パーキンソン病治療における幹細胞追跡のための超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子

要旨

パーキンソン病（PD）は中脳ドパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とし、幹細胞移植法が治療の有望な戦略を提供する。これらの研究において、移植細胞の生物学的振る舞いをin vivoで追跡することは、幹細胞機能の基本的理解と臨床効果の評価に不可欠である。本研究では、熱分解法と二段階修飾により、ポリアクリル酸（PAA）とメトキシポリエチレングリコールアミン（PEG）でコーティングした新規超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子（USPIO-PAA/PEG NPs）を開発した。USPIO-PAA/PEG NPsは均一な直径10.07±0.55 nmと、TEMとFTIRによって示されるリガンドの適切な吸収ピークを持つ。MTTアッセイでは、USPIO-PAA/PEG NPsとインキュベートした細胞の生存率が96%以上を維持した。合成されたUSPIO-PAA/PEGは84.65 s⁻¹ Mm⁻¹の良好な緩和率を示し、MRIによる効率的な取り込みと追跡が可能であることを示唆した。さらに、ヒト脂肪由来幹細胞（HADSCs）を特性評価し、USPIO-PAA/PEGで標識して、6-ヒドロキシドパミン（6-OHDA）誘発PDラットモデルの線条体に移植した。標識細胞は移植手術後3週間までMRIで追跡可能であり、標識HADSCs移植はPDモデルでのアポモルフィン誘発回転を有意に減衰させ、substantia nigraのドパミン作動性ニューロン数を増加させた。全体として、USPIO-PAA/PEG NPsの開発は、細胞治療のin vivo追跡技術とPDにおける治療可能性を持つ幹細胞追跡の新戦略を提供する有望なツールとなる。

はじめに

パーキンソン病は、中脳ドパミン作動性ニューロンの進行性喪失を特徴とする神経変性疾患である。比較的局所的な障害であるため、細胞ベース療法の良い候補となる。胎児中脳組織[1]から、胚性幹細胞（ESC）や人工多能性幹細胞（iPSC）由来の誘導ニューロン[2]まで、いくつかの細胞タイプがPD治療に関与してきたが、応用中に倫理的懸念と腫瘍形成リスクを回避できない[3]。間葉系幹細胞（MSC）は、過去10年間でPDを含む神経変性疾患の有望な治療ツールとして報告されている多能性幹細胞集団である[4,5]。他の細胞タイプと比較して、MSCは良好な増殖能、人体全体での広範な入手可能性、免疫抑制能を示す。いくつかの研究で、MSCの頭蓋内移植が神経保護、ニューロン分化、免疫調節を促進することが示されている[6-8]。これらの研究において、移植細胞の生存、移動、統合をin vivoで追跡することは、幹細胞機能の基本的理解と臨床効果の評価に不可欠である。

移植細胞の治療効果をより良く分析するため、様々なトレーサーが開発されてきた。トレーサーの安全性と有効性は応用に影響を与える最も重要な要因である。蛍光タンパク質による標識[9]と比較して、超常磁性酸化鉄（SPIO）粒子による追跡は、移植細胞に遺伝的改変をもたらさない[10-12]。いくつかの研究で、SPIOを効果的な造影剤として移植細胞の可視化と追跡に用いている[6,13,14]。しかし、市販の一部のSPIOがMSCの正常機能に影響を与えることが報告されている[15-17]ため、新規SPIOの開発に多大な努力が払われてきた。本研究では、ポリアクリル酸（PAA）でコーティングし、さらにメトキシポリエチレングリコールアミン（PEG）層で修飾した超小型SPIOナノ粒子（USPIO）を合成した。新規USPIO-PAA/PEGは、in vitroおよびin vivoで良好な細胞内取り込みと長期MRI追跡能力を示した。さらに、USPIO-PAA/PEGで標識したヒト脂肪組織由来MSC（HADSCs）は生物学的特性を維持し、PD動物モデルでの行動障害を改善し、substantia nigraでのTH免疫反応性を増加させた。

