ナノ粒子送達アルテスネートがミトコンドリアアポトーシス活性化により抗腫瘍効力を増強

概要

アルテミシニンおよびその誘導体は広範な抗がん活性を持ち、腫瘍細胞に有意な抗がん効果を示します。これらは速やかに吸収され、広く分布し、選択的に腫瘍細胞を殺傷します。しかし、低濃度のアルテスネート（Ats）は主にオンコーシス（偶発的壊死様死）に依存して腫瘍細胞死を誘導するため、抗腫瘍効果は限定的でした。より優れた抗腫瘍効果を得るため、本研究では新規ナノテクノロジーを活用し、アルテスネート担持牛血清アルブミンナノ粒子（Ats-BSA NPs）を設計し、Atsのミトコンドリア蓄積を達成してミトコンドリア媒介アポトーシスを誘導しました。その結果、遊離Atsがオンコーシス死に依存するのに対し、Ats-BSA NPsはより高い細胞毒性を示し、ミトコンドリアへのAts分布を通じて有意なアポトーシス効果を誘導しました。このことは、Ats-BSA NPsがミトコンドリア完全性を損傷し、アポトーシス関連タンパク質をアップレギュレートし、シトクロムCの迅速な放出を促進することでミトコンドリア媒介細胞アポトーシスを活性化することを示しています。

背景

アルテミシニンおよびその誘導体は、高い抗マラリア活性と低毒性からマラリア治療に広く用いられています。また、患者への毒性副作用が少なく耐容性が高いことから、顕著な抗腫瘍活性も示すことが分かっています[1]。アルテスネート（Ats）が腫瘍細胞増殖を明確に抑制し、更なる抗がん効果を誘導することが報告されています[2-4]。実験により、Atsが48時間後に腫瘍細胞で様々な程度のアポトーシスとオンコーシスを引き起こし、その程度がAts用量依存的であることが示されました[5-8]。低濃度ではAtsは明確なアポトーシスを誘導せず、オンコーシス様死を伴う細胞死が生じます。より高い抗腫瘍効果を得るためにAts高用量を投与すると、深刻な毒性と骨髄抑制が確認されました[9-11]。したがって、Atsの有効用量を減らして抗腫瘍効率を高める効果的な治療法を見つける必要があります。ミトコンドリアがAtsのアポトーシスおよびオンコーシス効果の調節、および多様なアポトーシスシグナル伝達過程の制御に重要な役割を果たすことが分かっています[12-17]。薬剤によりミトコンドリアが攻撃されると、透過性が亢進し膜電位が低下し、ミトコンドリア膜の内膜腫脹とシトクロムCの細胞質への迅速な放出を招きます[18-20]。さらに、カスパーゼファミリーのタンパク質が活性化され、細胞アポトーシスのカスケード反応が誘導されます。

Atsの抗腫瘍効果を高めるため、腫瘍細胞内での薬物分布増加や、細胞小器官への標的送達改善による細胞死誘導など、多くの新技術が試みられてきました[21-23]。ナノ粒子（NPs）は標的がん治療の鍵となるツールとして広く研究され、有望な潜在能力を示しています。NPsは微小粒子サイズと高い表面積を備え、毛細血管を通じて血液循環に入り、内皮細胞隙間を通過して腫瘍部位に移行し、薬物の標的分布とバイオアベイラビリティ向上を実現します。さらに、NPsは生体材料の分解を通じて薬物放出を長期かつ平滑に制御し、消失半延長、有効血中濃度改善、投与頻度低減を可能とします。何より、薬物担持NPsを細胞内特定部位に送達でき、治療効率を向上させます[24-26]。

低濃度でのAts抗腫瘍効果を高めるため、新規Ats担持牛血清アルブミン（BSA）NPsの設計を試みました。腫瘍細胞内の低pH環境では、外側ミトコンドリア膜または膜間腔に大量の水素プロトンが蓄積する一方、ミトコンドリア内膜は化学組成とマトリックス分泌により負電荷が豊富で、膜外陽性・膜内陰性の膜電位が形成され、BSAの送達に有利に働きます。こうしてミトコンドリアに大量蓄積したAtsが、ミトコンドリア媒介アポトーシスを効果的に引き起こします。遊離Atsによる典型的なオンコーシス死と比較し、AtsがBSA NPsの媒介でミトコンドリアへ特異的に輸送され、アポトーシス関連カスパーゼタンパク質のミトコンドリア媒介活性化を促進し、有意な細胞アポトーシスを誘発し、より高い細胞毒性を示すことが明らかになりました。

