Invitroで糖化されたヘモグロビンA0サンプルからの低分子量AGEの金ナノ粒子ベースの検出

背景

II型糖尿病（T2DM）は、高血糖値の存在を特徴とする複雑な代謝障害です。体内で持続する高血糖は、一連の化学的および生化学的反応を開始し、高血糖の過程で発生する最も重要な反応は、糖とタンパク質の間の非酵素的反応を伴うメイラード反応として知られ、可逆アルジミン（シッフ塩基）を形成しますリンケージ。比較的不安定なシッフ塩基は、より安定したケト型になります。これは、「アマドリ製品」としても知られています[1]。糖化の中間生成物または初期糖化生成物とも呼ばれるアマドリ生成物は、グループの転位、環化、脱水、分解反応を経て、さまざまな化合物を形成します。これらの化合物は、タンパク質およびグリコシル化剤の潜在的な架橋剤であることが知られています[2]。それらはさらに分解されやすく、最終糖化産物（AGE）の形成につながります[3]。内因性濃度が高い場合、AGEは、タンパク質の架橋を誘導するか、受容体を介した細胞内シグナル伝達（RAGE）を介して、糖尿病の合併症に寄与し[4]、酸化ストレスと炎症を引き起こします[5、6]。また、心血管疾患[7、8]、腎症[9、10]、網膜症[11、12]、老化[13、14]、関節炎、癌[15、16、17]、神経変性疾患に関連していることも知られています。アルツハイマー病[15]やうつ病の発症[18]のように。メイラード反応に加えて、グルコースの酸化、脂質の過酸化、ポリオール経路を含む他のいくつかの経路も、invivoでAGEsの形成につながります[19、20]。それに加えて、AGEが豊富であることが知られている特定の食品の食事摂取も体内の総AGEに寄与します[6]。

ほとんどのAGE製品には共通の構造要素がありますが[21]、何百ものAGEの正確な化学構造はまだ特定されていません[22]。それらの不均一性にもかかわらず、タンパク質との共有結合架橋の形成および「褐変効果」は、すべての既知のAGEに典型的です[23]。糖化の初期段階で形成される糖とタンパク質が関与する付加物は、初期糖化付加物と呼ばれます。フルクトシルリジンとフルクトサミンはそのような構造の例であり、潜在的な架橋剤です[24、25、26]。広く研究されているAGEには、 N が含まれます。 -カルボキシメチルリジン（CML）、 N -カルボキシエチルリジン（CEL）[27]、ペントシジン[28]、グルコスパン[29]、ピラリン、アルギピラミジン、クロスライン、ベスペリジンC [30]。

糖尿病、老化および関連する合併症の進行におけるAGEsの役割に関する研究は増加しており、それぞれの研究の優れたバイオマーカーであると報告されています[https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224] [ 31,32,33,34]。ただし、AGEの構造の複雑さと不均一性は、ユニバーサル検出システムの開発における主要なハードルです[35]。 AGEsの定性分析は、一般に、初期のメイラード反応生成物[37]に対応する280 nmでの光吸収の増強を測定するか、測定することによってメイラード反応生成物の進化を監視する分光法および比色法[36]によって行われます。 450nmでの蛍光発光[38,39,40,41,42]。異なるAGE製品を特定するための研究はまだ進行中です。ただし、ペントシジン[43]およびカルボキシメチルリジン[44]の定量についてはいくつかの試みが行われました。ほとんどのAGEは、免疫組織化学および一連のポリおよびモノクローナル抗体を使用したELISAベースの定量化によって組織レベルで研究されました[21、45]。 AGE検出のためにこれまでに利用可能な最良の分析技術は、液体またはガスクロマトグラフィーとそれに続く分光光度または質量分析検出です[12、46、47、48、49]。 AGEの定量分析は依然として主要な技術的課題であり、AGEに利用できるいくつかの技術は高価であるため、ポイントオブケアアプリケーションでの使用が制限されます。 AGEsの定性的および定量的評価のための新しい戦略の開発は、生命を脅かす病気に影響を与えるため、1時間の必要性です。

