化学光熱癌治療のための近赤外光トリガー温度応答性ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）-ピロールナノコンポジット

はじめに

ドラッグデリバリーシステム（DDS）は、がん治療における治療効果を達成するために医薬化合物を投与する強力な方法の1つです[1]。 DDSの目標は、活性薬剤を送達して目的の領域に蓄積することですが、従来のDDSは、多くの場合、重篤な副作用と非効率的な治療効果を伴います[2、3]。これらの障害を克服するために、温度、光、pH、電場、酸化還元、酵素活性、抗原濃度などの特定の内部または外部刺激に応答する能力を持つさまざまなナノキャリアが、高度なDDSおよび持続的かつ制御された薬物放出を誘発するために使用されます[4,5,6]。

さまざまな刺激の1つである温度応答性ナノキャリアは、特定の温度で薬物がナノ粒子に放出される可能性があるため、がん治療を改善するための強力なアプローチです[7]。さらに、感熱性ナノ粒子の利点を他の刺激と組み合わせて、完全な癌の根絶を誘導することができます[8、9]。温度応答性ナノ粒子として、poly（ N -イソプロピルアクリルアミド）（PNIPAM）は、約32°Cの低い臨界溶液温度（LCST）で相転移を示すため、最も注目されています[10、11]。 LCSTの下では、PNIPAMのポリマーネットワーク全体が水素結合のために膨潤した状態で存在します。一方、PNIPAMは疎水性状態に移行し、水素結合が減少するため、LCSTより上のポリマーネットワークが崩壊します[12、13]。他のナノ粒子と比較して、PNIPAMベースのナノキャリアには、高い薬物カプセル化効率、制御された薬物放出能力、および優れた生体適合性という利点があります[14]。ただし、体温での自発的な薬物放出のため、PNIPAMベースのナノキャリアは高度なDDSで使用するには十分ではありません。これを克服するために、以前の研究では、PNIPAMの合成プロセスで有機酸（ビニル酢酸、アクリル酸、アリル酢酸など）を追加し、継続的な薬物放出による副作用を軽減しました[15]。

最近、多くの研究が、2つ以上の刺激の統合が癌治療効果を高めるためにナノ粒子を誘発するという新しい治療アプローチに焦点を合わせています[16、17、18]。たとえば、光熱療法（PTT）は、腫瘍の正確な光制御、非侵襲的浸透、正常細胞への低毒性など、いくつかの利点を示します[19、20]。ナノ粒子をPTTと組み合わせるには、光熱剤（金ナノロッド、カーボンナノチューブ、ポリピロール（ppy）、酸化グラフェンなど）をPNIPAMベースのナノ粒子に均一にカプセル化する必要があります[21、22、23]。以前の研究では、熱およびpH応答性のPNIPAMシェルを備えたメソポーラスシリカコーティングされた金ナノロッドを製造し、invivoでの癌治療への応用をさらに検討しました[24]。ただし、これらのPNIPAMベースのナノコンポジットには、多段階の合成プロセスが必要です。さらに、ナノコンポジットには特定の癌細胞に対する標的部分がなかったため、他の臓器や正常組織に深刻な副作用を引き起こす可能性があります。以前のレポートでは、PNIPAMの熱およびpHに敏感な特性を使用して双方向制御放出システムを開発しました[15]。 PNIPAMナノゲルは、LCSTを効率的に制御するために、アクリル酸（AAc）含有量と共重合されました。癌の標的化と治療効果をより高めるために、化学療法と光熱効果を使用した癌標的化併用療法を開発しました（スキーム1）。 NIRレーザー照射によって温度が上昇すると、熱応答性PNIPAMナノコンポジットからの薬物が放出され、その後、光熱効果が活性化されました。共役葉酸（FA）により、PNIPAMベースのナノコンポジットはMDA-MB-231乳がん細胞に対して大幅に強化された治療効果を示しました。

a の概略図 NIR光と魔法瓶でトリガーされるDox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットと b の合成 乳がん細胞における化学療法と光熱の併用療法の強化への応用