実験方法

材料

BSAはSigma-Aldrich（米国ミズーリ州セントルイス）、AtsはGuilin Pharmaceutical Corporation（中国桂林）から購入。SMMC-7721細胞とPlc細胞は中国科学院上海生物化学細胞生物学研究所から入手。その他の試薬は分析級を各社から購入。

Ats担持BSA NPsの調製とキャラクタリゼーション

先行文献[27]に従い、脱溶媒法でAts担持BSA NPsを調製しました。簡潔に述べると、37 °CでBSA溶液0.5 mLに、一定量のAtsを含む無水アルコール1.0 mLを速やかに滴下し、乳濁するまで行いました。ロータリーエバポレーターでエタノールを除去後、水中8%グルタルアルデヒド（BSA 1 mgあたり0.5 μL）を添加し、24時間攪拌下で粒子架橋を誘導しました。最後にNPsを回収し、脱イオン水で3回洗浄後、Brookhaven Zetasizer（Brookhaven Instruments）と透過型電子顕微鏡（JEM-1200EX、JEOL）を用いて、動的直径、ポリ分散指数（PDI）、ゼータ電位、形態などの物理的特性を解析しました。AtsのBSA NPs内包装効率は先行法[27]で推定しました。

MTTアッセイ

SMMC-7721細胞とPlc細胞を20%胎仔牛血清（FBS）で別々に培養し、細胞数で密度を1×10⁶ cells/mLに調整後、1×10⁵ cells/mLに希釈しました。96ウェルプレートに100 μL/ウェル（約1×10⁴ cells/ウェル）ずつ分注し、37 °C、5% CO₂、95% O₂で24時間培養しました。培地を血清フリー培地に置換し、遊離Atsまたは異なる濃度のAtsを含むAts-BSA NPsを添加してさらに24時間培養。その後、5 mg/mL MTT溶液50 μLを添加し4時間培養。テトラゾリウム染料MTTが不溶性フォルマザンに還元された後、1000 rpmで5分遠心し、上清を除去、DMSO 150 μLで結晶を完全溶解。マイクロプレートリーダー（Syneray-2、BioTek）で490 nm吸光度を測定しました。

細胞内でのBSA NPグループの分布

対数増殖期のSMMC-7721細胞とPlc細胞をトリプシン処理し、濃度を1×10⁶ cells/mLに調整。6ウェルプレートに播種し付着後、培地を除去しローダミンB標識BSA NPsを添加。核をHoechst（青）で15分間染色（37 °C）、ミトコンドリアをMitoTracker Green FMで染色。共焦点レーザー走査顕微鏡（FluoView FV10i、Olympus）で細胞内のBSA NPs位置を追跡しました。

ミトコンドリア膜電位変化

JC-1を用いてミトコンドリア膜電位変化を測定しました。膜電位が高い場合、JC-1は細胞膜を自由に通過しミトコンドリア内で凝集体を形成し赤色蛍光（励起525 nm、蛍光590 nm）を示します。膜電位が低下すると、JC-1はミトコンドリアマトリックスから細胞質へ移行し緑色蛍光単量体（励起490 nm、蛍光530 nm）を形成します。SMMC-7721細胞とPlc細胞を共焦点ディッシュに1×10⁶ cells/mLで播種し12時間培養。培地を除去し、遊離AtsまたはAts-BSA NPs分散液を含む血清フリー培地を添加。9時間後、培地を除去しPBSで2回洗浄後、2 μmol/L JC-1 2 mLを添加し、暗条件下37 °Cで30分間インキュベート。レーザー走査共焦点顕微鏡（FluoView FV10i、Olympus）でミトコンドリア膜のイメージング変化を観察しました。

ROS生成測定と小胞体（ER）染色

細胞を20% FBSで培養し、密度を1×10⁶ cells/mLに調整後、1×10⁵ cells/mLに希釈。96ウェルプレートに100 μL/ウェル（約1×10⁴ cells/ウェル）分注し、37 °C、5% CO₂、95% O₂で24時間培養。次に、遊離AtsとAts-BSA NPsを細胞と6、12、24時間インキュベートし、さらに10 μM DCFH-DA（Sigma-Aldrich）で約30分間連続培養。氷冷PBSで3回洗浄し未内在化NPsを除去。細胞内DCF蛍光強度（励起485 nm、蛍光530 nm）をマイクロプレートリーダー（Synergy-2、BioTek）で検出し、酸化ストレス程度を調べました。試験群をSMMC-7721細胞とPlc細胞で24時間処理し、ER-Tracker Blue-White DPXプローブ（Molecular Probes）を添加して30分間インキュベート。ロード液を除去しPBS洗浄後、共焦点レーザー走査顕微鏡でER形態変化を観察しました。

