標的型NIR応答PNIPAM-ピロールナノコンポジットによる相乗的化学・光熱乳がん治療

概要

多機能ナノコンポジットに基づく併用療法は、がん治療効果を向上させる有望なアプローチと見なされている。本研究では、乳がん細胞に対する相乗的化学・光熱療法を目的とした、標的型多機能ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（PNIPAM）ベースナノコンポジットを報告する。PNIPAM合成プロセスにアクリル酸（AAc）を添加することで、固有の下部臨界溶解温度（LCST）を42 °Cに変更した。近赤外（NIR）レーザー照射（808 nm）下で光熱効果を生成するため、ポリピロール（ppy）ナノ粒子をPNIPAM-AAc中に均一に装飾した。がん標的リガンドである葉酸（FA）を、PNIPAMネットワーク内の余剰カルボキシル基に結合させることに成功した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの薬物放出は、NIRレーザー照射による温度変化に応じて効率的にトリガーされた。また、PNIPAM-ppy-FAが葉酸受容体仲介エンドサイトーシスによりMDA-MB-231乳がん細胞に取り込まれ、化学・光熱効果の併用治療でがん治療効果が有意に向上することを確認した。したがって、本成果は異なる種類のがん細胞に対する相乗的治療アプローチのための多機能ナノキャリアエージェントの更なる探求を促すものである。

はじめに

薬物送達システム（DDS）は、医薬化合物を投与してがん治療における治療効果を達成する強力な方法の一つである[1]。DDSの目標は活性薬物を目的部位に送達・蓄積させることだが、従来のDDSはしばしば深刻な副作用と非効率な治療効率を伴う[2, 3]。これらの障害を克服するため、温度、光、pH、電場、酸化還元、酵素活性、抗原濃度などの特定の内部または外部刺激に応答する能力を持つ様々なナノキャリアが、高度なDDSのために開発され、持続的かつ制御された薬物放出を誘導するために用いられてきた[4–6]。

様々な刺激の中でも、温度応答性ナノキャリアは、ナノ粒子内の薬物がある特定温度で放出されるため、がん治療改善の強力なアプローチである[7]。さらに、温度感受性ナノ粒子の利点は他の刺激と組み合わせて完全ながん根絶を誘導できる[8, 9]。温度応答性ナノ粒子として、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)（PNIPAM）が最も注目されており、約32 °Cの下部臨界溶解温度（LCST）で相転移を示すためである[10, 11]。LCST以下では、水素結合によりPNIPAMのポリマーネットワーク全体が膨潤状態で存在する。一方、LCST以上ではPNIPAMは疎水状態へ転移し、水素結合が減少してポリマーネットワークが収縮する[12, 13]。他のナノ粒子と比較して、PNIPAMベースナノキャリアは高い薬物封入効率、制御放出能力、良好な生体適合性という利点を持つ[14]。しかし、体温での自然な薬物放出があるため、PNIPAMベースナノキャリア単独では高度なDDSには不十分である。これを克服するため、先行研究では有機酸（ビニル酢酸、アクリル酸、アリル酢酸など）をPNIPAM合成プロセスに添加し、持続的薬物放出による副作用軽減を図った[15]。

最近、二つ以上の刺激応答性ナノ粒子を統合してがん治療効果を高める新しい治療アプローチに多くの研究が注目されている[16–18]。例えば、光熱療法（PTT）は、腫瘍への精密な光制御、非侵襲的浸透、正常細胞への低毒性などの利点を持つ[19, 20]。ナノ粒子をPTTと組み合わせるには、光熱剤（金ナノロッド、カーボンナノチューブ、ポリピロール（ppy）、酸化グラフェンなど）をPNIPAMベースナノ粒子内に均一に封入する必要がある[21–23]。先行研究では、メソポーラスシリカコート金ナノロッドに温度・pH応答性PNIPAMシェルを形成し、インビボがん治療応用をさらに探求した[24]。しかし、これらのPNIPAMベースナノコンポジットは多段階合成プロセスを必要とする。さらに、ナノコンポジットが特定がん細胞に対する標的モイエティを持たないため、他の臓器や正常組織への深刻な副作用を引き起こす可能性がある。以前の報告では、PNIPAMの温度・pH感受性を用いた双方向制御放出システムを開発した[15]。PNIPAMナノゲルをアクリル酸（AAc）含有量で共重合し、LCSTの効率的制御を図った。がん標的性と治療効果をさらに高めるため、化学療法と光熱効果を用いたがん標的併用療法を開発した（スキーム1）。NIRレーザー照射による温度上昇で、温度応答性PNIPAMナノコンポジットから薬物が放出され、光熱効果がその後活性化される。結合した葉酸（FA）により、PNIPAMベースナノコンポジットはMDA-MB-231乳がん細胞に対して有意に向上した治療効果を示した。