材料と方法

材料

アセチルアセトン酸鉄、TREG（トリエチレングリコール）、ジエチレングリコール、PEGはアラジン工業株式会社（上海、中国）から購入。メチルチアゾリルジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）はシグマアルドリッチ株式会社（上海、中国）から購入。Dulbecco変法Eagle培地（DMEM）、トリプシン-EDTA（0.25%）、胎児牛血清（FBS）はサーモフィッシャーサイエンティフィックから購入。1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩とN-ヒドロキシスクシンイミドはシグマアルドリッチ（中国）から購入。N,N-ジメチルホルムアミド、無水エタノール、酢酸エチルはシノファーム化学試薬株式会社から購入。超純水はミリポア超純水精製システムで製造。抗ヒトCD90-FITC、抗ヒトCD45-PE、抗ヒトCD34-FITC、抗ヒトCD105-PEはバイオレジェンドから購入。

USPIOの合成

USPIOは、先行研究[18-21]と同様にポリオール法で合成した。実験手順は以下の通り：アセチルアセトン酸鉄1 mmolとTREG 25 mLを、アルゴン、球形冷却管、温度計に接続した三口フラスクに混合した。アルゴン流で15分間インキュベートした後、混合物を120℃（昇温速度3 ℃/分）まで加熱し1時間維持、さらに同じ昇温速度で250℃まで加熱し30分間維持した。反応混合物を室温まで自然冷却し、無水エタノール2 mLで希釈、酢酸エチルで沈殿させた。沈殿物を8000 rpmで20分間遠心分離して回収し、無水エタノールに再分散させた。USPIOを無水エタノール中に4℃で保存し、さらなる使用に備えた。

PAA/PEGコートUSPIOの調製

USPIO-PAAは先行報告[22]に従って取得した。詳細には、ポリアクリル酸（PAA）1.5 gをジエチレングリコール24 mLに溶解した。5分間のアルゴン流後、混合物を110℃まで加熱し、溶液が透明になるまで維持した。前工程で調製したエタノール分散液（USPIO 28 mg含む）を超音波分散後、上記透明溶液に加えた。溶液を昇温速度3 ℃/分で210℃まで加熱し、2時間リフラックス後、反応を停止して室温まで自然冷却した。冷却後、酢酸エチルを反応液に加えてUSPIO NPsを沈殿させ、8000 rpmで20分間遠心分離して上清を除去した。沈殿物をエタノールに分散させ、酢酸エチルで再沈殿させた。洗浄手順を3回繰り返した後、USPIO-PAAを超純水に分散させさらなる使用に備えた。生体適合性を向上させるため、EDCとNHSによるアミド化反応[23]でPEGをナノ粒子表面にさらに結合させた。PEG 0.45 gを5 mL超純水に溶解し、EDC 20 mgとNHS 12 mgを添加したUSPIO-PAA分散液15 mL（Fe 35 mg含む）に加えた。混合物を室温で2時間機械攪拌し、その後DMF溶媒10 mLを加え、回転蒸発装置で40℃で水を除去した。さらにDEC 40 mgとNHS 24 mgを混合物に加え、室温で48時間攪拌した。反応液を透析袋に移し、超純水中で72時間透析し、その間12時間ごとに超純水を交換した。混合物をさらに超濾過チューブに移し、4000 rpmで10分間遠心分離して分子量30 kD以上の分子を回収した。最終生成物を超純水に溶解し、4℃で保存した。場合によっては、水に溶解したSPIO-PAA/PEGを超濾過遠心チューブ（>30 kD孔径、ミリポア）で遠心分離し、ペレットを真空乾燥機で乾燥させてさらなる実験に用いた。

NPsの特性評価

試料の粒子サイズ、サイズ分布、形態はTEMで分析した。コーティング層はネガティブ染色で測定した。超音波分散後、水溶液中のUSPIO-PAAとUSPIO-PAA/PEGを300メッシュカーボン支持膜の銅ネットに滴下、自然乾燥させ、透過電子顕微鏡（Tecnai G2F20 s-twin、FEI）で観察した。

