リトコール酸修飾金ナノ粒子が肝臓がん細胞に選択的アポトーシスを誘導

概要

金ナノ粒子（AuNPs）は、生体適合性、光学特性、薬物送達の可能性で知られています。本研究では、ポリエチレングリコール（PEG）スペーサーとリトコール酸（LCA）リガンドをカルボキシル結合により導入し、AuNP@MPA‑PEG‑LCAを作製しました。細胞毒性試験の結果、AuNP@MPA‑PEG‑LCAは顕著な選択性を示し、複数の肝細胞がん細胞株（HepG2、SMMC‑7721）の増殖を著しく抑制する一方、正常肝細胞（QSG‑7701）と乳がん細胞（MCF‑7）にはほとんど影響を与えませんでした。アポトーシス誘導は、核凝縮（Hoechst 33342）、アネキシンV‑FITC結合、ミトコンドリア膜電位（MMP）低下（JC‑1）、アクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド（AO/EB）染色により確認されました。ナノ粒子は活性酸素種（ROS）の蓄積を引き起こし、ミトコンドリア機能不全とプログラム細胞死を導くことが明らかになりました。これらの知見は、AuNP@MPA‑PEG‑LCAが肝臓がんに対する有望な標的ナノ治療薬であることを示しています。

背景

金ナノ粒子は、独自の光学共鳴、化学的安定性、広大な表面積を備え、薬物送達、イメージング、光熱療法などの医療応用に魅力的です^[1–5]。球状の形状は効率的な細胞取り込みを促進し、オフターゲット効果を最小限に抑えます^[6–8]。標的リガンドやポリマーでAuNPsを機能化することで、特に腫瘍学において治療指数がさらに向上します^[9–14]。

二次胆汁酸であるリトコール酸（LCA）は、アポトーシスを介して肝臓がんに強力な抗腫瘍活性を示すことが報告されています^[29–30]。天然分子として、LCAはAuNPsを肝組織へ誘導するリガンドとして機能し、溶解性を改善し、細胞内シグナル伝達経路を調節する可能性があります^[20–28]。

AuNPsの生体適合性とLCAの腫瘍抑制特性を組み合わせることで、ROS媒介性ミトコンドリア経路を利用して肝細胞がん細胞にアポトーシスを誘導する選択的抗がん剤の創出が期待されます。

方法

材料

特に記載のない限り、すべての試薬はSigma‑Aldrichから購入しました。細胞培養試薬（RPMI‑1640、FBS）はInvitrogen製です。ヒト肝細胞がん細胞株（HepG2、SMMC‑7721）、正常肝細胞（QSG‑7701）、乳がん細胞（MCF‑7）は上海生命科学研究院から入手しました。

AuNP@MPAの合成

クエン酸修飾AuNPs（平均直径4.0±0.5 nm）をTurkevich法^[38]によりHAuCl₄とNaBH₄を用いて合成しました。得られたナノ粒子をpH 11で3‑メルカプトプロピオン酸（MPA）で修飾し、さらなる共役化のためのカルボキシル基を導入しました。

PEGとの共役化

AuNP@MPA（0.0875 mmol）をNHS（0.0875 mmol）とEDC（0.035 mmol）で50 mM MES緩衝液中で活性化し、NH₂‑PEG₁₀₀₀‑NH₂（0.045 mmol）を添加しました。25 ℃で24時間反応後、遠心分離によりPEG化ナノ粒子（AuNP@MPA‑PEG）を分離しました。

リトコール酸の導入

AuNP@MPA‑PEGを無水DMF中でLCA（0.045 mmol）と混合し、25 ℃で24時間撹拌しました。最終生成物であるAuNP@MPA‑PEG‑LCAを繰り返し遠心分離により精製しました。

透過型電子顕微鏡（TEM）観察

粒子の形態とサイズをJEOL JEM‑200CX TEM（200 kV）で観察しました。ナノ粒子懸濁液を300メッシュ銅グリッドに滴下乾燥させました。

細胞毒性試験

AuNPs（0.2–1.0 mg mL⁻¹）に48時間曝露後の細胞生存率をMTT法で測定しました。吸光度をTecan Infinite M200プレートリーダーで570 nmにて測定しました。

アポトーシス形態（Hoechst 33342）

HepG2細胞を0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCAで24時間および48時間処理し、10 µg mL⁻¹ Hoechst 33342で30分間染色しました。核形態をLeica‑SP8共焦点顕微鏡で撮影しました。

初期アポトーシス（Annexin V‑FITC）

0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCAで6時間処理後、HepG2細胞をアネキシンV‑FITCで染色し、フローサイトメトリー（FACSCalibur、BD）で解析しました。共焦点画像も取得しました。

ミトコンドリア膜電位（MMP）

JC‑1染料（10 µg mL⁻¹）を用いて、AuNP@MPA‑PEG‑LCA処理（6時間）後のHepG2細胞のMMP変化を評価しました。フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡の両方を用いました。

活性酸素種（ROS）

H₂DCF‑DA（10 µM）を用いて、0.5 mg mL⁻¹ AuNP@MPA‑PEG‑LCAに6時間曝露後の細胞内ROSを定量しました。蛍光をフローサイトメトリーと共焦点顕微鏡で測定しました。