材料と方法

材料

NIPAM、N,N'-メチレンビスアクリルアミド（MBA）、過硫酸カリウム（KPS, 99%）、N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）およびN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）をSigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入。ポリビニルピロリドン（PVP）とピロール（98%）をAlfa Aesar（Ward Hill, MA, USA）から入手。AAcをDae Jung Chemicals & Materials. Co. Ltd（韓国）から購入。FA-PEG-アミン（FA-PEG-NH₂, MW: 5 kDa）をNanocs, Inc.（New York, NY, USA）から提供。ドキソルビシン塩酸塩（Dox）を東京化成工業（東京, 日本）から入手。すべての化学薬品と材料は市販品をさらなる精製なしで使用した。

ppy装飾PNIPAM-AAcナノ粒子の合成

温度応答性PNIPAM-AAcナノ粒子は、ラジカル重合法で先行研究[15]に従って合成した。NIPAMモノマー（1.13 g）、MBA（0.077 g）、AAc（0.136 g）を脱イオン水（100 mL）に溶解し、250 mL三口丸底フラスコに加えた。30分後、反応温度を80 °Cに上げ1時間激しく攪拌した。重合を誘起するためKPS（1.5 mg）を混合物に加え、さらに4時間攪拌した。混合物を分子量カットオフ（MWCO）12–14 kDa透析膜で脱イオン水中7日間透析し、未反応モノマー、開始剤、不純物イオンを除去し、48時間凍結乾燥してPNIPAM-AAcナノ粒子を得た。光熱効果を付与するため、ppyをPNIPAM-AAcナノ粒子内で装飾した[25]。PVP（50および100 mg）とピロールモノマー（50および100 μL）を10 mg/mL PNIPAM-AAc溶液に急速添加し、室温で12時間攪拌した。その後、KPS（3.4 mg）をPNIPAM-AAc溶液に添加し、さらに14時間攪拌した。ppy装飾PNIPAM-AAcを蒸留水で3回遠心分離洗浄した。PNIPAM-ppy-5とPNIPAM-ppy-10を48時間凍結乾燥して得た。

がん標的PNIPAM-ppyナノコンポジットの合成

がん標的PNIPAM-ppyナノコンポジット（PNIPAM-ppy-FA）を得るため、PNIPAM-ppy（10 mg）をリン酸緩衝液（PBS, 10 mL, pH 5.5）に溶解し、5分間超音波処理した。EDC（15 mg, 0.078 mmol）とNHS（15 mg, 0.13 mmol）をPNIPAM-ppy溶液に添加した。1時間後、FA-PEG-NH₂（5 mg）を添加し、さらに一晩攪拌した。PNIPAM-ppy溶液中の未反応FA-PEG-NH₂、EDC、NHSを透析膜（MWCO 6–8 kDa）で除去し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを48時間凍結乾燥して得た。

抗がん薬負荷PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの合成

PNIPAM-ppy-FA（10 mg）を脱イオン水に溶解し、5分間超音波処理した。0.5 mg/mL DoxをPNIPAM-ppy-FA溶液に滴下添加し、室温で激しく攪拌した。未負荷Doxを遠心分離（14,000 rpm, 10分）で除去し、脱イオン水で精製した。Dox負荷PNIPAM-ppy-FA（Dox@PNIPAM-ppy-FA）を48時間凍結乾燥して得た。

NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのキャラクタリゼーション

透過型電子顕微鏡（TEM, JEOL-2100F, JEOL, 日本）で、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのサイズ、形態、分布を評価した。TEM測定用サンプルは、脱イオン水中のサンプル溶液（濃度: 1 g/L）をカーボンコート200メッシュ銅グリッドに滴下して調製した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのサイズ分布と表面電荷は、脱イオン水に溶解し5分間超音波処理した後、ゼータサイザーNano Z（Malvern Instruments, UK）で測定した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの表面修飾と化学結合をフーリエ変換赤外分光法（FT-IR）で確認した。FT-IRスペクトルは、KBrペレット法でNicolet iS50装置（Thermo Fisher Scientific, Inc., USA）を用い、400–4000 cm⁻¹の範囲で分解能4 cm⁻¹で記録した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光学特性とDox負荷容量をUV-Vis分光法（UV 1800, Shimazu, 日本）で観察した。

NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性と光安定性

Dox負荷PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（Dox@PNIPAM-ppy-FA）の光熱特性を、リアルタイム温度変化検出で評価した。Dox@PNIPAM-ppy-FAを0.05、0.1、0.2 mg/mLの異なる濃度の水溶液に溶解し、808 nm NIRレーザー（MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., 中国）を出力密度2 W/cm²で20分間照射した。NIRレーザー出力密度の影響を、1、2、3 W/cm²の出力密度で20分間照射して調べた。さらに、NIRレーザーに対する光熱安定性を調べるため、Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（0.1 mg/mL）を15分間曝露し、自然冷却を5回繰り返した。NIRレーザー照射中、デジタル温度計（DTM-318, Tecpel Co., 台湾）に接続した熱電対で、15分間毎60秒ごとにDox@PNIPAM-ppy-FA溶液の温度を測定した。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのNIRおよび温度応答性薬物放出

温度応答によるDox放出プロファイルを調べるため、Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）を5 mLバイアルに調製し、25、37、50 °Cで攪拌した。規定放出時間（0–72時間）で、各サンプルの上清を遠心分離で回収し、同量の新鮮培地で置換した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットから放出されたDox量を、480 nmでのUV-Vis分光測定で推定した。さらに、NIRレーザー刺激応答によるDox放出挙動を調べるため、Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）を37 °Cで激しく攪拌し、所定時間点（1, 2, 3, 4, 5時間）で10分間NIRレーザー照射した。対照として、NIRレーザー照射なしのDox@PNIPAM-ppy-FA溶液を用いた。放出Doxは前述の方法で決定した。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性解析

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（PNIPAM-ppy-FAおよびDox@PNIPAM-ppy-FAを含む）の細胞毒性をMTTアッセイで検証した。A549およびMDA-MB-231細胞を、10% FBSと1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地200 µL中、1ウェルあたり1 × 10⁴細胞の密度で96ウェルプレートに播種し、5% CO₂、37 °C、加湿雰囲気下で培養した。1日後、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを様々な濃度（20–100 µL）で各細胞に処理し、24時間培養した。細胞をDPBSで洗浄し、培地をMTT試薬（0.5 mg/mL）を含む新鮮培地に置換した。さらに4時間培養後、培地を慎重に除去し、各ウェルに200 µL DMSOを添加して内部化した紫色フォルマザン結晶を溶解した。吸光度をiMark™マイクロプレートリーダー（Bio-rad, Hercules, CA, USA）で595 nmで測定した。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞取り込み解析

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの特定がん細胞への標的能力を評価するため、A549とMDA-MB-231細胞を8ウェルプレート（ibidi, Munich, Germany）に2 × 10⁴ cells/mLの密度で播種し、24時間培養した。細胞をPNIPAM-ppy-FAナノコンポジット（60 µg/mL）で6時間インキュベートした。その後、DPBSで2回洗浄して残留ナノコンポジットを除去し、4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した。室温で0.1% Triton-Xを15分間処理した後、Alexa Fluor 488ファロイジン（1:200, Invitrogen, USA）で1日間4 °C、4,6-ジアミジノ-2-フェニルインダール（DAPI, Thermo Fisher Scientific, USA）で10分間染色した。細胞取り込み像を共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, ドイツ）で観察した。