赤外分光分析はアジレントテクノロジーズCary 600シリーズFTIR分光計で行い、乾燥試料粉末を直接サンプルタンクに入れて検出した。

USPIO-PAA/PEG分散液中のFe含有量は、モデルPerkinElmer Analyst 700の炎原子吸光分光法（FAAS）で測定した。まず、1、2、3、4、5 μg/mL鉄標準液を調製して標準曲線を作成し、USPIO-PAAまたはUSPIO-PAA/PEG分散液100 μLを硝酸で溶解し、50 mLメスフラスクで鉄含有量を測定した。

ナノ粒子の磁気共鳴画像は、蘇州大学第1附属病院画像診断科の3 T臨床スキャナーで実施した。ナノ粒子を対応濃度で1%アガロースゲル溶液に分散させ、固化後、マルチエコーシーケンスで横緩和時間を測定した。MRI取得データをDICOM形式でエクスポートし、RadiAnt DICOM Viewerで開いてグレー値を読み取り、異なるエコータイムのグレー値をOriginにインポートしてフィッティングし、異なる濃度のUSPIO分散液の横緩和時間値を取得した。最終的に、横緩和率1/T2と試料のFe濃度の線形フィッティングにより、USPIO-PAAとUSPIO-PAA/PEG試料の横緩和率r2を取得した。USPIO-PAAとUSPIO-PAA/PEGの磁気ヒステリシスループは、先行研究[24]で記述された方法に従い、Quantum Design DynaCool-9装置（蘇州科技大学）で取得した。

HADSCsの分離と同定

すべての研究は、「ヒト胚性幹細胞研究に関する倫理指針」（文部科学省と厚生労働省、2003年）とヘルシンキ宣言に従って行われた。脂肪組織は、蘇州大学第1附属病院からインフォームドコンセントと倫理承認を得て入手した。脂肪組織を解剖顕微鏡下で血管と結合組織を除去した後、洗浄し小片に切断した。ブロックをI型コラゲナーゼ（0.3 pzu/mL）で37℃、30分間消化し、500 gで10分間遠心分離した。細胞ペレットをDMEM+10% FBSで懸濁し、8×10⁴/cm²の密度で播種した。48時間後、浮遊細胞を含む古い培地を廃棄し、新しい培地で置換した。

HADSCsを、間葉系（CD90、CD105）および造血系（CD34、CD45）幹細胞を特異的に標識する表面マーカーでフローサイトメトリーにより特性評価した。総計1×10⁵細胞を回収し、CD34、CD45、CD90、CD105マウス抗ヒトモノクローナル抗体と適切なアイソタイプコントロールに対して、PE、FITC、APC/Cy7、PerCP共役抗体でインキュベートした。染色細胞をフローサイトメーター（LSRFortessa、BD、USA）で分析し、FlowJoソフトウェアでデータ解析した。CD90+、CD105+、CD34-、CD45-の4表現型をHADSCsの表面マーカーとして選択した。細胞表面マーカー発現レベルはフローサイトメトリー（BD LSRFortessa）で同定した。

HADSCsの脂肪分化と骨分化は、オイルレッドO染色とアリザリンレッド染色でそれぞれ評価した。HADSCsをMesenCultTM脂肪分化培地（Stem cell Tech.、05412）またはOriCellTM骨分化キット（Cyagen、HUXMA-90021）で培養した。脂肪分化は14日目にオイルレッドO染色で脂滴充満成熟脂肪細胞を定性評価し（VivaCell Biosciences、C37A00150）、骨分化は21日目にアリザリンレッド染色で成熟骨細胞の石灰化結節を評価した（VivaCell Biosciences、C37C00150）。像は倒立Nexcope顕微鏡で取得した。

USPIO-PAA/PEGのin vitro細胞取り込みと生体適合性評価

HADSCsを1×10⁶/wellの密度で6ウェルプレートに播種した。細胞をUSPIO-PAA/PEG（Fe 10 μg/mLおよび0.1 μg/mL）含有培地で2時間インキュベートし、プロイセンブルー（PB）染色で細胞内Feを同定した。

