磁性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）ナノコンポジット：抗菌特性に及ぼす調製方法の影響

要約

磁性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（Fe ₃）の調製で最も困難な作業 O ₄ -PNIPAAm）バイオアプリケーション用のナノコンポジットは、反応性と安定性を最大化することです。乳化重合、その場での沈殿、および物理的添加を使用して、Fe ₃を生成しました。 O ₄ -PNIPAAm-1、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2およびFe ₃ O ₄ -それぞれPNIPAAm-3。それらの特性は、走査型電子顕微鏡（形態学）、ゼータ電位（表面電荷）、熱重量分析（安定性）、振動試料型磁力計（磁化）、および動的光散乱を使用して特徴づけられました。さらに、グラム陰性菌 Escherichia coli に対する各ナノコンポジットの抗菌効果を調査しました。およびグラム陽性の黄色ブドウ球菌 。両方のFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2ナノコンポジットは、高い熱安定性、ゼータ電位、および磁化値を示し、安定したコロイド系を示唆しています。全体として、Fe ₃の存在 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、低濃度でも、両方の Eに重大な損傷を引き起こしました。コリ および S。アウレウス DNAと細胞生存率の低下につながった。 Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1は、Fe ₃よりも両方の細菌株に対して強い抗菌効果を示しました。 O ₄ -PNIPAAm-2およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3。 黄色ブドウ球菌 Eよりも敏感でした。コリ 3つすべての磁性PNIPAAmナノコンポジットに。

背景

磁性熱応答性ポリマーナノコンポジットは、水処理やナノメディシンなど、幅広い用途に使用されてきました[1,2,3,4]。各ナノコンポジットは、両方のコンポーネントに固有の機能、つまり磁性粒子と温度応答性ポリマーの組み合わせから利益を得るように特別に設計されているため、より特異的で制御可能なナノコンポジットが作成されます。マグネタイト（Fe ₃ O ₄ ）ナノ粒子は、外部磁場の適用後の迅速かつ容易な分離を可能にする磁気特性を付与します[5]。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAAm）は、3次元ヒドロゲルを形成します。このヒドロゲルは、水和状態が膨潤した単一コイルから、 32°Cを超える水。磁性ナノ粒子をPNIPAAm層でキャッピングすると、水中でコロイドの安定性が得られるだけでなく、薬物、タンパク質、酵素などの他の分子と結合することで表面の機能が可能になります[7]。二重応答性ナノコンポジットの構築は、温度と磁性の組み合わせに同時に応答する2つの特性を組み合わせることによって実現されます。 Fe ₃の合成に使用される最も一般的な方法 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、物理的添加、その場での沈殿、および乳化重合です。最も簡単な方法である物理的添加には、以前に合成された磁性ナノ粒子とPNIPAAm粒子の物理的混合が必要です。 2番目の方法であるinsitu沈殿では、PNIPAAmナノポリマーの存在下で磁性ナノ粒子を沈殿させます[8]。 3番目の（そして最も一般的な）経路である乳化重合では、磁性ナノ粒子の存在下で（N-イソプロピルアクリルアミド）モノマーを重合する必要があります[9、10、11]。 Fe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、生物医学およびバイオテクノロジーのアプリケーションで広く使用されています。将来の用途へのそのようなナノコンポジットの適合性を高めるためには、非常に安定した、制御され、十分に分散された磁性ナノ粒子が必要となるでしょう。最近の革新の1つは、自己発熱粒子の局所的な熱源を作り出す外部磁場を含み、PNIPAAmを収縮させ、カプセル化された薬物の放出を可能にします[12]。この現象は、腫瘍を標的とした磁気ビーズと相まって、温熱療法などの他の潜在的な癌治療を開きます。温熱療法は、キロヘルツからメガヘルツの範囲の周波数で振動磁場内でナノ粒子を振動させることによって開始することができます。その他のFe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、ミオグロビンやビタミンB12などの生体活性分子の放出を制御するため、およびドラッグデリバリーのために最近合成されました[13]。 PNIPAAmでコーティングされた超常磁性Fe ₃を使用した最近の研究 O ₄ ナノ粒子は、酸化鉄ナノ粒子の熱的に誘発された凝集が磁気共鳴画像法の間にT2コントラストを大幅に増加させることを示すことができました[14]。明らかに、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAmは、生物医学およびバイオテクノロジーの両方のアプリケーションにおける将来の開発に大きな期待を示しています。したがって、この材料の生体適合性とその抗菌効果についてさらに研究を行うことが重要です。