フローサイトメトリーによる細胞オンコーシスとアポトーシス評価

先行研究プロトコル[28]に従い、Annexin V-FITC/プロピジウムヨウ化物（PI）染色アッセイで遊離AtsとAts-BSA NPsによる細胞オンコーシスとアポトーシスを評価。細胞をトリプシンで溶解し、1×10⁶ cells/mLで6ウェルプレートに播種し24時間培養。培地を除去し、遊離AtsとAts-BSA NPsを含む血清フリー培地を添加。処理後、細胞を回収し、PI標識とFITC標識Annexin V（AV-FITC）を含むNicolettiバッファー（Beijing 4A Biotech）に懸濁。共焦点レーザー走査顕微鏡で細胞形態変化を観察。Ats担持NPsによる細胞アポトーシスとオンコーシス率を検証するため、初期アポトーシス（Q4）、オンコーシス（Q2）、ネクロシス（Q1）、生存細胞（Q3）の割合をフローサイトメトリーで定量しました。

ウェスタンブロットによるアポトーシス関連タンパク質とシトクロムCの解析

遊離AtsまたはAts担持NPsをSMMC-7721細胞と24時間インキュベートした際の相対タンパク質レベルをウェスタンブロットで測定。細胞をプロテアーゼインヒビターカクテルとホスファターゼインヒビター（Roche）含有氷冷RIPAバッファーで溶解。修正BSAアッセイキット（Thermo Fisher）でタンパク質濃度を測定し正規化後、10% SDS-PAGEで電気泳動。標的タンパク質レベルをUVPゲル解析システム（iBox Scientia 600、UVP）で撮影・解析しました。

結果

Ats担持BSA NPsの特性と細胞生存率試験

図1a,bより、Ats担持BSA NPsは球形で均一に分散し、PDIは0.016と低値でした。平均粒子径は約99.9±2.3 nm、ゼータ電位は約-25.6±4.3 mVと負値でした。放出プロファイル（図1c）は平滑な持続放出を示しました。遊離Atsが培地中で最初の6時間で85%以上急速放出されるのに対し、BSA NPs核心に封入されたAtsはBSAの継続的分解により内部から緩やかに拡散し、48時間での累積放出量は78.9%でした。これはNPsが生体材料分解を介して薬物放出を長期かつ平滑に制御し、消失半延長、有効血中濃度改善、投与頻度低減を実現することを示しています。

MTTアッセイで遊離AtsとAts-BSA NPsのSMMC-7721細胞とPlc細胞に対する抑制効果を様々な時間で検証しました。結果（図1d,e）は、遊離Atsの細胞毒性が薬物濃度増加とともに上昇し、Ats-BSA NPsも漸増的な細胞毒性増強を示しました。両者とも腫瘍細胞増殖を抑制し、抑制率はAts用量依存的でした。遊離Atsと比較し、Ats-BSA NPsは両細胞でより高い細胞毒性と感受性を示し、より大きな細胞抑制をもたらしました。図1d,eに示す通り、24時間後のAts-BSA NPs処理群では遊離Ats群と比較して両細胞で有意に細胞生存率が低下しました。SMMC-7721細胞とPlc細胞のAts-BSA NPs処理におけるIC50値はそれぞれ50.1と44.9 μg/mL（24時間）で、遊離Ats処理群の69.2と74.9 μg/mL（24時間）より低値でした。これはAtsがBSA NPsに担持されることで、NPs媒介で細胞内局在が変化し、結果としてより多くの細胞を死滅させることを示唆しています。

BSA NPsのin vitro細胞取り込み

共焦点レーザー走査顕微鏡で両腫瘍細胞におけるBSA NPsの細胞内分布と局在を観察しました（図2）。ローダミンB標識NPsを細胞と3時間共培養後、細胞質に明確な赤色蛍光が観察され、時間経過とともに大部分のBSA NPsが細胞内に取り込まれ細胞質へ拡散し、赤色蛍光が時間依存的に増強されました。また、細胞質内のBSA NPsがミトコンドリアと共局在し、ローダミンB由来の固有赤色蛍光とMitoTracker Green FMの緑色蛍光が合流して黄色蛍光を呈することが観察されました。これは内在化したBSA NPsがミトコンドリア内に特異的に蓄積可能であり、AtsがBSA NPs媒介でミトコンドリアへ送達可能であることを示唆しています。