USPIO-PAA/PEGの生体適合性は、MTT比色法と5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）取り込みアッセイ（EdU増殖キット、サーモ）で決定した。MTTでは、HADSCsを5×10³/wellの密度で96ウェルプレートに播種し、異なる濃度（0、10、20、40、80、160 Fe μg/mL）のUSPIO-PAA/PEGで24、48、72時間インキュベートした。各ウェルにMTT溶液（5 mg/mL）20 μLを加え4時間反応させ、ジメチルスルホキシド150 μLで結晶を溶解した。酵素標識装置（BioTek Synergy HT）でOD 570 nmの吸光度を測定した。EdUアッセイでは、HADSCsを160 Fe μg/mLのSPIO-PAA/PEGで72時間インキュベートし、さらに10 μM EdUで24時間インキュベートした。細胞を回収し、4%パラホルムアルデヒドで固定、2 mg/mLグリシンで中和した。透過処理後、染色液（アジド647複合体）でインキュベートし、EdU取り込み率をフローサイトメトリーで評価した。

6-OHDA誘発PDモデル

15-20匹の雄性Wistarラット（SPFグレード、体重220±20 g）を用い、PD動物でのUSPIO-PAA/PEG標識HADSCsのin vivo追跡を行った。すべての手順は中国の規定（実験動物に関する管理規定、2017年）に従い、中国科学院実験動物ケアおよび使用委員会の承認を得て実施した。動物は制御照明（12/12時間明暗サイクル、午前7時点灯）下で飼育し、餌と水を自由摂取させた。PDモデルは、ラットの片側線条体への6-ヒドロキシドパミン（6-OHDA、シグマ、セントルイス、米国）2点注入で作製した。先行研究[25,26]に従い、ラットをステレオタキシックに、2座標（AP: 1.2 mm、ML: 2.2 mm、DV: -4.0〜-6.0 mm；AP: -1.0 mm、ML: 4.4 mm、DV: -4.5〜-6.5 mm）へそれぞれ3 μLの6-OHDA溶液（5 μg/μL）注入した。アポモルフィン誘発回転（0.5 mg/kg、皮下投与）テストでPDモデルの妥当性を検証した。6-OHDA処理後1、2、3週目にアポモルフィン（0.5 mg/kg）を皮下投与し、オープンフィールドで30分間回転スコアを評価した。アポモルフィン誘発回転が分あたり7回転以上のPDモデルを成功とみなした。

細胞移植とin vivo MRIイメージング

HADSCsが80%コンフルエントに達したとき、USPIO-PAA/PEG（鉄濃度10 μg/mL）で2時間インキュベートした。PDモデル作製3週間後、USPIO-PAA/PEG標識HADSCs 3×10⁶個または生理食塩水を、PDラットモデルの左線条体へ以下座標（AP: 1.2 mm、ML: 2.2 mm、DV: -4.0〜-6.0 mm）で注入した。移植を受けた動物には、手術直後にブプレノルフィン（0.5 mg/kg）を投与し、その後2日間継続した。これらの動物を、移植手術後1、2、3週目にアポモルフィン誘発回転テストに供した。

in vivo MRIでは、動物をin vivoイメージングシステム（IVIS）小動物イメージングシステム（PerkinElmer、Waltham、MA、USA）で、生理食塩水またはHADSCs注入後3、9、15、21日目に撮像した。

組織学的解析

残りのラットモデルの脳を摘出し、30 μm厚に切片化して、幹細胞移植後3週間で解析した（n=5/group）。切片を抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH、abcam、英国）でインキュベートし、アレクサ594共役ドンキー抗ウサギ抗体（Abcam）で可視化した。DAPIで核を対比染色した。像はライカTCS SP5共焦点顕微鏡で取得した。

統計解析

数値データは平均±SDで表した。データをGraphPad Prism 7.0（GraphPad Software Inc.、San Diego、CA、USA）で双側Studentのt検定または一元配置分散分析にかけ、差を評価した。*はp<0.05、NSは有意差なしを示す。

結果

ナノ粒子の合成と特性評価

実験デザインを図1に示す。疎水性USPIO NPsは熱分解法で調製した。図2a-cに示すように、元のUSPIO NPsの直径は4.07±0.57 nm；PAAコーティングによりUSPIO-PAA NPsの直径は6.34±0.54 nmに増加；さらにPEGで修飾するとUSPIO-PAA/PEG NPsの直径は10.07±0.55 nmに達した。すべてのナノ粒子は球形で均一に分散していた。統計解析により、USPIO、USPIO-PAA、USPIO-PAA/PEG NPsの直径間に有意差（F=10、**p<0.01、##p<0.01）が認められ、PAAとPEGによる成功した修飾を示した（図2d）。