結果と考察

ナノ粒子のキャラクタリゼーション

AuNP@MPA‑PEG‑LCAは球状を維持し、平均直径16.0±1.2 nmでした（TEM、図1c）。PEGとLCAの層により、コアAuNP@MPA（4.0 nm）と比較して流動動力学的サイズが増大しました。これらの寸法は、腫瘍組織におけるEPR効果（増強透過性・保持効果）に適しています。

図1. （a）AuNP@MPA‑PEG‑LCA合成の模式図、（b）AuNP@MPA、（c）AuNP@MPA‑PEG、（d）AuNP@MPA‑PEG‑LCAのTEM画像

選択的細胞毒性

MTTアッセイ（図2）では、AuNP@MPAは全細胞株でほぼ細胞毒性を示しませんでした。対照的に、AuNP@MPA‑PEG‑LCAは用量依存的にHepG2およびSMMC‑7721細胞の生存率を低下させ、IC₅₀値は0.6 mg mL⁻¹未満でした。一方、QSG‑7701とMCF‑7細胞には最小限の影響しかありませんでした。この選択的プロファイルは、LCAが付与する標的能力を裏付けています。

図2. AuNP@MPAおよびAuNP@MPA‑PEG‑LCAをHepG2、SMMC‑7721、QSG‑7701、MCF‑7細胞と48時間共培養した際の細胞生存率

アポトーシス形態

Hoechst染色（図3）により、AuNP@MPA‑PEG‑LCA処理したHepG2細胞で、48時間にわたり核凝縮、断片化、クロマチン周辺化が進行的に観察され、後期アポトーシスを示唆しました。対照群およびAuNP@MPA処理群では均一な核形態が維持されました。

図3. Hoechst 33342染色によるHepG2細胞核の形態的特徴。（a）0時間、（b）24時間、（c）48時間のAuNP@MPA‑PEG‑LCA（0.5 mg mL⁻¹）処理、（d）AuNP@MPA（0.5 mg mL⁻¹）48時間処理。アポトーシス細胞は凝縮・断片化した核と細胞体積の縮小を示す；スケールバー20 µm

Annexin V‑FITCによる確認

Annexin V染色（図4）により、AuNP@MPA‑PEG‑LCA処理細胞でホスファチジルセリンの細胞膜外葉への明確な転位が確認されました。フローサイトメトリーでは、アポトーシス率が対照の8.16%に対し38.45%と定量され、初期アポトーシス誘導が確認されました。

図4. AuNP@MPA‑PEG‑LCA（0.5 mg mL⁻¹）処理HepG2細胞の（a）共焦点画像と（b）フローサイトメトリーデータ。アネキシンV‑FITCで染色（励起488 nm、放射500–560 nm）；スケールバー20 µm

ミトコンドリア脱分極

JC‑1解析（図5）では、処理細胞で赤色凝集体蛍光の消失と緑色モノマー信号の増加が観察され、MMPの崩壊を示しました。フローサイトメトリーでも赤/緑比の有意な低下が確認され、ミトコンドリア機能不全がアポトーシスの下流イベントであることを裏付けました。

図5. （a）JC‑1標識細胞の共焦点蛍光画像と（b）AuNP@MPA‑PEG‑LCAのMMPへの影響のフローサイトメトリー解析

ROS生成

H₂DCF‑DA染色（図6）により、AuNP@MPA‑PEG‑LCA処理HepG2細胞で緑色蛍光の顕著な増加が見られ、ROS産生の亢進を反映しました。フローサイトメトリー定量でも同様の傾向が確認され、酸化ストレスがミトコンドリア脱分極とアポトーシスに先行することが示唆されました。

図6. AuNP@MPA‑PEG‑LCAで6時間処理したHepG2細胞のROS産生解析。（a）共焦点顕微鏡（励起488 nm、放射530 nm）と（b）フローサイトメトリー（励起488 nm、放射525 nm）

結論

約16 nmのAuNP@MPA‑PEG‑LCAナノ粒子を作製し、肝細胞がん細胞の増殖を選択的に抑制しアポトーシスを誘導することを実証しました。核形態、アネキシンV結合、JC‑1によるMMP低下、ROS上昇などの包括的アッセイにより、治療作用がROS誘導性ミトコンドリア機能不全を介して媒介されることが確認されました。これらの結果は、AuNP@MPA‑PEG‑LCAが肝臓がん治療のための有望な標的ナノ医薬品であることを示しています。

略語

AuNPs:

金ナノ粒子

DMF:

ジメチルホルムアミド

EDC:

1-(3‑ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩

FBS:

胎児牛血清

H₂DCF‑DA:

2′,7′‑ジクロロフルオレセインジ酢酸エステル

HepG2:

ヒト肝細胞がん細胞

JC‑1:

5,5′,6,6′‑テトラクロロ‑1,1′,3,3′‑テトラエチルベンズイミダゾールカルボシアニンヨウ化物

LCA:

リトコール酸

MCF‑7:

ヒト乳がん細胞

MES:

4‑モルホリンエタンスルホン酸

MMP:

ミトコンドリア膜電位

MPA:

3‑メルカプトプロピオン酸

MTT:

3-(4,5‑ジメチル‑2‑チアゾリル)-2,5‑ジフェニルテトラゾリウムブロマイド

NHS:

N‑ヒドロキシスクシンイミド

PEG:

ポリエチレングリコール

PS:

ホスファチジルセリン

QSG‑7701:

ヒト正常肝細胞

ROS:

活性酸素種

SMMC‑7721:

ヒト肝細胞がん細胞

TEM:

透過型電子顕微鏡