標的がん治療デリバリー：pHLIPでナノ小胞を装飾し酸性腫瘍微小環境を認識

概要

がん細胞表面の酸性度は腫瘍微小環境の特徴であり、腫瘍灌流に依存しないため、腫瘍細胞標的化の一般的バイオマーカーとなり得ます。私たちはpH（低）挿入ペプチド（pHLIP）を用いてリポソームとニオソームを装飾しました。pHLIPはがん細胞表面のpHを感知し、標的細胞の膜に挿入し、ナノマテリアルを細胞膜の近接に導きます。pHLIPを含む/含まないDMPCリポソーム、Tween 20またはSpan 20ニオソームを完全に特性評価し、ナノキャリアの特徴に関する基礎的理解を得て、酸性感受性ナノベクターの合理的設計を促進しました。サンプルの時間経過と血清存在下での安定性を実証。ナノベクターのサイズ、ζ電位、形態、親水性プローブの捕捉能力と放出制御能力を調査。pHLIP装飾小胞は、腫瘍やその他の酸性疾患組織を標的とする生物活性物質の延長（修正）放出に有用である可能性があります。

はじめに

約1世紀前、パウル・エールリヒは「魔法の弾丸」による特定かつより効果的な薬物送達のアイデアを提唱しました。「魔法の弾丸」は、送達薬物を過酷な環境から保護し、標的組織への薬物送達で副作用を減らし、薬物動態と薬力学を改善し、薬物放出を調節する必要があります。

1965年、バンガムが初めてリン脂質ベースの小胞を観察し、その後グレゴリ・グレゴリアディスがリポソームが薬物をカプセル化して薬物送達システムとして利用できる概念を確立しました。特に、疎水性脂質鎖が二つの親水性ヘッドグループ層の間に閉じ込められたリン脂質閉鎖二重層（ラメラ）で構成されます。閉鎖二重層が水性コアを囲み、疎水性または親水性薬物をそれぞれ局在化させます。

リポソームサイズは、投与後のキャリア運命に影響する重要なパラメータで、血漿タンパク質吸収、網内系（RES）認識、血中半減期、細胞輸送の観点から重要です。ナノサイズキャリアは細胞取り込みと腫瘍標的化を促進するため、多くの研究者が「ナノ化」に注力してきました。

より汎用的で経済的なナノキャリアを得るため、合成界面活性剤を用いてリポソーム様薬物送達システムが作製されてきました。非イオン性界面活性剤が広く用いられ、単層または多層小胞（非イオン性リポソーム、ニオソーム、非イオン性界面活性剤小胞）に自己組織化します。ソルビタンエステル界面活性剤（Span®）はニオソーム調製に広く用いられる疎水性物質。血中循環時間を延長し「ステルス」ナノキャリアを得るため、ポリエチレングリコール（PEG）導入がゴールドスタンダード：この共役によりエトキシエチル化ソルビタンエステル界面活性剤（Tween®）が得られます。SpanとTweenは異なる親水性/疎水性バランス（HLB）値を持ち、界面活性剤の選択で所望の特性を持つニオソームが調製可能。さらに、コレステロール添加は界面活性剤鎖を伸ばし、ゲル-液相転移温度に影響し、疎水性二重層に剛性を与えることで二重層安定性を向上させます。「最適化」ナノキャリアは、処方改善と/または標的化強化のために設計されます。

現在、がんは世界の主要な死因の一つ。既存治療アプローチには、腫瘍への非効率的な薬物送達、腫瘍標的化の欠如に伴う望ましくない危険な副作用などの限界があり、ナノテクノロジーアプローチが克服の助けとなり得ます。