実験デザインの概略図

ナノ粒子の特性評価。a-c USPIO NPs（a）、USPIO-PAA NPs（b）、USPIO-PAA/PEG NPs（c）の代表的TEM像。d USPIO、USPIO-PAA、USPIO-PAA/PEG NPsの粒子サイズの統計解析（n=20/group）。e USPIO、USPIO-PAA、USPIO-PAA/PEG NPsのフーリエ変換赤外スペクトル。矢印はPAA修飾による1728 cm⁻¹のカルボニル吸収ピーク、PEG修飾による1595 cm⁻¹と3440 cm⁻¹のピークを示す。数値データは平均±SD、**p<0.01 vs USPIO NPs、##p<0.01 vs USPIO-PAA/PEG NPs。バーは20 nm

赤外吸収法により、USPIO-PAAはPAA分子のカルボニル伸縮振動ピークに由来する1728 cm⁻¹の明確なカルボニル吸収ピークを持つことがわかった；USPIO-PAA/PEGは、1595 cm⁻¹の炭素-窒素結合面内曲げ振動ピークと3440 cm⁻¹の水酸基伸縮振動ピークを持つ（図2e）。これらすべてのデータが、PAAまたはPEG分子がNPs表面に成功裏に修飾されたことをさらに確認した。

USPIO-PAA/PEGはHADSCとの良好なin vitro磁気応答と生体適合性を示す

USPIO-PAAとUSPIO-PAA/PEGのin vitroイメージング能力を、異なる濃度（Fe濃度相当）でのMRI画像グレースケール値で評価した。フィッティング後、異なる濃度での分散液の横緩和時間値を取得した。横緩和率1/T2を縦座標、Fe濃度を横座標として、USPIO-PAAの横緩和率は107.94 s⁻¹ mM⁻¹（図3a）、USPIO-PAA/PEGは84.65 s⁻¹ mM⁻¹（図3b）と計算された。両粒子とも良好なMRIイメージング特性を示した。SPIO-PAAとSPIO-PAA/PEGの磁気ヒステリシスループでは、SPIO-PAAの飽和磁化値は10,000 Oe以上で57 emu/g（図3c）、SPIO-PAA/PEGは40 emu/g（図3d）であった。矯顽力と残留磁化はゼロに近く（図3c, d）、両者とも超常磁性であることをさらに示した。

合成USPIO-PAAおよびUSPIO-PAA/PEG NPsのin vitro磁気応答。a, b USPIO-PAA NPs（a）とUSPIO-PAA/PEG NPs（b）のMRIと横緩和率。r₂は緩和率を表す。USPIO-PAAとUSPIO-PAA/PEG NPsの緩和率はそれぞれ107.94 s⁻¹ mM⁻¹と84.65 s⁻¹ mM⁻¹。c, d USPIO-PAA NPs（c）とUSPIO-PAA/PEG NPs（d）の磁気ヒステリシスループ。磁気ヒステリシスは295 K（21.85℃）で最大磁界強度50,000 Oe（5 Tesla）で測定。飽和磁化値はSPIO-PAAで57 emu/g、SPIO-PAA/PEGで40 emu/gに近い。両曲線の磁化ヒステリシスはゼロに近い

USPIO-PAA/PEG NPsをHADSCsと異なる時間インキュベートすることで、USPIO-PAA/PEG NPsが細胞生存に有意な影響を与えないことがわかった（p>0.05）。HADSCsの細胞生存率は、Fe濃度換算で0〜160 μg/mLの範囲で96%以上を維持した。さらに、インキュベーション時間の増加（24〜72時間）は、各Fe濃度で有意な細胞損失を誘発しなかった（図4a）。USPIO-PAA/PEG NPsをiPSCsと異なる濃度でインキュベートした場合も同様の観察が得られた（図4b）。HADSCsを160 μg Fe/mL USPIO-PAA/PEGで72時間処理しても、EdU取り込み率で示される増殖能はUSPIO-PAA/PEGの存在によって損なわれなかった（図4c）。これらすべてのデータが、合成USPIO-PAA/PEG NPsの生物学的安全性を示している。