この研究では、Fe ₃の物理化学的特性に対する3つの調製方法の影響を調査しました。 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット。そうすることで、生物学的用途のために強化された特性を示すナノコンポジットを製造するための最も便利な調製方法を評価することを目指しています。初めて、3つのFe ₃の抗菌効果についても説明します。 O ₄ -マルチエンドポイントアプローチ、細菌増殖速度、生存率、細胞形態、およびDNA損傷のレベルを使用したPNIPAAmナノコンポジット。

メソッド

化学薬品

塩化鉄（III）六水和物（FeCl ₃ .6H ₂ O、≥98％）、塩化鉄（II）四水和物（FeCl ₂ .4H ₂ O、≥99％）、水酸化アンモニウム（26％NH ₃ H ₂で O）、N-イソプロピル-アクリルアミド（NiPAM、≥99％）、N、N-メチレンビス（アクリルアミド）（BIS、≥99％）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、≥99％）および過硫酸アンモニウム（APS、≥98.5）％）はすべて、ドイツのSigma-Aldrichから新たに購入しました。

乳化重合によるPNIPAAmの調製

NiPAM（4 g）、BIS（0.2 g）、およびSDS（0.3 g）を、大気中の窒素下、70°Cで350 mlの脱イオン水（DI）に溶解しました。 APS（0.0035 g）を1 mlのDIに溶解し、反応容器に加えて反応を開始しました。 4時間後、反応を停止し、調製した粒子を脱イオン水で洗浄しました。最後に、PNIPAAmナノ粒子を遠心分離（12,000 rpmで30分間）によって分離し、さらなる反応に使用しました。

マグネタイトの調製（Fe ₃ O ₄ ）ナノ粒子

FeCl ₂ ・4H ₂ O（1.9 g）およびFeCl ₃ ・6H ₂ O（5.4 g）（モル比1：2）をDI（100 ml）に溶解し、70°Cに加熱しました。水酸化アンモニウム（NH ₄ ああ; 6 ml）を溶液にすばやく加えると、すぐに濃い黒色の磁性沈殿物が生成されました。最後に、Fe ₃ O ₄ ナノ粒子懸濁液を70°Cで30分間撹拌しました。生成物をDIで数回洗浄した後、Fe ₃ O ₄ ナノ粒子をロータリーエバポレーター（40°Cで25 mbar）で、微粉末が形成されるまで乾燥させました。これは、以降のすべての反応で使用されました。

乳化重合（Fe ₃）による磁性PNIPAAmナノコンポジットの調製 O ₄ -PNIPAAm-1）

NiPAM（0.4 g）、作りたてのFe ₃ O ₄ ナノ粒子（0.2 g）、BIS（0.2 g）、SDS（0.3 g）を350 mlのDIに溶解し、窒素雰囲気下で70°Cに加熱しました。次に、APS（0.0035 g）を1 mlのDIに溶解し、反応容器に加えて反応を開始しました。 4時間後、反応を停止し、調製したナノコンポジットをDIで洗浄しました。最後に、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1を遠心分離（12,000 rpmで30分間）によって分離し、ロータリーエバポレーター（40°Cで25 mbar）を使用して乾燥させました。粉末状の材料は、室温で暗所に保管されました。

In Situ沈殿による磁性PNIPAAmナノコンポジットの調製（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2）