現在、様々な標的化アプローチが開発中。ほとんどはがん細胞表面で過剰発現する特定バイオマーカーを標的とします。しかし、ヒト腫瘍は非常に不均一であるため、より一般的な腫瘍標的化アプローチの方が有利です。がん細胞表面の酸性度は腫瘍微小環境の特徴であり、腫瘍灌流に依存しないため、腫瘍細胞標的化の一般的バイオマーカーとなり得ます。pH（低）挿入ペプチド（pHLIP）技術は、標的イメージングと治療用小分子、ナノマテリアルの腫瘍標的化で急速に発展しています。pHLIPはがん細胞表面のpHを感知し、標的細胞の膜に挿入します。pHLIPの挿入メカニズムは、低pH（pH<7.0）でのペプチドの負電荷残基のプロトン化により引き起こされます。これによりペプチドの疎水性が増し、平衡が二重層へのペプチド分配側にシフトします。pHLIPで装飾されたナノキャリアは生体適合性があり、腫瘍を標的とし、がん細胞への細胞取り込みを増強します。調査されたpHLIPコートナノ粒子には、脂質、ポリマー、金属ベースのナノマテリアルがあります。

本研究の目的は、pHLIPで装飾された新規小胞ナノキャリアを完全に特性評価し、ナノキャリア特徴の基礎的理解を得て、酸性感受性ナノベクターの合理的設計を促進することです。

材料と方法

材料

ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Tween 20）、ソルビタンモノラウレート（Span 20）、コレステロール（Chol）、HEPES塩{N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)}、ヒト血清、セファデックスG-75、カルセイン、ジフェニルヘキサトリエン（DPH）はSigma-Aldrichから購入。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DMPC）と1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチルアミド]ナトリウム塩（DSPE-マレイミド）はAvanti Polar Lipidsから、ピレンはFlukaから入手。pHLIPペプチド（ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT）はCS Bioで合成・精製。その他すべての試薬は分析グレード。

DSPE-pHLIPの合成

pHLIPをメタノール中でDSPE脂質と共役結合。pHLIPのN末端単一システイン残基とDSPE-マレイミドの共価結合により、以前記載の方法で実施。簡単に説明すると、5 mgペプチドを250 μLメタノール（アルゴン吹き出し）に溶解し、DSPE-マレイミド（9.9 mMストック溶液、クロロホルム溶液）と1:1モル比で混合。反応混合物を室温で2-6時間保持し、共役完了まで反応。RP-HPLCで反応進行をモニタリング（水中0.05% TFA含有アセトニトリル25-80%勾配）、未標識pHLIPピークの減少を確認。合成構造体をSELDI-TOF質量分析で特性評価。DSPE-pHLIP共役濃度はpHLIPのモル消光係数ε₂₈₀=13,940 M⁻¹cm⁻¹を用いた吸光度で決定。

小胞の調製と精製

薄膜蒸発法で、非イオン性界面活性剤（Tween 20またはSpan 20）とリン脂質（DMPC）から、pHLIPあり/なしで小胞を調製。各処方でコレステロールを異なるモル比で添加（表1）。

サンプル組成は、以前よく特性評価された構造を選択し、同量のpHLIPを添加して最適化。

親油性成分をクロロホルム:メタノール混合液（3:1）で溶解、有機溶媒をサンプルに応じた異なる温度で減圧除去。得られた膜をHEPESバッファ（0.01 M、pH 7.4）またはカルセインナトリウム溶液（10⁻² M）5 mLで水和。懸濁液を約5分ボルテックス混合、その後超音波処理（追加ファイル1: 表S1参照）をマイクロプローブ（20 kHz、VibraCell-VCX 400-Sonics、Taunton、MA、USA）で実施。LipoDMPC超音波処理は酸化防止のため不活性ガス雰囲気下で実施。

小胞懸濁液をセファデックスG-75（ガラスカラム50×1.2 cm）とHEPESバッファ溶出液でゲル浸透クロマトグラフィー精製。その後、適切な孔径のセルロースフィルターでろ過。

pHLIPコートニオソームとリポソームも同じ調製法で作製。

動的光散乱測定

小胞の平均サイズとサイズ分布を25°Cで動的光散乱（DLS）により測定。Malvern NanoZetaSizer ZS90、5 mW HeNeレーザー（波長λ=632.8 nm）、デジタル相関器を使用。散乱光強度の90°角での正規化自己相関関数をContinアルゴリズムで解析し、粒子拡散係数Dの分布、ストークス-アインシュタインの関係R_H=k_BT/6πηDから有効流体動力学的半径R_Hの分布を取得。ニオソーム/リポソームのサイズ分布幅は小さいが無視できない。表2の値は粒子の強度加重平均流体動力学的直径に対応。