材料と方法

資料

NIPAM、 N、N '-メチレンビスアクリルアミド（MBA）、過硫酸カリウム（KPS、99％）、N-（3-ジメチルアミノプロピル）- N '-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）および N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。ポリビニルピロリドン（PVP）とピロール（98％）は、Alfa Aesar（Ward Hill、MA、USA）から入手しました。 AAcはDaeJung Chemicals＆Materialsから購入しました。 Co. Ltd（韓国）。 FA-PEG-アミン（FA-PEG-NH ₂ 、MW：5 kDa）は、Nanocs、Inc。（ニューヨーク、ニューヨーク、米国）から提供されました。ドキソルビシン塩酸塩（Dox）は東京化成工業から入手した。株式会社（東京、日本）。すべての化学薬品と材料は、さらに精製することなく商業的に使用されました。

ppyで装飾されたPNIPAM-AAcナノ粒子の合成

AAcナノ粒子と共重合した温度応答性PNIPAMは、以前の報告[15]に従って合成されました。 1.13 gのNIPAMモノマー、0.077 gのMBA、および0.136gのAAcを100mLの脱イオン水に溶解し、250mLの3つ口丸底フラスコに加えました。 30分後、反応温度を80°Cに上げ、1時間激しく攪拌しました。重合を誘発するために、KPS（1.5 mg）を混合物に添加し、続いて4時間撹拌しました。混合物を脱イオン水中の分子量カットオフ（MWCO）12〜14 kDa透析膜に対して7日間透析し、未反応のモノマー、開始剤、ディスペンサブルイオンを除去し、48時間凍結乾燥してPNIPAM-AAcナノ粒子を得ました。光熱効果を機能化するために、ppyはPNIPAM-AAcナノ粒子に装飾されました[25]。 PVP（50および100 mg）およびピロールモノマー（50および100μL）を10 mg / mLのPNIPAM-AAc溶液に急速に添加し、室温で12時間撹拌しました。次に、KPS（3.4 mg）をPNIPAM-AAc溶液に挿入し、さらに14時間撹拌しました。ピー装飾されたPNIPAM-AAcを蒸留水で3回遠心分離しました。 PNIPAM-ppy-5およびPNIPAM-ppy-10は、48時間の凍結乾燥によって得られました。

癌を標的としたPNIPAM-ppyナノコンポジットの合成

がんを標的としたPNIPAM-ppyナノコンポジット（PNIPAM-ppy-FA）を得るために、10 mgのPNIPAM-ppyをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10 mL、pH 5.5）に溶解し、5分間超音波処理しました。 EDC（15 mg、0.078 mmol）とNHS（15 mg、0.13 mmol）をPNIPAM-ppy溶液に加えました。 1時間後、FA-PEG-NH ₂ （5 mg）を加え、さらに一晩攪拌しました。未反応のFA-PEG-NH ₂ 、PNIPAM-ppy溶液中のEDCとNHSを透析膜（MWCO 6〜8 kDa）で除去し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを48時間凍結乾燥しました。

抗がん剤をロードしたPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの合成

10 mgのPNIPAM-ppy-FAを脱イオン水に溶解し、5分間超音波処理しました。 0.5 mg / mL DoxをPNIPAM-ppy-FA溶液に滴下し、室温で激しく攪拌しました。ロードされていないDoxを遠心分離（14,000 rpm、10分）で除去し、脱イオン水で精製しました。 DoxをロードしたPNIPAM-ppy-FA（Dox @ PNIPAM-ppy-FA）は、48時間の凍結乾燥によって得られました。

NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの特性評価

透過型電子顕微鏡法（TEM、JEOL-2100F、JEOL、日本）を使用して、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのサイズ、形態、および分布を特徴付けました。 TEM測定では、サンプル溶液を脱イオン水（濃度：1 g / L）に、カーボンでコーティングされた200メッシュの銅グリッド上に滴下してサンプルを準備しました。 Zetasizer Nano Z（Malvern Instruments、UK）を使用して、脱イオン水に溶解し、5分間超音波処理したPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのサイズ分布と表面電荷を測定しました。 PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの表面修飾と化学結合は、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）によって確認されました。 FT-IRスペクトルは、Nicolet iS50装置（Thermo Fisher Scientific、Inc.、USA）を使用して、400〜4000 cm ^-1 の範囲でKBrペレットに記録されました。 4 cm ^-1 の解像度で 。 PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光学特性とDox負荷容量は、UV-Vis分光法（UV 1800、島津、日本）によって観察されました。