合成USPIO-PAA/PEG NPsは良好な生体適合性と標識能力を示す。a, b HADSCsまたはiPSCsを、USPIO-PAA/PEG NPsで様々な濃度（Fe濃度換算で0、10、20、40、80、160 μg Fe/mL）で24、48、72時間インキュベートし、MTT法で細胞生存率を測定し、それぞれa, bに示す。NPs濃度（n=5）またはインキュベーション時間（n=5）による生存率に有意差なし。c フローサイトメトリー解析により、USPIO-PAA/PEG（160 μg Fe/mL、72時間）の有無でHADSCsのEdU取り込み率が類似していた。EdU非処理HADSCsを陰性対照とした。d USPIO-PAA/PEG 10 μg Fe/mL、インキュベーション時間2時間で、プロイセンブルー染色評価によりHADSCsのほぼ100%標識効率が得られた。なお、USPIO-PAA/PEG 0.1 μg Fe/mL（2時間インキュベーション）でも、HADSCsにかなり均一で分散したPB染色が観察された。数値データは平均±SD。バーは20 μm

細胞がUSPIO-PAA/PEG NPsで効果的に標識できるかどうかを同定するため、HADSCsをUSPIO-PAA/PEG NPs（Fe 10 μg/mLまたは0.1 μg/mL相当）で2時間インキュベートした。図4dに示すように、USPIO-PAA/PEG（Fe 10 μg/mL）存在下で、ほぼ100%のHADSCsに多数の青色染色NPsが観察された。USPIO-PAA/PEG投与量を0.1 μg Fe/mLに減らしても、ほぼすべてのHADSCsにかなり均一で分散したPB染色が観察された。他の報告されているSPIO[14,27,28]と比較して、USPIO-PAA/PEGは高い細胞取り込み効率を示した。

PDラットモデルにおけるUSPIO-PAA/PEG NPs標識HADSCsの長期追跡

USPIO-PAA/PEG NPsで標識したHADSCsを、ステレオタキシック注入でPDラットモデルの左線条体に移植した。図5に示すように、HADSC移植後3日目に左線条体で明確なMRI信号を観察し、移植細胞の適切なin vivo追跡を示した。移植後D3、D9、D15、D21での動的観察では、NP標識された移植細胞が3週間まで明確に追跡可能であり、MRI信号はプロセス中に明確な減少を示さなかった。これらの結果は、合成ナノ粒子が移植細胞のin vivo追跡に良い可能性を持つことを示している。

USPIO-PAA/PEG標識HADSCsまたは生理食塩水移植後3日、9日、15日、21日の脳代表MRI像。対応する対照、すなわち正常ラットまたは生理食塩水注入PDラットモデルのMRI像を1行目と2行目に示す。対照のネガティブ信号と比較して、USPIO-PAA/PEG標識HADSCs移植ラット脳は21日目まで持続的かつ明確なMRI信号を示した。バーは5 mm

USPIO-PAA/PEG NPs標識HADSCsはPDモデルで治療効果を示す

NPs標識HADSCsが治療効果を示すか評価するため、まず分離HADSCsの表現型特性評価を行った。図6aに示すように、培養HADSCsは紡錘形細胞であった。フローサイトメトリー解析では、HADSCsが間葉系マーカーであるCD90（>99%）とCD105（>99%）を高発現し、造血マーカーであるCD34とCD45をほとんど発現しなかった（図6b-g）。HADSCsは特定条件下で脂肪分化または骨分化方向へ分化可能であり、分化能はオイルレッドO染色またはアリザリンレッド染色で示された（図6h）。分化HADSCsに脂滴や石灰化結節が認められたが、対照HEK293細胞にはそのような構造はなかった（図6h）。これらすべてがHADSCsが間葉系細胞の基準を満たすことを示している。