比色センサーの開発には多大な努力が払われてきました。これは、検出が簡単で、応答時間が速く、特に生物学的アプリケーションの費用対効果が高いためです[50]。その中でも、表面プラズモン共鳴（SPR）ベースのセンサーは、検出感度が高いため、特に興味深いものです[51]。本研究では、AGE製品の定性的同定のための金ナノ粒子（GNP）の光学特性を調査しました。 GNPは、独自の調整可能なSPRで知られているため、さまざまな生体分子を検出するための比色レポーターとして進化しました。 GNPに基づく光学センサーには、小さな化学分析物[52]、糖[53]、さまざまなタンパク質[54]、タンパク質凝集体[55]、およびタンパク質のコンフォメーション変異体[56]用のセンサーが含まれます。以前、糖化タンパク質テンプレートに播種した場合のGNPが糖化の進行に応答する可能性があることを示しました[57]。ここでは、AGEsが示す還元特性を利用して、比色分析によるさまざまな糖化生成物の定性的検出のためにこの概念を拡張しました。簡単に説明すると、HbA0は、還元糖としてフルクトースを使用してin vitroで糖化され、AGE形成と、それに関連するタンパク質骨格の構造変化が分光法を使用して確認されました。糖化されたHbをゲルろ過クロマトグラフィーを使用して分画し、分子量に基づいて生成物を分離し、得られた画分を使用してGNPを合成した。非タンパク質性のAGE製品のみが金ナノ構造の合成を指示し、その結果、それらの識別が可能になりました。

増大する証拠は、糖尿病、老化、アルツハイマー病、腎疾患、アテローム性動脈硬化症、およびさまざまな種類の癌を含む疾患における糖化のさまざまな生成物の関与を支持しています。私たちの調査結果は、糖尿病に関連する健康合併症の予後に関係している可能性のあるさまざまなAGE製品を特定するためのシンプルで高感度の比色センシングプラットフォームとしてのGNPの使用を強調しています。

メソッド

資料

ヘモグロビンA0（HbA0）およびセファデックス（G25）は、Sigma Aldrich IndiaPvtから入手しました。 Ltd.テトラクロロ金酸水素（III）三水和物（HAuCl ₄ .3H ₂ O）LobaChemieから購入しました。フルクトース、オルトリン酸二水素カリウム、オルトリン酸水素二カリウム、オルトリン酸水素ナトリウムナトリウム、オルトリン酸水素二ナトリウム、フェリシアン化カリウム、トリクロロ酢酸、塩化第二鉄、硝酸（HNO ₃ ）、塩酸（HCl）、アクリルアミド、ビスアクリルアミド、過硫酸アンモニウム、TEMED、ドデシル硫酸ナトリウム、クマシーブリリアントブルー、グリセロール、ジチオスレイトール、TRIS塩基、および使用したその他の化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく使用しました。 MilliQ超純水（>18MΩ）をすべての実験に使用しました。

メソッド

HbA0の糖化

HbA0とフルクトースのストック溶液は、オートクレーブ処理したリン酸カリウム緩衝液（0.1 M、pH 7.4）で調製し、使用前に0.2μmシリンジフィルターを使用してろ過しました。 HbA0サンプルは、37°C​​のインキュベーター内で、さまざまな濃度のフルクトースとともにさまざまな時間（1〜10日）インキュベートされました。フルクトースとHbA0の最終濃度は0.1Mと1mg mL ^-1 でした。 それぞれ。同じ濃度のHbA0とフルクトースのコントロールも維持されました。 10日間糖化されたサンプルには、「Day 10」という接頭辞が付けられ、インキュベートされなかったコントロールサンプルには、接頭辞「Day0」が付けられます。すべての実験は、層流フード内の無菌条件下で実施されました。

プロパティアッセイの削減

糖化サンプルの還元特性は、Guによって記述された方法によって決定されました。 etal。 [37]マイナーな変更。次に、100μLの糖化サンプルとそれぞれのタンパク質および糖コントロールを、1mLの0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液および1mLの1％フェリシアン化カリウムと混合しました。混合物を水浴中で50℃で20分間インキュベートした。混合物を室温に冷却した後、１ｍＬの１０％トリクロロ酢酸を加えた。この混合物1mLに、MilliQ水1 mLと0.1％塩化第二鉄200μLを加えました。得られた混合物の吸光度を700nmで測定した。グリコシル化サンプルの代わりに0.1Mリン酸緩衝液を添加したネガティブコントロールを維持し、これを吸光度測定のブランクとして使用しました。 700 nmでの吸光度が高いほど、その還元特性は高くなります。