ζ電位測定

電気泳動移動度をレーザードップラー電気泳動法で測定、Malvern NanoZetaSizer ZS90装置を使用。移動度uをSmoluchowskiの関係ζ=uη/εでζ電位に変換（ηとεは溶媒相の粘度と誘電率）。

小角X線散乱

小角X線散乱（SAXS）実験を欧州シンクロトロン放射光施設（ESRF、グルノーブル、フランス）で実施。ID02高輝度ビームラインを使用し、運動量移動領域0.1 nm⁻¹≤q≤6 nm⁻¹（q=(4π/λ)sin(θ/2)、θは散乱角、λ=0.1 nm X線波長）で希薄溶液を測定。対応する調査長スケールは1-60 nmで、ニオソーム/リポソーム小胞の内部構造アクセスに適する。全実験を25°C、短照射時間0.1 sで実施し放射線損傷を防止。各サンプルで異なる散乱角での散乱強度を2D検出器で取得、角度再グループ化、バックグラウンドと溶媒寄与を差し引き、溶液中の小胞の形状と内部構造情報を取得。

単層小胞の場合、閉鎖二重層を外側ヘッドグループ、疎水性鎖、内側ヘッドグループに対応する3つの同心シェルでモデル化。シュルツ分布を小胞サイズに仮定。

クライオTEM

小胞溶液（5 μL滴）をレースフォルマー/カーボン電子顕微鏡グリッドに広げ、液体エタンでの急速凍結で凍結水和状態で保存。ビトリフィケーションプロセスはFEI Vitrobotシステムで、単一ブロット3 s、オフセット1、ドレインと待機時間1 sの設定で実施。透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL 2100）、加速電圧200 kV、倍率×10,000〜×150,000で小胞を撮像。

安定性試験

pHLIPあり/なしで調製したニオソームとリポソームの物理的安定性を、2つの異なる保存温度（25°Cと4°C）で評価。90日間でサイズとζ電位の有意な変化があるか調査。各バッチから定時点（1、30、60、90日）でサンプルを採取し、サイズとζ電位を前述通り測定。

同様に、ヒト血清など生物学的流体存在下での安定性も調査。懸濁液を45%ヒト血清と37°Cで接触。定時点（0、30分、1時間、2時間、3時間）で小胞サイズとζ電位の変化を測定。

二重層特性評価

ニオソーム/リポソーム二重層の流動性と微小粘度-極性を、二重層膜の疎水性領域に局在する2つの蛍光プローブ、ジフェニルヘキサトリエン（DPH）とピレンの蛍光測定で評価。DPH（2 mM）とピレン（4 mM）、それぞれ220 μLと2.5 mgを小胞調製前に界面活性剤またはリン脂質/コレステロール混合物に添加。その後、ピレン負荷小胞は前述通り精製、DPH負荷小胞は孔径を段階的に小さく（5.0から0.22 μm）してろ過。

蛍光異方性測定を室温でLS55分光蛍光光度計（PerkinElmer、MA、USA）で、λ_ex=400 nm、λ_em=425 nmで実施。蛍光異方性（A）を次式で計算：

ここでI_vvとI_vhは垂直偏光励起光に対して平行および垂直な方向の蛍光強度（任意単位）。補正係数G=I_hv/I_hhは励起光が水平偏光のときの垂直および水平偏光放出成分の比。蛍光異方性値は膜流動性に反比例。したがって、高い蛍光異方性値は高い構造秩序および/または低い膜流動性に対応。

小胞二重層の微小粘度と微小極性を評価するため、ピレンを用いた蛍光実験をPerkin-Elmer LS55分光蛍光光度計でλ_ex=330 nm、放出スペクトル350<λ_em<550 nmで記録。ピレン蛍光の微細構造は5つのピークを呈する。第一（372 nm）と第三（382 nm）振動バンドの強度比I₁/I₃はピレン環境の極性に関連。I₁/I₃比の低値は非極性環境に対応。さらに、小胞二重層に取り込まれたピレン分子は分子内エキシマーを形成し、このプロセスはプローブ微小環境の粘度に敏感。したがって、エキシマー/モノマー蛍光強度比I_E/I_Mは微小粘度に関連。