FeCl ₂ （0.148 g）、FeCl ₃ （0.4 g）と10 mlのDIをよく混合し、1gのPNIPAAmに加えました。 NH ₄ 次に、OH（3 ml）を溶液にすばやく加えると、すぐに濃い黒色の磁性沈殿物が生成されました。次に、懸濁液を70℃で30分間撹拌しました。調製したナノコンポジットをDIで洗浄した後、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2を遠心分離（12,000 rpmで30分間）によって分離し、ロータリーエバポレーター（40°Cで25 mbar）を使用して乾燥させました。得られた粉末を暗所で室温で保存した。

物理的添加による磁性PNIPAAmナノコンポジットの調製（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3）

作りたてのPNIPAAm（1 g）、作りたてのFe ₃ O ₄ ナノ粒子（0.5 g）とDI（5 ml）を十分に混合し、得られた懸濁液を70°Cで30分間撹拌しました。このように調製されたナノコンポジットをDIで洗浄し、続いてFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3を遠心分離（12,000 rpmで30分間）によって分離し、ロータリーエバポレーター（40°Cで25 mbar）を使用して乾燥させました。粉末状の材料は、室温で暗所に保管されました。

ナノコンポジットの特性評価

Fe ₃のサイズとゼータ電位 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、ナノ粒子がDIに完全に溶解した後に測定されました（DIに分散した後、室温で2分間超音波処理します）。ゼータ電位測定は、pH 7でZetasizer Nanoアナライザー（Malvern Instruments、USA）を使用して実行されました。ZetasizerNano動的光散乱（DLS）ユニットを使用して、DI内の粒子凝集体の流体力学的直径を測定しました。コーティングの量を定量化し、ナノコンポジットの熱安定性を決定するために、熱重量分析（TGA）が行われました。熱研究は、窒素雰囲気（加熱速度10°C /分）下でTGA Q500（TA Instruments、USA）を使用して、25〜900°Cの範囲の温度で3〜4mgの乾燥サンプルで実施されました。材料の磁気特性は、MicroMag™2900振動試料型磁力計（Princeton Measurements Corporation、米国）を使用して測定されました。顕微鏡画像は、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して取得し、粒子を最初にDIに完全に溶解し、Schottkyカソードを備えたZeiss ULTRAPlus電界放出SEMの銅グリッド上に溶液を滴下しました。すべての画像は、1.5kVで動作するイメージング用にSmartSEMソフトウェアv5.05（Zeiss、ドイツ）を使用して分析されました。

菌株と培地

グラム陰性菌 Escherichia coli CCM3954およびグラム陽性黄色ブドウ球菌 CCM 3953（ブルノ、チェコ共和国）をすべての実験に使用しました。菌株の詳細については、「Czech Collection of Microorganisms」（http://www.sci.muni.cz/ccm/）のWebページを参照してください。生物学的実験を行う前に、各細菌培養物を新たに調製し、大豆栄養ブロス（Sigma-Aldrich）で一晩保持しました。

DNA損傷

コメットアッセイは、Singhらの方法論に従って実施されました。 [15]およびSolankyetal。 [16]。特に記載がない限り、すべての化学物質はPENTA（チェコ共和国）から購入しました。新鮮な細菌培養（10 ⁷ に調整）細胞/ ml）を一晩増殖させた後、2つの濃度（0.1および1 g / l）のPNIPAAmおよび各Fe ₃とインキュベートしました。 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットを37°Cで30分間