NIRおよび熱応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性と光安定性

DoxをロードしたPNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（Dox @ PNIPAM-ppy-FA）の光熱特性は、温度変化をリアルタイムで検出することによって評価されました。 Dox @ PNIPAM-ppy-FAは、0.05、0.1、0.2 mg / mLのさまざまな濃度の水溶液に溶解し、808 nm NIRレーザー（MDL-N-808、CNIOptoelectronicsTech。Co。 Ltd.、中国）2 W / cm ² の電力密度で 。 NIRレーザー出力密度の影響は、出力密度1、2、および3 W / cm ² でNIRレーザーを20分間照射することによって調査されました。 、 それぞれ。さらに、NIRレーザーに対する光熱安定性を調査するために、Dox @ PNIPAM-ppy-FA溶液（0.1 mg / mL）を15分間露光し、自然冷却プロセスを5回繰り返しました。 NIRレーザー照射中、Dox @ PNIPAM-ppy-FA溶液の温度は、デジタル温度計（DTM-318、Tecpel Co.、台湾）に接続された熱電対によって60秒ごとに15分間測定されました。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのNIRおよび温度応答性薬物の放出

熱応答によるDoxの放出プロファイルを調べるために、Dox @ PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg / mL）を5 mLバイアルに調製し、25、37、50°Cで攪拌しました。定義された放出時間（0〜72時間）で、各サンプルの上清を遠心分離によって収集し、等量の新鮮な培地と交換しました。 PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットから放出されるDoxの量は、480nmでのUV-Vis分光法の測定によって推定されました。さらに、NIRレーザー刺激に応答したDox @ PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg / mL）を介したDox放出挙動を、37°C​​で激しく攪拌し、所定の時点（1、2、3）で10分間照射しました。 、4、および5時間）。対照として、NIRレーザー照射なしのDox @ PNIPAM-ppy-FA溶液を使用した。放出されたDoxは前述の方法で決定されました。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性分析

PNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAを含むPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性は、MTTアッセイを使用して検証されました。 A549およびMDA-MB-231細胞を96ウェルプレートに1×10 ⁴ の密度で播種しました。 10％FBSおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含む200 µLのRPMI 1640培地でウェルあたりの細胞数を測定し、5％CO ₂ の加湿雰囲気下で37°Cでインキュベートしました。 。 1日後、さまざまな濃度（20〜100 µL）の200 µLのPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを各細胞に処理し、プレートを24時間インキュベートしました。細胞をDPBSで洗浄した後、培地をMTT剤（0.5 mg / mL）を含む新鮮な培地と交換しました。さらに4時間インキュベートした後、培地を注意深く取り除き、200 µLのDMSOを各ウェルに加えて、内在化した紫色のホルマザン結晶を溶解しました。 iMark™マイクロプレートリーダー（Bio-rad、Hercules、CA、USA）を使用して、595nmで吸収を測定しました。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞取り込み分析

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの特定の癌細胞へのターゲティング能力を評価するために、A549およびMDA-MB-231細胞を2×10 ^{の密度で8ウェルプレート（ibidi、ミュンヘン、ドイツ）に播種しました。 4} 細胞/ mLで、24時間インキュベートしました。次に、細胞をPNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（60 µg / mL）とともに6時間インキュベートしました。続いて、細胞をDPBSで2回洗浄して残りのナノコンポジットを除去し、4％パラホルムアルデヒドで15分間固定しました。 0.1％Triton-Xを室温で15分間処理した後、細胞を最終的にAlexa Fluor 488ファロイジン（1：200、Invitrogen、USA）で4°Cおよび4,6-ジアミジノ-2-で1日間染色しました。フェニルインドール（DAPI、Thermo Fisher Scientific、米国）をそれぞれ10分間。細胞取り込み画像は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM、LSM 710、Carl Zeiss、ドイツ）を使用して観察されました。