これらの研究をpHLIPあり/なしで調製した小胞で実施し、結果を比較。

カルセイン放出試験

非イオン性界面活性剤またはリン脂質小胞をカルセイン濃度10⁻² Mで負荷。この濃度ではカルセイン蛍光は自己消光。消光測定で小胞水性コアからのカルセイン放出を決定。蛍光プローブは薄膜水和時に5 mLカルセイン水溶液添加で小胞内に負荷。小胞懸濁液をゲル浸透クロマトグラフィーで精製、45%ヒト血清またはHEPESと接触、セルロース膜透析バッグ（カットオフ分子量8,000 Da、Spectra/Por®）に充填。放出実験を37°C、磁気攪拌下、HEPESバッファ（10 mM、pH 7.4）を外部媒質として実施。外部媒質のアリコートを0-24時間の異なる時点で採取。採取アリコートを随時システムに再導入。

カルセイン放出を、Perkin-Elmer LS50B分光蛍光光度計でλ_ex=492、λ_em=520 nmで媒質蛍光測定によりモニタリング。参照値F_∞（任意単位）、小胞内捕捉総カルセイン量に相関、イソプロピルアルコール（1:1 v/v）で小胞破壊後に決定。各時点での放出率（F%）を次式で算出：

ここでF_t（任意単位）は特定時点tでの蛍光読み取り値。

統計解析

一元配置分散分析（ANOVA）で統計解析。事後Bonferroni t検定でANOVA検定の統計的有意性を評価。p値<0.05を統計的有意と判定。結果は3回実験の平均±標準偏差。

結果と考察

Tween 20、Span 20、DMPC小胞をDSPE-pHLIPあり/なしで調製し、サイズとζ電位を特性評価（表2）。

表2の結果によると、分析サンプルはpHLIPの有無に関わらず、サイズとζ電位で有意な変動を示しません。

上記サイズ範囲は、クライオTEMなど異なる解析技術でも確認されました（図1）。

pHLIPコートニオソームとリポソームの代表的クライオTEM像。NioSpan20-pHLIPニオソーム（a）とLipoDMPC-pHLIPリポソーム（b）を×10,000倍、LipoDMPC-pHLIPリポソーム（c）を×40,000倍で撮像

DSPE-pHLIPあり/なしのニオソーム/小胞の内部構造をSAXS実験で決定。図2に示すSAXS強度スペクトルは異なり、各系が独自の特徴を持つことを示します。

SAXSスペクトル。DSPE-pHLIPなし（黒開き記号）とあり（色付き記号）のニオソーム/小胞強度スペクトル

Tween 20ベースニオソームは単層、DMPC小胞はリポソームとして一定程度の多層性を示す（q≅1 nm⁻¹の特徴ピーク、層間距離6 nm、約5 nm脂質二重層と1 nm水）。Span 20ベース小胞は明確に多層で、q=1.6 nm⁻¹の特徴ピーク、層間距離3.8 nm、Span 20分子長の2倍に一致。Span 20小胞の多層シェルは、ほぼ層間水なしで隣接二重層で構成されることを示唆。

DSPE-pHLIPの存在（1 mol%未満）はシステムを劇的には変化させません。調査全q範囲で散乱強度は非常に類似し、構造化物質の比率と小胞粒子の全体サイズが比較的同等であることを示します。

DMPCベース小胞はリポソーム内の二重層数がわずかに増加（q=1 nm⁻¹のブラッグピーク強度増加から推測）。各ペプチド分子に連結したDSPE C18鎖の低分配率挿入は脂質二重層厚さを変化させず、主にDMPCに対するコレステロールの大きな割合（約40-50%）で決まる。このコレステロール濃度では、脂質鎖は液秩序（Lo）相で組織化され、鎖の弱い側方位置秩序が鎖に沿った高い配向秩序から分離され、構造変化なしで少数のC18鎖を収容可能。Span 20ベース多層小胞も内部構造に変化なし。