スライドのつや消し面に100mlのアガロースを置き、24×50 mmのカバーガラス（ThermoFisher Scientific、USA）で覆うことにより、ミクロゲルを調製しました。スライドを室温で5分間放置した後、カバーグラスを取り外し、スライドを乾燥させました。この乾燥したアガロース層（最初の層）は、後続の層にしっかりとした基盤を提供しました。バクテリアをPNIPAAmとFe ₃にさらした後 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットを30分間、2μl（約10,000個の露出細胞を含む）を取り、100μlの新たに調製した0.5％アガロースと混合しました。この混合物をすりガラスにピペットで移し、すぐにカバーガラス（第2層）で覆った。次に、スライドを氷上でスチールトレイ内で冷却した。 1分後にカバーガラスを取り外し、100μlの溶解アガロース（5μg/ mlRNAse A [Ameresco、USA]を含む0.5％アガロース、0.25％ナトリウムN-ラウロイルサルコシンおよび0.5 mg / mlリゾチームを含む）の第3層を取り外しました。再びカバーガラスを使用して製造されました。次に、スライドを氷上に10分間放置した後、37°Cで30分間湿度の高いチャンバーに入れました。カバーガラスを取り外した後、スライドを2.5 MのNaCl、100 mMのEDTA四ナトリウム塩、10mMのpH10のトリス緩衝液、1％のラウロイルサルコシンナトリウムおよび1％のトリトンX-100を含む溶解溶液に浸しました。室温で1時間溶解した後、スライドを2.5 MのNaCl、10 mMのEDTA、10mMのトリスpH7を含む酵素消化溶液に移しました。1mg/ mlのプロテイナーゼKを含む4つのバッファー。 37°Cで2時間インキュベートした後、電気泳動ユニット（Scie-plas、UK）の水平スラブに置き、300mMの酢酸ナトリウムと100mMのpH9トリス緩衝液で20分間平衡化した後、 12 V（0.4 V / cm、約100 mA）で30分間。電気泳動後、スライドをエタノール中の1 M酢酸アンモニウム（5mlの10M酢酸アンモニウムと45mlの無水エタノール）に20分間、無水エタノールに0.5時間、70％エタノールに10分間浸し、その後スライドを浸しました。室温で風乾した。均一な染色を実現するために、スライドを5％TEバッファーと10mMのNaH ₂の新たに調製した溶液50mlで前処理しました。 PO ₄ 。次に、スライドを、TEバッファー中のSYBR染色液（Sigma-Aldrich、USA）の新たに調製した1mM溶液50μlで30分間染色しました。 DNA鎖切断（彗星）の移動は、倍率400倍のAxioImager蛍光顕微鏡とAxioVision v 4ソフトウェア（Zeiss、ドイツ）を使用して視覚化されました。通常、50個の彗星の尾の長さはサンプルごとに個別に測定されました。

細菌の増殖速度、細胞の生存率、形態

実験プロトコルは、ダーウィッシュらに記載されたものに従った。 [17]。簡単に言うと、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットストック懸濁液（10 g / l）を新鮮な細菌培養に添加して、最終濃度を0.01、0.05、0.5、1 g / lにしました。各濃度は、24ウェルプレートで3回生成されました。増殖培地およびFe ₃のみの細菌細胞からなるネガティブコントロール O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、増殖培地のみで、並行して実行されました。次に、プレートを37°Cでインキュベートした後、Synergy™HTXプレートリーダー（Biotek、USA）を使用して、サンプルの光学密度を600 nm（OD600）で2時間ごとに6時間測定しました。細菌の増殖速度は、OD600測定値（吸光度単位、AU）とインキュベーション時間（時間）のR線形回帰として定義されました。細胞を含まないナノコンポジットサンプルの予備測定（600 nmで6時間）では、細菌細胞で測定されたナノコンポジットの吸光度値に干渉しない一定の吸光度値が示されました。

細菌増殖速度（ µ ）に対する10％阻害（EC10）でのナノコンポジットの有効濃度）Fe ₃の各フォームについて計算されました O ₄ -方程式に基づくPNIPAAm： I （％）=（ µ _C − µ _T ）/ µ _C ×100、ここで I 抑制です、 µ _C は平均コントロール成長率の値であり、 µ _T は、ナノコンポジットの影響を受ける培養物の成長速度です[18]。