セファデックス（G25）を使用した0日目Fruc-Hbおよび10日目Fruc-Hbのゲルろ過クロマトグラフィー

簡単に説明すると、Sephadex（G25）ビーズをMilliQ水に一晩浸し、長さ15 cm、直径1 cm、内容積15mLのガラスカラムに詰めました。最初に、カラムを大量のMilliQ水で洗浄し、続いてリン酸カリウム緩衝液（0.1 M、pH 7.4）で洗浄しました。リン酸緩衝液で平衡化した後、約600μLのFruc-Hbサンプルをカラムにロードしました。同じ緩衝液を用いて、1時間あたり7.5mLの流速で溶出を行った。ロードされたサンプルがカラムから約10cmの距離を横切ったら、フラクションを収集しました。各サンプルから約30のフラクションを収集し、その後特性を評価しました。ここでは、0日目のFruc-Hbとそれに由来する画分が、10日目のFruc-Hbサンプルとそれぞれの画分に対するコントロールとして機能しました。

金ナノ粒子の合成

GNP合成に使用されたすべてのガラス器具は、王水（HCl：HNO ₃ ）で洗浄されました。 容量で3：1の比率で）、使用前にエタノールと超純水ですすいでください（注意！王水は非常に腐食性の酸化剤であり、細心の注意を払って取り扱う必要があります ）。 Hbの糖化生成物の還元特性を利用して、GNPの合成を行った。室温（RT）で行われる典型的な実験では、32μLのHAuCl ₄ の水溶液 （1％ w / v ）を絶えず撹拌しながら3.868mLのMilliQ水に加えた。金の塩が完全に溶解すると、溶液は淡黄色に変わります。次に、必要なFruc-Hbサンプル50μLまたはフラクション100μLを金塩溶液に添加しました。すべての反応物が完全に混合されたら、撹拌を停止し、反応混合物を静置して、GNPの成長を可能にした。最終反応混合物では、Fruc-Hbサンプルの濃度は12.5ngμL ^-1 でした。 （12.5μgmL ^-1 ）および画分のそれは1ngμL ^-1 （1μgmL ^-1 ）（詳細な計算はS6に記載されています）。添加したサンプルに応じて、反応混合物にピンクから紫の範囲の色が現れました。反応混合物の色が安定し、それ以上の変化が観察されなくなるまで、すべてのサンプルを維持しました。

ブラッドフォードアッセイ

Fruc-Hbサンプルから収集した画分を、ブラッドフォードアッセイを使用してタンパク質の有無について分析しました。簡単に説明すると、20μLの未希釈画分のそれぞれに約200μLのブラッドフォード試薬を添加し、595nmと450nmで吸光度を測定しました[58]。 595nmと450nmでのODの比率を画分数に対してプロットし、比率が高いほどタンパク質の割合が比較的高いことを示しています。

分光法

UV-可視分光法

すべてのFruc-Hbサンプル、それぞれのコントロール、および糖化サンプルからのクロマトグラフィー画分のUV-Visibleスペクトルを、Perkin Elmer、Lambda 25UV-Visible分光計で記録しました。スペクトルは、スキャン速度240 nm / min、スリット幅1 nmで800〜200nmのスキャンを実行して取得しました。すべての測定は、1 cmの光路長、1mLの石英キュベットを使用して行われました。 GNPのUV-Visibleスペクトルも同様の方法で記録されました。

蛍光分光法

タンパク質の構造変化とAGE形成を特定するために、Fruc-Hbサンプルの蛍光発光プロファイルと0日目Fruc-Hbおよび10日目Fruc-Hbのフラクションを、Agilent Technologies CaryEclipse蛍光分光光度計を使用して実行しました。励起および発光スリット幅を5nmに設定し、光路長1cmの石英キュベットを使用してスペクトルを取得しました。トリプトファン蛍光/内因性タンパク質蛍光およびAGE蛍光をそれぞれチェックするために、サンプルを280nmおよび350nmで励起しました[34、35、36、37、38]。

円二色性分光法

Fruc-Hbサンプルの二次構造の変化は、円二色性分光法を使用して識別されました。測定は、ストップフローを備えた円二色性（CD）分光計、Applied PhotoPhysics Chirascan（Applied Photophysics Limited、英国）を使用して実行されました。スペクトルは、190〜260nmの範囲の遠紫外線で取得されました。

すべての分光測定で、0.1 mg mL ^-1 のFruc-Hbサンプル 濃度を使用し、0日目Fruc-Hbおよび10日目Fruc-Hbからの画分を希釈せずに分析しました。リン酸カリウム緩衝液（pH 7.4、10 mM）は、すべての実験でブランクとして機能しました。すべての測定値は、室温で3回測定されました。