NIRレーザー照射によるPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの強化された抗がん効果

乳がん細胞に対するNIRと熱応答性PNIPA-ppy-FAを使用した治療効果の向上をMTTアッセイで調べました。 MDA-MB-231（1×10 ⁴ 細胞/ mL）を96ウェルプレートに播種し、24時間インキュベートしました。次に、細胞をDPBSで洗浄し、PNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットをさまざまな濃度（20、40、60、80、および100μg/ mL）で各ウェルに濃度依存的に添加しました。 。一晩のインキュベーション後、培地を除去し、続いて新鮮な培地を添加した。 NIRレーザー照射グループでは、細胞を5 W / cm ² で処理しました。 5分間。次に、MDA-MB-231をDPBSで洗浄し、MTT溶液を含む新鮮な培地を添加しました。 4時間後、培地を注意深く取り除き、200μLのDMSOを各ウェルに加えました。最後に、595 nmでの吸光度をiMark™マイクロプレートリーダーで測定し、細胞の生存率を測定しました。癌の治療効果を観察するための別の方法として、生死アッセイを実施した。 PNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FA（60μg/ mL）をMDA-MB-231で処理しました。 24時間後、MDA-MB-231をNIRレーザー照射の有無にかかわらず露光しました（5 W / cm ² 、5分）、カルセインAMとエチジウムホモ二量量-1で染色しました。 30分後、細胞をDPBSで数回洗浄しました。生/死の画像は、倒立蛍光顕微鏡（Olympus Ix73、日本）を使用して取得しました。

結果と考察

NIRおよびサーモス応答性癌を標的としたPNIPAM-ppyナノコンポジットの合成と特性評価

温度応答性PNIPAMベースのナノコンポジットを生成するために、PNIPAM-AAcナノ粒子をラジカル重合法で製造しました[15]。 NIRレーザー照射を介してLCSTを制御するために、ppyを調製したままのPNIAPM-AAcでの重合反応で覆った。癌を標的としたPNIPAM-ppy-FAは、FA-PEG-NH ₂ を化学的に結合させることによって合成されました。 PNIPAM-AAcのカルボキシル基に。図1aのTEM画像によると、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、およびPNIPAM-ppy-FAの形態、サイズ、分散度が観察されました。調製したままのPNIPAM-AAcは、平均直径274.32±11.62nmの均質な形状を示しました。 ppyの装飾後、PNIPAM-ppyとPNIPAM-ppy-FAは、275.99±11.41と285.77±17.92nmの同様のサイズを示しました。 DoxをロードしたPNIPAM-ppy-FAのサイズは285.77±17.92から290.73±12.28nmにわずかに増加し、抗がん剤がPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットにロードされたことを示しています[26]。興味深いことに、PNIPAM-AAcと比較して、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット内のppyの存在は、小さな黒い斑点によって明確に示されました。さらに、PEG鎖により、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは凝集することなく水溶液によく分散しました[27]。 PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAの平均流体力学的直径は、DLS分析によって測定されました（追加ファイル1：図S1）。PNIPAM-AAc、PNIPAMの直径-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAは、それぞれ432、450.7、468.6、および486.7nmでした。分析方法が異なるため、各ナノコンポジットの直径はTEMの直径よりも大きかったが、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの粒子サイズと分布は同様の傾向を示した。

a PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのTEM画像。 b DLSによるDox @ PNIPAM-ppy-FAのLCST分析。 c さまざまな温度条件（25°C、37.5°C、および50°C）に応じたPNIPAM-AAcおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAの平均直径

重合したppyのPNIPAM-AAcへの影響を調べるために、PNIPAM-AAcとDox @ PNIPAM-ppy-FAのLCST値をさまざまな温度で測定しました（図1b）。以前の研究[15]と比較して、Dox @ PNIPAM-ppy-FAのLCSTは、PNIPAM-AAcのLCST（42°C）よりもわずかに低下しました。この違いは、重合したppyと結合した癌標的リガンドによるPNIPAM-AAcのカルボキシル基の減少が原因である可能性があります[28]。その後、図1cで温度に応じた粒子サイズの変化を監視しました。このため、PNIPAM-AAcとDox @ PNIPAM-ppy-FAの直径は、25〜50°Cの温度範囲で測定されました。温度が上昇すると、PNIPAM-AAcは436nmから177nmに減少しました。さらに、Dox @ PNIPAM-ppy-FAのサイズは630nmから420nmに大幅に縮小されました。これは、PNIPAMナノコンポジットで装飾されたppyが、制御された熱応答性DDSのアプリケーションに大きな影響を与えなかったことを示しています[27]。

PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAのゼータ電位値は、修飾前後のナノコンポジットの表面変化を示しました（図2a）。 PNIPAM-AAcのゼータ電位は、AAcのカルボキシル基のために-37.1±1.61mVでした[29]。 PNIPAM-ppyおよびPNIPAM-ppy-FAの値は-29.6±0.96および-15.6±0.26mVに増加し、正に帯電したポリピロールおよびFA-PEG-NH ₂ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットにうまく導入されました[27]。負に帯電したDoxにより、Dox @ PNIPAM-ppy-FAのゼータ電位はより負の電荷に変化しました（−28.6±0.23mV）。図2bに示すように、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、およびPNIPAM-ppy-FAの合成が成功したことは、FT-IR分光法によって確認されました。 PNIPAM-AAcのスペクトルは、C-NとCH ₂ の伸縮振動ピークを示しました。 1100〜1200 cm ^-1 C =O、N–H、COOHのピークは、1545、1645、1750 cm ^-1 で観察されました。 、PNIPAM-AAc [15]に属していました。 PNIPAM-ppyおよびPNIPAM-ppy-FAのポリピロールは、935および1050 cm ^-1 に追加のピークを示しました。 観察された[30]。 PNIPAM-ppy-FAのスペクトルでは、新しい振動ピークが1107および2880 cm ^-1 に現れました。 、これはPEGチェーンのC–O–Cに起因します。この結果は、FA-PEG-NH ₂ の化学的結合が成功したことを示しています。 [31]。ただし、FAのターゲティングリガンドは、その構造がPEGに類似しているため、FT-IRでは検出されませんでした。 PNIPAMナノコンポジットにFAが存在することを確認するために、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、およびPNIPAM-ppy-FAをUV-Vis分光法で実行しました（図2c）。 PNIPAM-AAcおよびPNIPAM-ppy（FAなし）のスペクトルは吸収ピークを示しませんでしたが、PNIPAM-ppy-FAは280 nmに追加のピークを示しました。これは、FAで特徴的でした[32]。この結果は、FA分子がPNIPAMベースのナノコンポジットにグラフトされていることを裏付けています。

a PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAのゼータ電位分析。 b PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、およびPNIPAM-ppy-FAのFT-IRスペクトル。 c PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAのUV-Visスペクトル

NIRレーザー照射によるPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性

PNIPAMベースのナノコンポジットを光熱治療に使用するために、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光学特性をUV-Vis分光法で調べました。図2cに示すように、PNIPAM-AAcはNIR領域（λ=700–1000 nm）で吸光度を示しませんでした。ただし、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、およびDox @ PNIPAM-ppy-FAのスペクトルは、重合されたppyナノ粒子により、明らかに同じ範囲で強い吸光度を示しました。これらの吸光度の結果は、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットがNIR光を熱に変換できることを示しています[26]。次に、近赤外レーザー照射により、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性を評価しました（図3）。光熱効果を最適化するために、PNIPAM-FA（ピロールなし）、PNIPAM-ppy-5-FA（ppy50μL）、およびPNIPAM-ppy-10-FA（ppy100μL）を同じ濃度（0.1 mg / mL）で調製しました。 ）次に、2 W / cm ² の密度で808nmのNIRレーザー照射にさらされました。 20分間（図3a）。 PNIPAM-ppy-10-FAの温度は14.5°Cに上昇しました。これはPNIPAM-ppy-5-FAの2倍でした。コントロールとして、ppyなしのPNIPAM-FAを照射しましたが、温度は無視できるほど上昇しました（2.4°C）。したがって、追加の光熱実験を調査するためにPNIPAM-ppy-10-FAを選択しました。濃度による温度変化を観察するために、NIRレーザーをさまざまな濃度（0.05、0.1、および0.2 mg / mL）でPNIPAM-ppy-FAに照射しました。図3bでは、濃度に応じて、温度がそれぞれ10、14.5、および18°Cに上昇しました。さらに、PNIPAM-ppy-FA溶液（0.1 mg / mL）にさまざまなレーザー出力密度（1〜3 W / cm ² ）を照射しました。 ）図3c。予想通り、ナノコンポジットの温度上昇はレーザー出力に大きく依存していました。続いて、図3dでPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱安定性を観察しました。 NIRレーザー照射は少なくとも5回繰り返し実行されましたが、温度は着実に33°Cに上昇し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが光熱療法として適切なナノキャリアであることを示しています。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱性能。 a 808 nm NIRレーザー照射（2 W / cm ² ）下でのDox @ PNIPAM-ppy-5-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-10-FAの温度分析 ）。 b 808 nm NIR照射（2 W / cm ² ）下でのさまざまな濃度のDox @ PNIPAM-ppy-FAの温度分析 ）。 c さまざまな電力密度（1、2、および3 W / cm ² ）でのDox @ PNIPAM-ppy-FAの光熱効果 ）。 （D）NIRレーザー照射（2 W / cm ² ）を使用した5回のオン/オフサイクルにわたるDox @ PNIPAM-ppy-FAの温度曲線 ）