Tween 20+pHLIP系では、少量のコレステロール微結晶が存在（q=1.84 nm⁻¹の典型的鋭いピーク、特性距離3.41 nm）、小胞構造は影響なし。少数の微結晶はTweenベースニオソームで組成、調製手順、精製に依存してよく見られる。図2にTween 20とTween 20+pHLIP小胞の2つの実験スペクトルを、球形閉鎖二重層を外側ヘッドグループ、鎖、内側ヘッドグループの3同心シェルでモデル化したフィッティング曲線とともに示す。フィッティング平均小胞サイズは両系で約168 nm、DLS結果と一致。構造パラメータは2つの閉鎖二重層で同じ（追加ファイル1: 図S1と表S2参照）だが、外側シェルのみ異なる：DSPE-pHLIP存在下でヘッドグループ電子密度がわずかに減少（5%、0.42から0.40 e/ų）、層の粗さが増加。この結果はDSPE-pHLIP添加が主に小胞の外側シェルに影響することを示唆。DSPE C18鎖が二重層に挿入し、延長・分岐したポリエチレングリコールヘッドグループの間でペプチドを小胞表面にアンカーする図式と整合。pHLIPペプチド自体（脂質分子に連結されていない）が高pHで小胞外表面と相互作用し、低pHで二重層に挿入する能力は、不飽和リン脂質二重層の場合にSAXSで最近観察された。本研究ではペプチドのモル分率が著しく低く、ペプチドは脂質に連結されており、pHLIPコートpH感受性薬物ナノベクター設計が目的。pHLIP結合は、共役DSPE C18鎖の疎水性相互作用によるナノベクター疎水領域への挿入で駆動される。pHLIPペプチドはアンカーされ、外側ヘッドグループ領域に位置し、酸性pHで標的膜と相互作用し、または低pH環境での二重層再配列後にナノベクター内容物を放出する準備状態にある。

pHLIP存在が二重層ミクロレオロジー特性（流動性、微小粘度、極性）に影響するか調査するため、親油性シェル特性評価を実施。調製手順開始時にサンプルに添加した蛍光プローブピレンを用いて特性評価研究を実施。親油性のため小胞二重層に挿入し、膜環境の極性と微小粘度について情報を提供。

表3に示すように、3サンプルセットすべてで、極性値はpHLIP存在下で対照小胞比わずかに減少、微小粘度値はすべての小胞で3倍増加。

二重層を、脂質に組み込んだ別の親油性蛍光プローブDPHの蛍光異方性測定でさらに特性評価。これらの測定はプローブの動きと二重層内での配向を反映し、小胞内容物放出能力に影響する二重層流動性の情報を与える。蛍光異方性値は膜流動性に反比例。したがって、高い蛍光異方性値は高い構造秩序および/または低い膜流動性、液秩序相に対応。

各サンプルの異方性値を表3に示す。データはDSPE-pHLIP存在で膜流動性が増加（蛍光異方性減少）を示唆。二重層流動性は非極性鎖の秩序と側方組織だけでなく、極性ヘッドグループにも影響されることが知られている。3システムのSAXS結果はDSPE-pHLIP分子が主にヘッドグループ領域に影響し、極性ヘッドの異なる充填を引き起こす可能性を示す。構造結果は、2つの異なるプローブ挿入で明らかになったDSPE-pHLIP共存時の二重層ミクロレオロジー特性と一致。ピレン（log P=4.88）で外側領域近くに挿入可能なプローブで微小粘度増加が明らかに。一方、DPHは二重層コアに埋め込まれ、脂質アシル鎖軸に平行または二重層中心に平行に配向すると想定。両親媒性アシル鎖の角度再配向に大きく感受性。DPHで明らかになった流動性増加は、DSPE鎖の他アシル鎖間への挿入効果と、pHLIPの極性ヘッドグループ領域への分配効果による界面活性剤充填特性の変化の両方に関連する可能性（図3）。

pHLIPと小胞膜の相互作用の表現

調製物のさらなる特性評価研究を実施。全サンプルをpHLIPあり/なしで4°Cで90日間保存し、サイズとζ電位変化測定で時間経過による小胞安定性を評価（追加ファイル1: 図S2）。実験全体でサイズとζ電位の有意な変化は観察されず、したがって全調製物は4°C保存で少なくとも3ヶ月安定。