24時間のインキュベーション後、L7007 Bacterial Viability Kit（Molecular Probes、Invitrogen、USA）を使用して、各サンプルの100μlアリコートを暗所で15分間染色しました。 Synergy™HTXプレートリーダー（Biotek、USA）を使用して、生細胞（Ex / Em 485/528 nm）と死細胞（Ex / Em 485/645 nm）の比率を決定しました。死細胞のパーセンテージは、生細胞に対する死細胞の比率として計算された。同時に、 Eの画像。コリ および S。アウレウス Ex / Em 470 / 490–700 nmのAxioImager蛍光顕微鏡（Zeiss、ドイツ）を使用して取得しました。 Eの長さ。コリ Sのセルと面積。アウレウス 細胞クラスターは、AxioVision v 4ソフトウェア（Zeiss、ドイツ）を使用して倍率600倍で決定されました。

統計分析

PNIPAAmで培養された細菌株間の違い、異なるFe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットおよびナノコンポジットを含まないコントロールサンプルは、ANOVAおよびダネットの検定（GraphPad PRISM、米国）を使用してテストされました。

結果

この研究では、Fe ₃を合成しました O ₄ -3つの異なるプロトコルを採用したPNIPAAmナノコンポジット：乳化重合（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1）、その場での降水量（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2）および物理的加算（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3）。 SEMイメージングは、使用されたプロトコルのタイプが、Fe ₃を使用して、サンプルの形態と粒子サイズに明確な影響を与えることを示しました。 O ₄ -PNIPAAm-1、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3は、広いサイズ分布、ナノ粒子間の高い表面エネルギーによる凝集、および磁気双極子相互作用の存在を示しています（図1 ）。

TGAは、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAmサンプルは、400°Cを超える温度で比較的安定しました（図2）。全体として、PNIPAAmナノ粒子はFe ₃よりも低い残留含有量を示しました O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット。表面電荷のゼータ電位値は、PNIPAAmでは-1.58 mV、Fe ₃では-15.6mVでした。 O ₄ -PNIPAAm-1、− 16.4 mV（Fe ₃の場合） O ₄ -PNIPAAm-2および− 1.8 mV（Fe ₃の場合） O ₄ -PNIPAAm-3。磁化飽和の振動試料型磁力計の値は、Fe ₃で50.4emu / gでした。 O ₄ -PNIPAAm-1、Fe ₃の場合は53.7emu / g O ₄ -PNIPAAm-2および21.0emu / g（Fe ₃の場合） O ₄ -PNIPAAm-3。 LCSTの上（45°C）および下（25°C）での動的光散乱は、PNIPAAmの流体力学的サイズが25°Cで50 nm、45°Cで27nmであることを示しました。 Fe ₃の場合、25°Cで412 nm、45°Cで197 nm O ₄ -PNIPAAm-1; Fe ₃の場合、25°Cで212 nm、45°Cで130 nm O ₄ -PNIPAAm-2および122nm（25°C）および60 nm（45°C）（Fe ₃の場合） O ₄ -PNIPAAm-3（図3）。

Fe ₃ O ₄ -細菌のDNAに対するPNIPAAmナノコンポジットの効果

30分間の短時間の曝露の後、両方の EについてDNA鎖切断が決定されました。コリ および S。アウレウス Fe ₃で処理された細胞内 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット、40％EtOH（ポジティブコントロール）および未処理細胞（ネガティブコントロール）。すべてのFe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、同様に有意な効果を示しました（ P <0.001）平均 E。コリ および S。アウレウス ナノコンポジットなしで培養された対照細胞と比較した、すべての濃度での彗星の尾の長さ（図4）。