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからのNIRおよび熱応答性薬物の放出

NIRと熱応答を介して薬物放出プロファイルを評価するために、Dox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのカプセル化と放出特性を分析しました。最初に、薬物をロードしたPNIPAM-ppy-FAのUV-Vis吸収スペクトルを測定し、480 nm付近に強い吸収ピークが観察されました（図2c）。この結果は、DoxがPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットに正常にロードされたことを示しています。 PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのDoxローディング効率は、Dox検量線を使用して15％と計算されました（データは示していません）。図4aでは、PNIPAM-ppy-FAからのDox放出プロファイルがさまざまな温度で調査されました。 25°C、37°C​​、および50°Cで72時間のDox放出挙動を観察し、PNIPAM-ppy-FAからのDoxの累積放出はそれぞれ15％、42％、および67％でした。 PNIPAM-ppy-FAのLCSTは42°Cまでわずかに低下したため、体温での累積放出は室温よりも比較的高いことがわかりました。大量のDoxが放出されましたが、前述のように[26、32]、Dox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは葉酸受容体陽性細胞にのみ内在化できるため、放出されたDoxは治療効率に影響しませんでした。 LCST（50°C）を超えると、PNIAPM-ppy-FAナノコンポジットからのDoxの量が室温の4倍に放出され、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが熱応答を通じて制御された薬物放出システムで使用できることを示唆しています。さらに、図4bで、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのNIR光トリガー放出挙動を調査しました。 Dox @ PNIAPM-ppy-FAソリューション（1 mg / mL）をNIRレーザー（3 W / cm ² ）にさらしました ）10分間照射し、この操作を1時間ごとに繰り返しました。 6時間の間に、NIRレーザー照射によるDoxの総量は35％に達しましたが、NIRレーザー照射なしのDox放出プロファイルは約5％と15％（25°Cと37°C）を示しました。この結果は、NIRレーザー照射がナノコンポジットのLCSTよりも高い温度をもたらし、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからのDox放出を誘発したことを示しています。

a 熱応答および b を介したDox @ PNIPAM-ppy-FAの累積Doxリリースプロファイル 808 nmNIRレーザー照射

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性および細胞取り込み分析

文献によると、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性は、肺がんおよび乳がん細胞に対して調査されました（追加ファイル1：図S2）[33、34]。サンプル濃度に関係なく、PNIPAM-ppy-FAと24時間インキュベートした後、両方の細胞生存率が観察されました（> 85％）。したがって、当社のPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは、ドラッグデリバリーアプリケーションのナノキャリアとして細胞毒性を示しませんでした[35、36]。 PNIPAM-ppy-FAが癌細胞に選択的に送達できるかどうかを調べるために、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して細胞内PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの蛍光シグナルを調べました（追加ファイル1：図S3）。 PNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAの細胞取り込み挙動は、葉酸受容体陰性（A549）および陽性（MDA-MB-231）細胞株で評価されました[37]。 MDA-MB-231乳がん細胞をDox @ PNIPAM-ppy-FAとインキュベートした後、強い赤色の蛍光が観察され、Dox @ PNIAPM-ppy-FAがMDA-MB-231細胞のリソソームに内在化されたことを示しています。一定の状態で、PNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAをA549細胞で処理した場合、Doxシグナルは観察されませんでした。これらの共焦点画像は、PNIAPM-ppy-FAナノコンポジットが、前述のように受容体を介したエンドサイトーシス経路を介して、葉酸受容体を過剰発現する癌細胞に選択的に内在化できることを示しました[38、39]。

