利用できることを示しています。

略語

ALT:

アラニンアミノトランスフェラーゼ

AST:

アスパラギン酸トランスフェラーゼ

BUN:

血中尿素窒素

CREA:

クレアチニン

Cys-C:

シスタチンC

FTIR:

フーリエ変換赤外分光法

H&E:

ヘマトキシリン・エオシン

NPs:

ナノ粒子

Nrf2:

核因子エリスロイド2関連因子2

PEG:

ポリエチレングリコール

TB:

総ビリルビン

TEM:

透過型電子顕微鏡

TGA:

熱重量分析

TNF:

腫瘍壊死因子

XRD:

X線回折