Fe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット抗菌効果

成長率は、グラム陽性 Sを示した。アウレウス グラム陰性 Eよりも耐性が低かった。コリ 6時間の曝露後にすべてのナノコンポジットに。 Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2は、PNIPAAmおよびFe ₃と比較して、両方とも細菌の増殖を強力に阻害しました。 O ₄ -PNIPAAm-3、 E付き。コリ 成長率は0.08から0.028に大幅に減少しました（ P <0.001）Fe ₃を使用 O ₄ -PNIPAAm-2および0.005（ P <0.001）Fe ₃を使用 O ₄ -PNIPAAm-1（1 g / l）。 Eへの影響は観察されなかった。コリ PNIPAAmまたはFe ₃による成長率 O ₄ -PNIPAAm-3（図5a）。比較すると、 Sの成長率。アウレウス すべてのFe ₃の影響を受けました O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットおよびPNIPAAmナノ粒子による。低濃度（0.01 g / lおよび0.05g / l）では、成長率は0.07から0.06（ P ）にわずかに低下しました。 <0.05）。ただし、高濃度（0.5および1 g / l）では、PNIPAAmでは0.07から0.001に、Fe ₃では0.0に大幅に減少しました。 O ₄ -PNIPAAm-1、0.01、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2および0.009とFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3（すべて P <0.001;図5b）。さらに、すべてのFe ₃のEC10 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットおよびPNIPAAmナノ粒子制御は Sの方が低かった。アウレウス Eの場合よりも。コリ （表1）。

<図>

死んだ Eのパーセンテージ。コリ 細胞はFe ₃の濃度の増加とともに増加しました O ₄ -24時間後のPNIPAAmナノコンポジット。たとえば、PNIPAAm（0.5および1 g / l）は、 Eの大幅な増加を引き起こしました。コリ Fe ₃を含まない培養物と比較した死細胞（20％） O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット（12％）。 Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1（0.5 g / l）は、死んだ Eの最大28％をもたらしました。コリ 細胞と1g / lで32％（ P <0.001）。 Fe ₃の効果 O ₄ -PNIPAAm-2はFe ₃よりも低かった O ₄ -PNIPAAm-1およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3、0.01および1 g / lの濃度にさらされた場合、死んだ細胞の割合がそれぞれ13％から25％に増加します（ P <0.001）。 0.5と1g / lの両方で、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3は約25％の死細胞をもたらしました（ P <0.001;図6a）。死んだ Sのパーセンテージ。アウレウス 細胞は1g / l Fe ₃によってのみ有意に影響を受けました O ₄ -PNIPAAm-1およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3、死んだ細胞はそれぞれ最大50％と48％に達します（ P <0.001）。ナノコンポジットを含まないコントロールには、死細胞の約18％が含まれていましたが、PNIPAAm、Fe ₃の濃度は低くなっています。 O ₄ -PNIPAAm-1およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3、死んだ細胞の割合はさらに低かった。 0.5および1g / lの濃度のPNIPAAmは、25および30％（ P <0.005）それぞれ死細胞。 Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2は Sに影響を与えませんでした。アウレウス 文化（図6b）。

平均 Eに差はありませんでした。コリ セルの長さ（5μm）と平均 S。アウレウス セルクラスター領域（200μm² ）最低濃度（0.1 g / l;図7）でのナノコンポジットまたはPNIPAAmコントロールの場合。より高い濃度では、 E。コリ Fe ₃の存在下で長さは変化しませんでした O ₄ -PNIPAAm-2、 Sもしませんでした。アウレウス Fe ₃の存在下でのセルグループ領域 O ₄ -PNIPAAm-1。ただし、 E。コリ 1 g / lのPNIPAAm（5.4μm、 P ）の存在下では、長さが大幅に増加しました。 <0.005）、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1（6μm、 P <0.001）およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3（10μm、 P <0.001）（図7a）、 S。アウレウス PNIPAAm（1937μm² ）にさらされると、より大きなクラスターを形成しました、 P <0.001）、Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-2（924μm² 、 P <0.001）およびFe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3（1722μm² 、 P <0.001）（図7b）。