HADSCsの特性評価。a 位相差顕微鏡下の代表像、HADSCsの典型的な紡錘形表現型を示す。b-g HADSCsをCD45、CD105、CD34、CD90マーカーに対する異なる色素共役抗体でインキュベートし、フローサイトメトリー解析にかけた。散布図をb, c、ヒストグラムをd-gに示す。大部分の細胞が発現するCD90とCD105、発現しないCD34とCD45に注目。h HADSCsとHEK293細胞の脂肪分化と骨分化をオイルレッドO染色とアリザリンレッド染色でそれぞれ評価。バーは20 μm

6-OHDA注入後1、2、3週目のアポモルフィン誘発回転はそれぞれ分あたり17.1±1.79、28.7±1.77、31.86±1.72回転であり、ラットPDモデルの成功的確立を確認した。図7に示すように、NPs標識HADSCsを損傷側線条体に移植後、1、2、3週目のPDラットモデル回転数は32.59±1.12、31.85±1.98、31.54±1.72に減少した。統計解析により、移植手術後2週目から生理食塩水投与群とHADSC投与群の間に有意差が認められた（2週目p<0.01、3週目p<0.01；各群n=5）、NPs標識HADSCsがPDモデルの行動障害を改善することを示した。

6-OHDAで障害された同側線条体に生理食塩水またはUSPIO-PAA/PEG標識HADSCsを投与したPDラットモデルで、分あたり回転数をスコアリングし比較。PDラットがHADSCsを受けた後、2、3週目で回転数が有意に減少（対応する生理食塩水投与PDラットと比較）。nsは非有意変化、**はp<0.01を示す。各群n=5

PDは、substantia nigraでのチロシンヒドロキシラーゼ（TH）発現ニューロンの喪失と、ドパミン作動性ネットワークでのドパミンレベル不足を特徴とする[1]。最も影響を受けるのは黒質線条体経路（線条体を含む）である。本研究では、USPIO-PAA/PEG標識HADSCsをPDラットモデルの線条体に移植し、そのような移植が行動障害を改善し、さらにsubstantia nigraでのドパミン作動性ニューロン喪失をある程度緩和することを発見した（図8）。移植がPDラットの行動障害を緩和する観察と合わせて、USPIO-PAA/PEG NPs標識HADSCsがPDラットモデルで治療効果を発揮することを結論付けた。

substantia nigraでのTH免疫染色。生理食塩水投与ラット（a, d, g）、生理食塩水投与PDラット（b, e, h）、USPIO-PAA/PEG NPs標識HADSCs投与PDラット（c, f, i）。点線枠内はsubstantia nigraコンパクト部（SNc）と腹側被蓋野（VTA）領域を示す。d, e, fの枠内画像を拡大し、g, h, iに示す。6-OHDA注入ラットでは、生理食塩水投与対照と比較してSNcとVTA領域のTH発現細胞が減少。HADSC移植後、PDラットのSNcでより多くのTH発現細胞が観察された。バーは100 μm

考察

細胞療法は神経変性疾患治療の有望な戦略であり、過去20年間で臨床前研究の最前線にある[29,30]。移植細胞の追跡は、基礎メカニズムの解明と臨床効果の評価に不可欠な部分であるが、困難であり、ある程度細胞療法の応用を妨げてきた[31,32]。コンピュータ断層撮影（CT）、近赤外蛍光イメージング（NIFI）、MRIが移植細胞のin vivo追跡で最も一般的に用いられる方法である[31,32]。CTの高放射線、NIFIの低感度と比較して、MRIは深部組織の良好なイメージング、高コントラスト、低電離放射線を示し、in vivo追跡の良い候補となる[33-36]。したがって、MRI用適切なトレーサーの開発は、細胞療法応用の促進に不可欠な部分となる。

SPIOはMRI可視化のためのシンプルで信頼性の高い標識戦略である。移植細胞の長期in vivo追跡を達成するには、SPIO粒子が均一で超小型サイズを持つことが要求される。なぜなら、大型粒子はトレーサーの不均一分布を引き起こし、正常な血液循環を妨げる可能性があるからである[33]。さらに、ナノ粒子の内在化効率と生体適合性は、トレーサーを評価するもう一つの重要な指標である。ナノ粒子は通常、液相エンドサイトーシス[37]、受容体媒介エンドサイトーシス[38]、食作用[39]で細胞内に取り込まれる。より良い細胞取り込みを達成するため、SPIO粒子は通常中間リガンドで修飾される[18,40,41]。