ミトコンドリア膜電位解析

Ats-BSA NPsがミトコンドリアへAtsを送達した後、ミトコンドリア機能に干渉するかどうかを明らかにするため、ミトコンドリア膜電位変化を測定しました。図3に示す通り、JC-1染色後、遊離Ats処理腫瘍細胞の大部分のミトコンドリアは強い赤色蛍光と弱い緑色蛍光を示し、JC-1の大部分が凝集体状態で存在し、ミトコンドリア膜の完全性と高電位が保たれていることを示唆しました。対照的に、Ats-BSA NPs処理細胞では両腫瘍細胞のミトコンドリアにより強い緑色蛍光が見られ、ミトコンドリア膜が深刻に損傷し電位が有意に低下していることを示しました。これらより、AtsがBSA NPs媒介でミトコンドリアへ送達され、ミトコンドリア膜脱分極を引き起こすことが証明されました。

ROS生成測定とER染色

大量のROS生成がミトコンドリア内膜のリン脂質過酸化を引き起こし、ミトコンドリア膜電位低下とシトクロムC迅速放出を招くことは広く知られています。DCFH-DAを蛍光プローブとしてROS変化を検出しました。DCFH-DAは細胞膜を自由に通過し、エステラーゼ加水分解でDCFHに変換されます。生成したDCFHは細胞膜を通過できず、容易に細胞内にローディングされます。細胞内ROSが非蛍光DCFHを緑色蛍光DCFに酸化するため、DCF蛍光検出で細胞内ROSレベルを指標とできます。

両細胞を遊離AtsとAts-BSA NPsで一定期間処理すると、細胞内ROS量も時間依存的に増加しました。遊離Atsと比較し、Ats-BSA NPs処理のSMMC-7721細胞とPlc細胞でのROS生成が有意に増強されました。図4aより、48時間曝露でROSレベルが遊離Ats処理群比でSMMC-7721細胞1.53倍、Plc細胞1.28倍に上昇しました。これはNPsが細胞内ROS生成を加速することを支持します。対照群と遊離Ats群と比較し、Ats-BSA NPs処理後、ER-Tracker Blue-White DPX（ER特異的染料）による蛍光染色強度が有意に増加し、Ats担持NPs処理細胞でROSレベル上昇に対応してERストレスも誘発されることを示唆しました。この所見は、AtsがBSA NPs媒介でミトコンドリアに特異的に局在し、細胞内酸素フリーラジカルレベルを有意に上昇させ、ERストレスを誘発し、ミトコンドリア経路を活性化してカスパーゼ依存性細胞アポトーシスを誘導することを強調しています。

細胞アポトーシスとネクロシスの評価

Annexin V-FITC/PI染色アッセイで細胞を処理しました。生存細胞はAnnexin V-FITC/PIに結合せず蛍光なし。アポトーシス細胞はPIに結合せずAnnexin V-FITCで染色され緑色蛍光。一方、オンコーシス細胞は細胞膜が損傷し核が拡大・破砕するため、緑色と赤色両方の蛍光を示します。図5aに示す通り、対照群と比較し、遊離AtsとAts担持NPsを24時間インキュベートした細胞では強い緑色と赤色蛍光が観察され、両者とも腫瘍細胞オンコーシスとアポトーシスを誘導することを示しました。特にAts-BSA NPs処理後、Annexin V-FITCとPI由来の染色蛍光強度が有意に増加し、Ats担持NPs処理細胞でオンコーシスとアポトーシス程度が有意に増強されたことを示唆しました。