ディスカッション

合成方法と磁性ナノ粒子をポリマーマトリックスに添加する手段の両方が、磁性Fe ₃の固有の物理化学的特性に明らかな影響を及ぼしました。 O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット。段階的合成はナノコンポジットの特性に強い影響を及ぼし、その結果、粒子の形状、サイズ分布、サイズ、表面の化学的性質が変化し、その後磁気特性も変化しました[19、20]。乳化重合（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1）は、簡単で正確な方法であり、粒子サイズ分布が狭く、凝集傾向が最も低い安定したナノコンポジットを生成しました。この品質は、生物医学アプリケーションで特に重要です[17]。立体的およびクーロン的反発の両方の結果として生成された粒子の寸法は、沈殿を回避するのに十分に小さかった[21]。最も効果の低い方法は、物理的な加算（Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-3）。 3つの異なるステップで製造されたため、準備に時間がかかっただけでなく、得られたナノコンポジットは、他の2つの製造方法のいずれよりも高い凝集を示しました。さらに、我々の結果は、Fe ₃ O ₄ -この方法で製造されたPNIPAAm-3には、望ましくないPNIPAAmとFe ₃が含まれている可能性があります。 O ₄ ナノ粒子の残留物。

ポリマーは、物理的（非共有）結合または共有結合のいずれかによって磁性ナノ粒子に付着する可能性があり、得られたハイブリッド材料は、採用された合成経路に応じて特定の特性を示します。ハイブリッドナノ粒子の形成が起こる溶媒中で調製が進むと、磁性ナノ粒子の有意な再懸濁が起こり、凝集と分離が問題になる可能性があります。この場合、多くの場合、磁性ナノ粒子のその場での形成がより良い代替手段となる可能性があります。さらに、界面活性剤の濃度が低すぎると、合体によって液滴のサイズが変化しますが、濃度が高すぎるとミセルが形成され、ミセルの核形成につながります。この点で、無機粒子表面がポリマーマトリックスと適合性を確保するために、表面特性と粒子修飾の程度の正確な特性に基づいて界面活性剤濃度を慎重に選択することが重要です。

Fe ₃の磁気特性を評価するために O ₄ -PNIPAAmナノコンポジット、ナノコンポジット内のMNPの含有量を知ることは重要です。 TGAを使用して、MNPの量を定量化し、Fe ₃の熱安定性を調査しました。 O ₄ -PNIPAAmナノ粒子単独と比較したPNIPAAmナノコンポジット。 3つすべてのFe ₃ O ₄ -PNIPAAmナノコンポジットは、おそらくFe ₃の存在により、PNIPAAmナノ粒子よりも高い熱安定性を示しました。 O ₄ マトリックス内の粒子（図2）。磁性ナノコンポジットの残留物が多いのは、無機Fe ₃の存在が原因である可能性があります。 O ₄ 高温でも持続したサンプル中の化合物。

Fe ₃ O ₄ -PNIPAAm-1は、最高の熱ナノコンポジット安定性と、最小の重量損失を示しました。 200°Cまでの体重減少の主な原因は、水分の損失とポリマー層の物理吸着によるものでした[22]。ただし、200°Cを超えると、損失は主にPNIPAAmを結合している化学層の分解によるものでした。 400°C以上で安定したサンプル残留物は、元の重量の87％に相当し、これはナノコンポジット内の磁性ナノ粒子の量に相当します。 One aim of this preparation process was to produce a nanocomposite with magnetic properties preventing aggregation and enabling it to re-disperse rapidly as soon as the magnetic field is turned off. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ O ₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ O ₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ O ₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ O ₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E.コリ growth rate in the order Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S.アウレウス growth rate as Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

<図>

In comparison with the modified Fe₃ O ₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E.コリ and S.アウレウス , with S.アウレウス EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ O ₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S.アウレウス was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E.コリ and S.アウレウス corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E.コリ cell length caused by Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 for S.アウレウス clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E.コリ cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S.アウレウス , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S.アウレウス biofilm was produced when in contact with Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S.アウレウス usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E.コリ and S.アウレウス DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ O ₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ O ₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E.コリ and S.アウレウス DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ O ₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E.コリ and Gram-positive S.アウレウス 。