細胞追跡以外にも、SPIOは薬物送達[42]に応用されている。組織分布と薬物動態クリアランスは両応用の重要な指標である。NPs-PAAと比較して、NPs-PAA/PEGは血中保持時間が長く、尿中クリアランスが遅い[43]。PEGで高密度にコートされたNPsは、消化管[44]、呼吸器系[45,46]、脳腫瘍[42]など粘膜上皮表面ではるかに均一な分布を提供する。さらに、PEGコーティングはタンパク質付着とコロナ形成を減らし、これがNPsの均一分布を促進する可能性があるが、取り込み減少のコストを伴う[47]。潜在的な優れた診断・治療ツールとして、SPIO-PAA/PEGのMSCへの標識能力とPDなど脳疾患への更なる応用は十分に研究されておらず、本研究はこの疑問に答えるために設計された。本研究では、SPIOコアをPAAとPEGリガンドでそれぞれ修飾し、新規超小型USPIO-PAA/PEGナノ粒子を合成した。USPIO-PAA/PEG NPsは均一超小型直径（10.07±0.55 nm）、水溶液中での良好な分散性、様々な細胞タイプとの生体適合性、in vitroおよびin vivoでの良好な磁気応答効果を示した。重要なことに、脳移植後3週間まで標識HADSCsの信号がMRIで明確に検出可能であり、臨床応用への良い可能性を示している。

PDはsubstantia nigraでのドパミン作動性ニューロンの進行性喪失と、ドパミン作動性ネットワークでのドパミンレベル不足を特徴とする[1]。最も影響を受けるのは線条体を含む黒質線条体経路である。本研究では、USPIO-PAA/PEG標識HADSCsをPDラットモデルの線条体に移植し、そのような移植が行動障害を改善し、さらにsubstantia nigraでのドパミン作動性ニューロン喪失をある程度緩和することを発見した。同様に、Ardeshirらはラット脂肪組織由来MSC移植がPDモデルでのアポモルフィン誘発回転を減衰させると報告している[48]。胎児中脳組織[49]やドパミン作動性神経前駆細胞[50]移植とは異なり、HADSCsは主にパラクリン効果[51,52]を通じて治療効果を発揮し、障害組織の代替ではない。研究では、MSCが免疫調節、神経保護、ニューロン分化の促進因子として働き、これらの効果は本質的にMSCから分泌されるセクレトームによって媒介されることが示されている[6,7,51]。我々の結果はこれらの観察と一致し、さらに新規USPIO-PAA/PEGトレーサーがHADSCsの神経保護効果を妨げないことを示している。

結論

高い細胞取り込み効率、優れた生体適合性、長期MRI追跡能力を示す新規USPIO-PAA/PEGトレーサーを開発した。USPIO-PAA/PEGで標識したHADSCsは、細胞移植後3週間MRIで追跡可能であった。さらに、標識HADSCsはPDモデルの行動障害を有意に減衰させ、substantia nigraのドパミン作動性ニューロン数を増加させた。USPIO-PAA/PEGトレーサーの開発は、幹細胞研究と応用における有望なツールを提供する可能性がある。

データおよび資料の入手可能性

本記事の結論を支持するすべてのデータは記事内に含まれています。

略語

SPIO:

小型超常磁性酸化鉄

USPIO:

超小型超常磁性酸化鉄

PAA:

ポリアクリル酸

PEG:

メトキシポリエチレングリコールアミン

HADSCs:

ヒト脂肪由来幹細胞

USPIO-PAA/PEG:

ポリアクリル酸とメトキシポリエチレングリコールアミンでコーティングされた超小型超常磁性酸化鉄ナノ粒子

6-OHDA:

6-ヒドロキシドパミン

CT:

コンピュータ断層撮影

NIFI:

近赤外蛍光イメージング

MRI:

磁気共鳴画像

TH:

チロシンヒドロキシラーゼ

TEM:

透過電子顕微鏡