NIRおよび熱応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの化学光熱抗がん効果

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのinvitro併用治療効果を確認するために、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットをNIRレーザー照射の有無にかかわらずMDA-MB-231細胞で評価し、細胞生存率を図5aのMTTアッセイで評価しました。 。光熱治療では、PNIPAM-ppy-FAを使用したMDA-MB-231乳がん細胞を12時間インキュベートし、続いてNIRレーザー（5 W / cm ² ）に曝露しました。 、 5分）。 MDA-MB-231乳がん細胞の細胞生存率は、PNIPAM-ppy-FAの濃度に応じて70〜90％に減少しました。唯一の化学療法効果を確認するために、DoxをロードしたPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを処理しました。図4の放出プロファイルに対応するナノコンポジットからのDox放出により、生存率が50％に低下することが観察されました。興味深いことに、MDA-MB-231細胞にDox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットをNIRレーザー照射した後、細胞生存率は最大24％まで劇的に低下し、対照群（NIRレーザー照射ありのPNIPAM-ppy-FA、NIRレーザー照射なしのDox @ PNIPAM-ppy-FA）よりも高かった。この結果は、NIRレーザー照射を介した化学光熱併用療法の最適な相乗効果を示しています。さらに、がん細胞の治療効果を直接観察するために、図5bで生/死アッセイを実施しました。対照群として、NIRレーザー照射（5 W / cm ² ）の有無にかかわらず、MDA-MB-231細胞のみの生存率を観察しました。 、5分）、ほとんどの細胞は緑色の蛍光を示しました（生細胞）。それは、NIRレーザー照射が明らかに細胞生存率に影響を及ぼさなかったことを示した。さらに、NIRレーザー照射下でPNIPAM-ppy-FAを使用したMDA-MB-231細胞は、いくつかの赤色蛍光（死細胞）を示し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットに起因する光熱治療効果を示しています。 Dox @ PNIPAM-ppy-FAを使用したMDA-MB-231細胞では、NIRレーザーを照射していませんが、化学療法を示す、散発的な赤色蛍光がいくつか観察されました。さらに、MDA-MB-231細胞をナノコンポジットとNIRレーザー照射で処理した場合、ほとんどの癌細胞はわずかな赤色蛍光を示しました[39、40]。これらの結果は、NIRレーザー照射と熱応答性Dox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットによる化学光熱療法の相乗的な治療効果を裏付けました。

a さまざまな濃度のPNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAで処理されたMDA-MB-231乳がん細胞の生存率の定量分析。808nmのNIRレーザー照射の有無にかかわらず。 b NIRレーザー照射の有無にかかわらずPNIPAM-ppy-FAおよびDox @ PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（60μg/ mL）の処理後のMDA-MB-231細胞における生/死アッセイの蛍光画像。生細胞と死細胞は、カルセインAM（緑）とエチジウムホモ二量体-1（赤）で染色されています。スケールバーは200μm

結論

化学療法と光熱の併用療法のために、癌を標的としたNIRと熱応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの構築に成功しました。 808 nm NIRレーザー照射を介して制御放出と光熱効果を誘発するために、重合法によってpnIPAM-AAc上にppyナノ粒子を均一に装飾しました。 DoxをロードしたPNIPAM-ppy-FAは、顕著な光熱効果と光安定性を示しました。さらに、Dox @ PNIPAM-ppy-FAは、さまざまな条件で感熱遷移の好ましい特性を示し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからの薬物放出はNIR光と熱応答によって制御できました。インビトロ研究により、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが優れた生体適合性と乳がん細胞に対する治療効果の向上を示したことが確認されました。ナノコンポジットを介したこの増強された抗癌効果は、以下の理由に寄与した：（1）葉酸受容体媒介エンドサイトーシスにおけるナノコンポジットの特定の細胞取り込み、（2）NIRおよび熱応答を介したPNIPAM-ppy-FAからの蓄積されたDox放出、および（3 ）化学光熱の組み合わせによる相乗的な治療効果。したがって、当社のPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは、副作用が軽減されたさまざまな種類の癌に対する相乗的な治療アプローチのための多機能ナノキャリアとして使用できる可能性があります。

データと資料の可用性

現在の作業のデータと分析は、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

略語

PTT：

光熱療法

NIR：

近赤外線

FA：

葉酸

FA-PEG-NH ₂ ：

FA-PEGアミン

LCST：

臨界溶液温度を下げる

PNIPAM：

ポリ（ N -イソプロピルアクリルアミド）

ppy：

ポリピロール

TEM：

透過型顕微鏡法

UV–Vis：

紫外可視分光法