初期アポトーシス（Q4）、オンコーシス（Q2）、ネクロシス（Q1）、生存細胞（Q3）の割合を図5bに示します。遊離Ats処理では、オンコーシス率がSMMC-7721細胞で24.4%、Plc細胞で4.6%に漸増し、アポトーシス率はそれぞれ4.9%と7.1%に留まり、遊離Atsはオンコーシスとアポトーシス両方を誘導して細胞死をもたらすものの、オンコーシス優位であることが示唆されました。対照的に、Ats-BSA NPsは細胞アポトーシスとオンコーシス率を有意に改善しました。アポトーシス率はSMMC-7721細胞で10.9%、Plc細胞で11.5%に有意増加。オンコーシス率もSMMC-7721細胞で29.0%、Plc細胞で21.6%に増加。これは、BSA NPs媒介のミトコンドリア送達によりAtsがオンコーシスとアポトーシス効果を増強し、腫瘍細胞死を加速することを示しています。Ats-BSA NPsはアポトーシスシグナル伝達過程を引き金とし、ミトコンドリア媒介の細胞アポトーシスカスケード反応を促進します。

ウェスタンブロット解析

遊離AtsとAts担持NPsによる細胞死のアポトーシス依存性を探るため、ウェスタンブロットでアポトーシス関連タンパク質発現を検証しました。Ats担持NPs処理SMMC-7721細胞では、Baxタンパク質の細胞内発現レベルが有意に増加しました（図6）。これはBSA NPsの助けでAtsがミトコンドリアに蓄積し、ミトコンドリア機能不全を引き起こすことを示唆します。細胞質のBax単量体タンパク質がミトコンドリア外膜へ移行しオリゴマー化してタンパク質チャネルを形成し、膜透過性を増大させます。細胞質内シトクロムC発現レベルも特に有意に増強され、カスパーゼ-3とカスパーゼ-9発現も上昇傾向を示しました。したがって、ミトコンドリア膜透過性亢進によりシトクロムCが細胞質へ迅速放出され、細胞死シグナルタンパク質（カスパーゼ）が活性化され、細胞アポトーシスのカスケード反応が促進されます。対照的に、遊離Atsはアポトーシス関連タンパク質とシトクロムC発現に有意な差をもたらさず、遊離Atsがミトコンドリア媒介アポトーシスを誘発せず、主にオンコーシスに依存して細胞死を導くことを示唆します。BSA NPsは薬物のミトコンドリア蓄積を増強し、ミトコンドリア媒介アポトーシス効果を活性化し、有意なアポトーシスを誘導し、主要アポトーシス関連タンパク質発現を増加させました（ウェスタンブロット解析で示した通り）。

考察

オンコーシスとアポトーシスは、細胞が死ぬ2つの異なる様式です。アポトーシスは多細胞生物で起こる能動的なプログラム細胞死過程です。一方オンコーシスは、カスパーゼ非依存性細胞死で、腫脹、透過性増加、膜破裂を特徴とし、壊死と呼ばれることも多いです。この細胞死形式は偶発的かつ非制御的と考えられています。本研究により、Atsが腫瘍細胞増殖を抑制し、抑制率がAts用量依存的であることが判明しました。Atsは主にオンコーシス度合いに依存して細胞死を導き、オンコーシスの形でカスパーゼ非依存性細胞死も活性化します。対照的に、腫瘍細胞をAts-BSA NPsで処理すると、明確なオンコーシス様死とは別に、Ats-BSA NPsが細胞質へ取り込まれ、速やかにミトコンドリア内に局在し、NPs媒介でAtsを放出します。ミトコンドリア内のAtsがROSを生成しERストレスを誘発、さらにミトコンドリア膜電位低下、シトクロムC放出、Bax、切断カスパーゼ-3、カスパーゼ-9タンパク質発現促進により、ミトコンドリア媒介カスパーゼ依存性アポトーシス経路を活性化します。総合すると、Ats-BSA NPsはAtsのミトコンドリア送達を増加させ、オンコーシスとアポトーシス程度を増強して細胞死を誘導し、薬物の細胞毒性を高め、有意な細胞死を誘発します。

結論

簡潔に述べると、腫瘍細胞内の遊離Atsはオンコーシス度合いに強く依存し、オンコーシス様死の形で腫瘍細胞増殖を抑制するため、薬物の細胞毒性は限定的で望ましくないものでした。対照的に、Ats-BSA NPsはミトコンドリアアポトーシス経路を活性化し、同時にオンコーシス効果も誘発し、相乗的にAtsの抗腫瘍効力を増強しました。本研究の結果は、Ats-BSA NPsがAtsの細胞毒性とアポトーシス効果を増強する意義を明確にし、Atsによる細胞死経路を多様化するBSA NPsの役割をさらに意義づけました。遊離Atsと比較し、Ats-BSA NPsは腫瘍細胞により高い細胞毒性と有意な細胞アポトーシス効果を誘導します。