透過型電子顕微鏡

Fruc-Hbサンプルとそれぞれのコントロールから合成されたGNPのサイズと構造を特定するために、透過型電子顕微鏡（TEM）–JEOL2100Fを使用して電子顕微鏡分析を行いました。 GNPは、6000 rpmでの遠心分離によって濃縮され、メッシュサイズ300の銅コーティングされたカーボングリッド上にドロップキャストされました。分析前に、サンプルを室温で一晩乾燥させました。

GNPの色強度プロファイル

GNPの色を測定可能な値で表すために、デジタルカラーを使用して各金コロイドから赤、青、緑の色平面を抽出することにより、（RB）/ G（（赤の強度-青の強度）/緑の強度）を計算しました。メーター。

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動

糖化後のHbA0の分子量の違いを確認するために、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS PAGE）を実施しました。 0日目、10日目のHbA0コントロールおよび0日目と10日目のFruc-Hbを6Xローディングバッファーを含む10％SDSと混合し、5分間煮沸した後、30μLのサンプルをキャストゲルにロードしました（スタッキングゲル- 5％;分離ゲル-12％）。サンプルは、Bio-RadのMini PROTEAN Tetradシステムを使用して、100Vで10-175kDa PiNK Plus染色済みタンパク質ラダー（カタログ番号PM005 0500）とともに実行されました。ゲルは、Bio-RadTransイルミネーターの白色光源の下で視覚化されました。

結果

フルクトース、ヘモグロビンA0、および糖化ヘモグロビンA0からのGNP合成

還元糖グルコースはinvivoでHbA0と反応して、糖尿病に関連する高血糖レベルの主要なバイオマーカーであるよく知られた初期糖化付加物であるHbA1cを生成することが知られています[59]。インビトロでより速い糖化速度論および高いAGE蓄積を達成するために、後者と比較して強力な糖化剤であるグルコースの代わりにフルクトースが使用される[55、56、57、58、59、60]。私たちの研究では、還元糖としてフルクトースを使用してヘモグロビンA0の糖化を行い、糖化を10日間モニターしました。これは、実質的なAGE形成に十分であると報告されています[57]。図1は、invitroでフルクトースと10日間インキュベートした後のHbA0サンプルでのAGEの形成を示しています。 AGE形成は、350nmで励起したときの450nmでの蛍光発光を定性的に測定することによって評価されました[38,39,40,41,42]。 450 nmでの蛍光発光の10倍以上の増加により、非グリコシル化HbA0​​（0日目Fruc-Hb-インキュベーションなしのHbA0とフルクトースの物理的混合物）と比較して、グリコシル化HbA0​​（10日目Fruc-Hb）でAGE産物の形成が確認されました。サンプルの詳細な生物物理学的特性は、追加ファイル1（S1およびS2）で説明されています。

ヘモグロビンをフルクトースと10日間インキュベートしたときの450nmでの蛍光の生成によって測定されたAGEの形成。 0日目のFruc-Hbと10日目のFruc-Hbの450nm蛍光発光の比較

タンパク質糖化に由来するAGEの比色センサーとしてGNPを使用するには、糖およびタンパク質反応物からのGNPの形成速度を研究することが前提条件でした。フルクトースとヘモグロビンA0は、単独で、または強力な還元剤と組み合わせて使用​​すると、金のナノ構造の合成を指示することがすでに報告されています[53、61、62、63]。ただし、形成速度の違いを理解するために、追加の還元剤の非存在下でそれぞれ0日間と10日間インキュベートしたFruc-Hb、フルクトース、およびHbA0から合成されたGNPを比較しました。これらのテンプレートの還元特性は、方法のセクションで説明されているプロトコルに従って生化学的に測定されました。全体として、10日目のサンプルは0日目のサンプルよりも高い還元特性を示し、Fruc-Hbは最大の還元特性を示し、どちらの場合もフルクトースとHbA0が続きました。これは、Fruc-HbサンプルにAGEが存在するためと考えられます（図2a）。これらのサンプルのうち、通常の濃度では、10日目のFruc-Hbのみが4日の終わりまでに安定したGNPの合成に寄与しました（図2b）が、残りのサンプルは、許可された場合にのみそうすることができました。長期間（通常は10日以上）保持し、結果はサンプルの得られた還元特性と一致します（データは示していません）。 10日目のFruc-Hb_GNPの可視光吸収スペクトルは、530 nm付近にピークを生成し（図2c）、粒子は、サイズと形態を研究するために、透過型電子顕微鏡（TEM）によっても特徴付けられました（図2d）。電子顕微鏡写真は、21.930±2.4 nmの平均直径を持つ球状粒子の存在を示しました（図2e）。また、粒子は本質的に多結晶であり、格子点はfcc格子の111、200、220、311面に対応します（図2f）。示差的に糖化されたサンプルからのGNP形成の詳細な速度論的分析は、S3に記載されています。

HbA0、フルクトースおよびFruc-HbサンプルからのAGE形成およびGNP合成の特性評価。 a 第二鉄イオン還元試験によって測定された、それぞれ0日および10日のインキュベーションのHbA0、フルクトース、Fruc-Hbの還元特性。 b それぞれのサンプルから合成されたGNPの写真。 c 10日目のFruc-Hb_GNPのUV-可視吸収スペクトル。 d 10日目のFruc-Hb_GNPの透過型電子顕微鏡写真（スケールバー：20 nm）。 e 粒子のサイズ分布と f 粒子のSAED

ここで、Fruc-Hbは、球状の金ナノ構造の合成を指示するためのテンプレートと安定剤の両方として機能します。 10日目のFruc-Hbのみが、糖やタンパク質の対応物と比較して、規定の時間で粒子合成を可能にするため、このメカニズムを使用して、糖化タンパク質テンプレートと非糖化タンパク質テンプレートを区別できます。

Fruc-Hbの分別は、2つの異なるクラスのグリコシル化産物を分解します

AGEまたはタンパク質骨格の変化が10日目のFruc-Hbテンプレートに播種されたGNPで観察された異なるSPR応答の原因であるかどうかを確認することは興味深いことでした。さらに調査するために、方法のセクションで説明したように、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用して、10日目Fruc-Hbと0日目Fruc-Hbを分画しました。 ０日目のＦｒｕｃ－Ｈｂから得られた画分は、１０日目のＦｒｕｃ－Ｈｂからの画分に対する対照として機能した。図3は、フラクションの分光学的特性をまとめたものです。図3aは、0日目のFruc-Hb（赤）と10日目のFruc-Hb（黒）から収集されたフラクションの溶出プロファイルを示しています。 Fruc-Hbの分画で得られた特徴的な溶出プロファイルは、以前の報告[37]と一致しています。

0日目のFruc-Hb（赤）および10日目のFruc-Hb（黒）画分の溶出プロファイル。 280 nmで測定されたUV吸光度プロファイル（ a ）およびタンパク質の存在についてのブラッドフォードアッセイ（ b ）0日目Fruc-Hbおよび10日目Fruc-Hbからの画分の

0日目と10日目の画分にタンパク質が存在することは、タンパク質に存在する芳香族アミノ酸による280nmのUV光の吸収によって確認されました。 280 nmでの吸光度によって測定された10日目のFruc-Hbの溶出プロファイルは、IおよびIIとマークされた製品の2つの集団の存在を示しています。高分子量の製品からなる母集団Iは、画分番号の範囲です。 5から12および分数番号。低分子量製品に対応する15以降は、人口IIに分類されます。 IとIIの間に2〜3のフラクションにまたがる小さな範囲が観察され、UV吸収は観察されませんでした。一方、0日目のFruc-Hbからのフラクションの単一の集団は、UV光吸収（集団I）を示し、10日目のフラクションの領域IIでの吸収は、結果として10日目のFruc-Hbで生成された生成物によるものであることを確認しました。糖化の。メイラード反応の中間体が近紫外線範囲の光を吸収することがすでに報告されており[64]、これが観察を裏付けています。 0日目の画分と比較して10日目の画分による280nmでの紫外線の吸収の向上は、糖化の結果としてタンパク質が広範囲に展開し、芳香族アミノ酸が露出したためである可能性があります（図3a）。

S1で説明したように、糖化はタンパク質の二次および四次構造を大幅に変化させます。画分中のタンパク質の構造状態を確認するために、画分のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったところ、単量体および二量体バンドの代わりに融合バンドが観察され、10日目のFruc-Hbサンプルでタンパク質の架橋が確認されました。 （追加ファイル1：図S4）。