さらに、90%（v/v）ヒト血清存在下、37°Cで3時間保存での安定性も検討（追加ファイル1: 図S3）。

ヒト血清接触で、Tween 20小胞はサイズ増加示したが300 nm以下に留まる。サイズとPDI値は3時間実験全体で一定、懸濁小胞が実験全体で完全性を保ったことを示唆。

Span 20両サンプルもヒト血清接触でサイズ増加、特にpHLIPあり調製で顕著、PDI値は均質サイズ分布示唆（データ未掲載）。これは静電相互作用結果として血漿タンパク質がニオソーム表面に吸着したためだが、小胞破壊には至らない。この仮説は、血清接触後のζ電位低下で支持される。この現象はζ電位が中性付近のわずかに負の値に達すると発生し、系が不安定になり小胞が凝集し始める。

Tween 20と同様、DMPC小胞も接触前サンプル比でサイズ増加示す。しかしこの変動は非有意で、サイズ値は280 nm以下（DMPC）または240 nm以下（DMPC+pHLIP）に維持。

pHLIPあり/なしで調製サンプルの放出能力を、小胞から時間経過とともに放出されるカルセイン（親水性プローブ）量で評価。

研究は37°C、24時間、精製サンプルをHEPESバッファまたはヒト血清に暴露して実施。図4に示すように、カルセイン放出プロファイルはHEPESバッファまたはヒト血清でTween 20とTween 20-pHLIPで非常に類似。

カルセイン放出プロファイル。NioTween20とNioTween20-pHLIPをHEPESバッファ（a）またはヒト血清（b）で接触

放出カルセイン量は30-50%の間で、pHLIPあり/なしサンプル間で放出能力に差なし。

SpanとDMPCサンプルでも同じ結果（データ未掲載）。

異なる刺激応答性ナノキャリア、例えば温度感受性キュボソームやポリマー自己組織化ナノキャリア（SANs）でも類似放出プロファイルが報告されています。

結論として、pHLIPあり/なしサンプルで観察されたミクロ粘度と流動性の物理化学的差異（表3）は、それらの放出能力に影響しない（図4）。DSPE-pHLIP分子挿入が主にヘッドグループ領域に影響するという証拠と一致。これらのデータは、中性および高pHでpHLIPが1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（POPC）製リポソーム表面に結合し、膜融合や漏出を誘導しないことを示した先行結果と合致。

結論

本研究はpHLIP装飾小胞の調製可能性を確認。サンプルは4°C保存で少なくとも3ヶ月、血清存在下でも安定。さらに、提案ナノベクターは親水性プローブを捕捉し、その放出を調節可能。

pHLIP小胞を完全に特性評価し、ナノキャリア特徴の基礎的理解を得て、酸性感受性ナノベクターの合理的設計を促進。

pHLIP結合は、共役DSPE C18鎖の疎水性相互作用によるナノベクター疎水領域への挿入で駆動される。pHLIPペプチドはアンカーされ、外側ヘッドグループ領域に位置し、酸性pHで標的膜と相互作用し、または低pH環境での二重層再配列後にナノベクター内容物を放出する準備状態にある。

これらの知見によれば、提案されたpHLIP装飾小胞は、腫瘍やその他の酸性疾患組織を標的とする生物活性物質の延長（修正）放出を得るのに有用である可能性があります。

略語

Chol:

コレステロール

Cryo-TEM:

クライオ透過型電子顕微鏡

DLS:

動的光散乱

DMPC:

1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン

DPH:

ジフェニルヘキサトリエン

pHLIP:

pH（低）挿入ペプチド

SAXS:

小角X線散乱

Span20:

ソルビタンモノラウレート

Tween20:

ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート