BSAコート金ナノロッドによる低線量NIR-II光熱療法の実現

概要

第2近赤外窓（NIR-II、1000-1300nm）は比類ない組織透過性を提供し、イメージングと光熱療法の理想的な光学領域として位置付けられています。しかし、この帯域で吸収しつつ低細胞毒性を維持する金ナノロッドの作製は困難でした。我々は、NIR-II窓全域で強力な表面プラズモン共鳴を示す高アスペクト比金ナノロッドシリーズを設計しました。これらのナノロッドを牛血清アルブミン（BSA）でコートすることで、光学性能を損なうことなく生体適合性を劇的に向上させました。乳がんマウスモデルにおいて、BSAコートナノロッドはわずか0.75Wcm⁻²のNIR-IIレーザー強度で完全な腫瘍アブレーションを達成しました。これらの結果は、大アスペクト比金ナノロッドを用いた低線量NIR-II光熱療法の実現可能性を確認します。

はじめに

金ナノ粒子（AuNPs）は、優れた生体適合性と低細胞毒性により、生物医学研究における汎用エージェントとして台頭しています。高いX線減衰によりCT腫瘍イメージング[1,2]に魅力的であり、顕著な表面プラズモン共鳴（SPR）が効率的な光-熱変換を可能にし光熱療法（PTT）[3,4]を実現します。サイズと形態が調整可能なAuNPs（ナノロッド、ナノシェル、ナノケージ）は、特に異方性により強いNIR吸収と光熱安定性を持つ金ナノロッド（AuNRs）ががんアブレーション向けに調整されてきました[5-8]。NIR光は可視光より深く組織に透過し、より長い波長では散乱が減少します[9]。ロッド状粒子は腫瘍透過性と循環持続性が向上し、蓄積を促進します[10,11]。しかし、従来のPTTは高出力レーザーを必要とし、付随損傷のリスクがあります[12]。NIR-II窓はNIR-Iより深い透過と低散乱を提供し、より低いレーザー強度で効果的な治療を可能にします[13-17]。しかし、NIR-IIで吸収し生体適合性を保つAuNRsの作製は困難です。ここでは、1000-1300nmの吸収ピークを持つAuNRsの種なし合成に続き、細胞毒性低減のためのBSAコーティングを報告します。インビトロおよびインビボでの光熱性能を評価し、乳がんマウスモデルで0.75Wcm⁻²という低レーザー強度での腫瘍アブレーションを実証します。

材料と方法

材料

四塩化金酸三水和物（HAuCl₄·3H₂O、99.9%）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（CTAB、99%）、硝酸（GR 65-68%）、過酸化水素（30%）、ホウ酸ナトリウム（NaBH₄、97%）、硝酸銀（AgNO₃、99.8%）、塩酸（38%）、ヒドロキノン（99%）、牛血清アルブミン（BSA、98%）を上海アラジン生物技術から調達。RPMI 1640、ペニシリン-ストレプトマイシン、PBS、胎仔牛血清（FBS）、4T1細胞、Cell Counting Kit-8（CCK-8）をHyClone、Corning、Gibco、同仁堂から入手。全工程で超純水（Millipore）を使用。

AuNR@CTABの調製

AuNRsを種なしプロトコルで合成。簡潔に、0.4mLの10mM HAuCl₄と10mLの0.1M CTABを、23-33μLの100mM AgNO₃と混合。その後、10-30μLの1.2M HClと525μLの0.1Mヒドロキノンを添加し、淡黄色の成長溶液を得た。15分撹拌後、新調した10mM氷冷NaBH₄を10-40μL注入し、30秒撹拌、室温で18時間エージング。AuNR@CTABをPBSで2回洗浄精製。

AuNR@BSAの調製

AuNR@CTABのCTAB濃度を1mMに調整し、超音波で完全溶解。3mLのAuNR@CTABと3mLの10mg/mL BSAを混合し、30分超音波処理。遠心分離（9500×g、40分）後、ペレットを6mLの5mg/mL BSAに再懸濁、2M NaOHでpHを11-12に調整、≥18時間撹拌。最終的なAuNR@BSAをPBSで2回洗浄し、PBS中で保存。

キャラクタリゼーション

透過型電子顕微鏡（TEM、Talos F200X）で形態評価；動的光散乱（DLS、Zetasizer Nano ZS）でサイズとゼータ電位測定；UV-Vis分光（島津UV-2700）で吸収記録。インビボ腫瘍分布は注射後切除腫瘍断面のTEMで検証。FT-IRとXRD解析（北京中科百策）でBSAコーティングと結晶性金を確認。

光熱性能

AuNR溶液（1064nmでOD=0.5-2）を1064nmレーザー（0.35-1Wcm⁻²）で30分照射し、温度変化を赤外熱画像（FLUKE TI25）で監視。光安定性を0.5Wcm⁻²で10分オン/オフ繰り返し照射サイクルで評価。

インビトロ細胞毒性

4T1細胞を96ウェルプレート（5×10³細胞/ウェル）に播種し24時間培養。AuNR@CTABまたはAuNR@BSA（10μL）を様々な濃度で添加し24時間培養。CCK-8（10μL）添加、40分培養、450nmで吸光度測定。光毒性アッセイでは、CCK-8試験前に1064nm照射（0.75Wcm⁻²、10分）を実施。

動物実験

雌BALB/cマウス（6-8週）を皮下に2×10⁶ 4T1細胞で接種。腫瘍が~100mm³に達した時点で実験開始。全手順は機関倫理指針に従った。

インビボ生体分布と循環

AuNR@BSA（200μL）を尾静脈注射。血液サンプルを0.25、2、4、6、8、12、36、48時間で採取、HNO₃とH₂O₂で消化、ICP-OESでAu含量定量。臓器（心、肝、脾、肺、腎）を24時間後に収穫、同様に消化・測定。

光熱治療効率

マウスを4群に分割：（1）AuNR@BSA、（2）AuNR@BSA+レーザー、（3）レーザーのみ、（4）対照。AuNR@BSA（200μL）を腫瘍内注射、10分後に1064nm照射（0.75Wcm⁻²、10分）。腫瘍温度、体積、体重を14日間モニタリング。研究終了時に腫瘍を切除。

データ解析

統計解析はSPSS 16.0で実施。データは平均±SDで表現；有意水準p<0.05。

結果と考察

AuNR@CTABの合成とキャラクタリゼーション

NaBH₄、HCl、Ag⁺濃度の最適化によりアスペクト比とSPRピーク位置を制御。NaBH₄増加でピークが1223から865nmへ青方偏移、HCl増加で871から1070nmへ赤方偏移。Ag⁺濃度低減でSPRピークがさらに延伸。最終AuNRsはワインレッド色を示し、吸収最大値1064nm（図1）。この波長はNIR-II窓と利用可能レーザー源に一致します。

図1. 合成条件変化下のAuNR@CTAB光特性：（a）調製スキーム；（b）TEM像；（c）NaBH₄依存UV-Vis；（d）HCl依存；（e）AgNO₃依存。

AuNR@BSAの合成とキャラクタリゼーション

CTABはナノロッド成長に有効だが、1-10μM以上で細胞毒性を示し、低温で沈殿する可能性がある。CTABをBSAで置換することで毒性を軽減しコロイド安定性を改善。AuNR@BSAは類似アスペクト比を維持しつつ、SPRピークが~30nm赤方偏移し1064nmに（図2）。ゼータ電位は正（CTAB）から負（BSA）へ変化し、表面交換を確認。FT-IRスペクトルでBSA特有のアミドバンド（1649、1539cm⁻¹）を検出。DLSで水動的直径8.6nmと89nmの2集団を示し、BSAコーティングによるわずかなサイズ増加を示唆。TEMでロッド状形態とわずかに丸みを帯びた末端を確認（図2）。全寸法100nm以下で腫瘍浸透に有利。

図2. AuNR@BSAとAuNR@CTABのキャラクタリゼーション：（a）合成；（b）UV-Visスペクトル；（c）DLSサイズ分布；（d）TEM像。

インビトロ光熱効果

AuNR@BSA（OD≈1）が0.35Wcm⁻²で5分以内に~25℃から80℃へ温度上昇、その後プラトー（図3A）。温度はレーザー出力に比例（図3B）。OD増加でピーク温度さらに上昇。0.5Wcm⁻²で10分照射の3サイクルで光熱安定性確認（図3D）。熱画像でAuNRs85.5℃対PBS44.5℃のピーク温度表示（図3E）。これらの結果は、NIR-II領域でのBSAコートナノロッドの優れた光熱変換と安定性を強調します。

図3. インビトロ光熱性能：（a）温度vs時間；（b）温度vsレーザー出力；（c）温度vs吸光度；（d）3サイクル安定性；（e）熱画像。

インビトロ細胞毒性と光熱毒性

AuNR@CTABは低濃度（OD≈0.05）でも顕著な細胞毒性を示したのに対し、AuNR@BSAはOD≈1まで>80%細胞生存率を維持（図4A）。光熱処理（0.75Wcm⁻²、10分）でOD≈1において4T1細胞生存率を~20%に低下、対照群は~100%生存（図4B）。したがって、BSAコーティングは生体適合性を維持しつつ効果的な光熱殺傷を可能にします。

図4. 細胞毒性と光熱毒性：（a）濃度依存性生存率；（b）レーザー有無での生存率。

インビボ生体分布と循環

AuNR@BSAは循環半減期~1.5時間を示しました（図5A）。24時間後、肝臓と脾臓への優占的蓄積が観察され、網内系取り込みと一致（図5B）。これらの知見は肝臓-脾臓標的応用の可能性を示唆します。

図5. 生体分布：（a）経時的血中Au濃度；（b）24時間後の臓器分布。

インビボ光熱治療

AuNR@BSA腫瘍内注射後、1064nm照射（0.75Wcm⁻²、10分）で腫瘍温度を~64℃まで上昇、対照群は体温付近に維持（図6D）。14日間でAuNR@BSA+レーザー群は再発なしで完全腫瘍アブレーションを達成；対照群は急速進行（図6A、B）。剖検分析で残存腫瘍組織なしを確認（図6C）。処理腫瘍のTEMで intactなAuNRsを確認、インビボ光安実性を証明（図7）。

図6. インビボ治療アウトカム：（a）腫瘍体積；（b）体重；（c）腫瘍写真；（d）赤外線サーモグラフィ；（e）治療後画像。

図7. 腫瘍組織中のAuNR@BSAのTEM：（a）処理済み；（b）未処理。

結論

1064nm SPRピークを持つBSAコート金ナノロッドを合成し、高い光熱効率と向上した生体適合性を両立しました。インビボ研究で、低線量NIR-IIレーザー照射による乳がんマウスモデルでの迅速な腫瘍アブレーションを実証。ナノロッドは好ましい生体分布を示し、肝臓と脾臓への顕著な取り込み、腫瘍微小環境での光安定性を維持。これらの特性により、AuNR@BSAはNIR-II光熱療法の有望なプラットフォームとなり、免疫療法や化学療法との組み合わせで個別化された安全で効果的ながん治療への可能性を秘めています。

データと材料の入手可能性

本研究の基盤データセットは、責任著者への合理的な要請により入手可能です。本研究で生成または分析されたすべてのデータは、この出版記事に含まれています。