0日目のFruc-Hbと10日目のFruc-Hbの溶出プロファイルを比較すると、母集団Iに分類される画分は本質的にタンパク質性であり、0日目の画分（糖化されていない）には完全に存在しなかった2番目の母集団は非タンパク性糖化生成物。これらの発見は、0日目と10日目のFruc-Hbの両方の集団Iの画分のタンパク質性が確認されたブラッドフォードのアッセイによるタンパク質推定によって裏付けられています（図3b）。簡潔に言えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによる10日目のFruc-Hbの分画により、2つの異なる画分の集団が得られました。どちらも280 nmの光を吸収し、一方は本質的にタンパク質性で、もう一方は非タンパク質性です。

タンパク質性糖化製品と非タンパク質性糖化製品は本質的に蛍光性です

自然界のタンパク性および非タンパク性の糖化生成物の溶出を理解した後、これらの画分の蛍光発光を450 nmで測定して、AGE生成物の存在を特徴付けました。 UV溶出プロファイルと同様に、10日目のフラクションで2つの蛍光発光の集団が観察されますが、0日目のFruc-HbではAGE形成が発生しなかったため、0日目のフラクションのいずれも450 nmで蛍光発光を示しませんでした（図4）。蛍光強度は10日目の画分間で大幅に変化し、糖化生成物の化学的性質の違いを示しています。蛍光溶出プロファイルでは、母集団Iに属する最初の溶出物は、高い蛍光強度の糖化生成物で構成されていました。これは、図3に示すタンパク質推定と合わせて、これらの画分にタンパク質性構造を含む高蛍光糖化生成物の溶出を示唆しています。 2番目の集団は、最初の画分と比較して、より弱い強度の蛍光発光を示しました。それらは本質的に非タンパク性であることがわかりましたが（図3b）、280 nmのUV光を吸収することができます（図3a）。

450nmでの蛍光発光の強度として表される0日目のFruc-Hbと10日目のFruc-Hb画分のAGE蛍光の比較

10日目の画分のUV吸収（図3）と蛍光発光（図4）を考慮すると、分画によってHbA0の2つの異なるクラスの糖化生成物が区別されることは明らかです。 G25カラムから最初に溶出される画分の集団は、高分子量で、本質的にタンパク質性であり、450nmで強い蛍光を発します。 2番目のクラスの製品は、低分子量の非タンパク質性構造であり、450 nmで蛍光を発しますが、強度は比較的低くなります。両方の生成物が「AGE」蛍光を示すため、タンパク質性構造は、メイラード反応中に最初に形成されるタンパク質骨格に架橋されたAGE生成物である可能性があり、2番目の集団の画分は結果として形成される糖化の後期生成物である可能性がありますAGE-タンパク質架橋の分解の分析。

Fruc-Hbサンプルからの画分にシードされたGNPにより、糖化生成物を区別できます

GNPの合成を使用して、糖化テンプレートと非糖化テンプレートを区別できることは明らかです（図2）。ここで、GNPが10日目のFruc-Hbからのタンパク性および非タンパク性の溶出液を区別できるかどうかを調べるために、方法で説明したように10日目のFruc-Hbから得られた画分を使用してGNPを合成しました。形成されたGNPの色は、すべてのサンプルが安定するまで監視されました。

図5に示すように、タンパク質性構造からなる画分（母集団I）はいずれも顕著なGNP形成を示しませんでしたが、非タンパク質性AGE生成物を含む画分（母集団II）は、コロイド溶液中でさまざまな色を示す安定したGNPを生成しました。 GNPの形成は、UV-Visible分光法を使用して特徴付けられ、吸光度の最大値がフラクション数に対してプロットされました。分光データは、視覚化されたGNPカラープロファイルを十分にサポートしています。このデータは、GNPベースのセンシングメカニズムに基づく糖化タンパク質テンプレートと非糖化タンパク質テンプレートの区別は、低分子量AGE生成物によって媒介され、同じメカニズムを使用して、タンパク質性と低分子量の非糖化タンパク質を区別できると結論付けています。 -タンパク質性糖化生成物。

10日目のFruc-Hb画分からのGNP合成。 10日目のフラクションから合成されたGNPの比色プロファイルと、フラクション数に対してプロットされたそれらの吸収極大

Fruc-Hbと金塩の濃度を上げるだけで、GNPベースの比色検出の動力学をさらに拡張して、応答時間を短縮することができます。 When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Conclusions

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

略語

AGEs:

Advanced glycation end products

Fruc-Hb:

Glycated Hb

GNP：

金ナノ粒子

HbA0:

Haemoglobin A0

SPR：

表面プラズモン共鳴