NIRレーザー照射によるPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの抗がん効果増強

NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAによる乳がん細胞への併用治療効果をMTTアッセイで検証した。MDA-MB-231（1 × 10⁴ cells/mL）を96ウェルプレートに播種し、24時間培養した。細胞をDPBSで洗浄し、PNIPAM-ppy-FAとDox@PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを濃度依存的に様々な濃度（20, 40, 60, 80, 100 μg/mL）で各ウェルに添加した。一晩培養後、培地を除去し、新鮮培地を添加した。NIRレーザー照射群では、細胞を5 W/cm²で5分間照射した。その後、MDA-MB-231をDPBSで洗浄し、MTT溶液を含む新鮮培地を添加した。4時間後、培地を慎重に除去し、各ウェルに200 μL DMSOを添加した。最終的に、iMark™マイクロプレートリーダーで595 nmの吸光度を測定し、細胞生存率を決定した。がん治療効果観察の別法として、ライブ/デッドアッセイを実施した。PNIPAM-ppy-FAとDox@PNIPAM-ppy-FA（60 μg/mL）をMDA-MB-231に処理した。24時間後、MDA-MB-231をNIRレーザー照射あり/なし（5 W/cm², 5分）で曝露し、カルセインAMとエチジウムホモマー-1で染色した。30分後、DPBSで数回洗浄した。ライブ/デッド像を倒立蛍光顕微鏡（Olympus Ix73, 日本）で取得した。

結果と考察

NIRおよび温度応答性がん標的PNIPAM-ppyナノコンポジットの合成とキャラクタリゼーション

温度応答性PNIPAMベースナノコンポジット生成のため、PNIPAM-AAcナノ粒子をラジカル重合法で作製した[15]。NIRレーザー照射によるLCST制御のため、調製済みPNIPAM-AAc中で重合反応によりppyを被覆した。がん標的PNIPAM-ppy-FAは、PNIPAM-AAc中のカルボキシル基にFA-PEG-NH₂を化学結合させて合成した。図1aのTEM像から、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FAの形態、サイズ、分散性を観察した。調製されたPNIPAM-AAcは平均直径274.32 ± 11.62 nmの均質な形態を示した。ppy装飾後、PNIPAM-ppyとPNIPAM-ppy-FAはそれぞれ275.99 ± 11.41 nm、285.77 ± 17.92 nmと類似サイズを示した。Dox負荷PNIPAM-ppy-FAのサイズは285.77 ± 17.92 nmから290.73 ± 12.28 nmへわずかに増加し、抗がん薬がPNIPAM-ppy-FAナノコンポジット内に負荷されたことを示唆する[26]。興味深いことに、PNIPAM-AAcと比較して、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット内のppy存在が小さな黒点として明確に観察された。また、PEG鎖のおかげでPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは凝集なしで水溶液中に良好に分散した[27]。PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、Dox@PNIPAM-ppy-FAの平均動的直径をDLS解析で測定した（Additional file 1: Fig. S1）。各ナノコンポジットの直径はそれぞれ432、450.7、468.6、486.7 nmであった。異なる分析手法のためTEMより直径は大きいが、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの粒子サイズと分布は類似傾向を示した。

PNIPAM-AAcへのppy重合影響を調べるため、PNIPAM-AAcとDox@PNIPAM-ppy-FAのLCST値を異なる温度で測定した（図1b）。先行研究[15]と比較すると、Dox@PNIPAM-ppy-FAのLCSTはPNIPAM-AAc（42 °C）よりわずかに低下した。この差は、重合ppyと結合した標的リガンドによりPNIPAM-AAcのカルボキシル基が減少したことによる可能性がある[28]。その後、温度による粒子サイズ変化を図1cで監視した。PNIPAM-AAcとDox@PNIPAM-ppy-FAの直径を25–50 °Cで測定した。温度上昇に伴い、PNIPAM-AAcは436から177 nmへ減少した。また、Dox@PNIPAM-ppy-FAのサイズも630から420 nmへ大幅に減少し、PNIPAMナノコンポジット内のppy装飾が制御・温度応答性DDSへの応用を大きく阻害しないことを示した[27]。

PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、Dox@PNIPAM-ppy-FAのゼータ電位値は、修飾前後のナノコンポジット表面変化を示す（図2a）。PNIPAM-AAcのゼータ電位はAAcのカルボキシル基により−37.1 ± 1.61 mVであった[29]。PNIPAM-ppyとPNIPAM-ppy-FAの値は−29.6 ± 0.96、−15.6 ± 0.26 mVへ上昇し、正電荷ppyとFA-PEG-NH₂がPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットへ導入されたことを示す[27]。負電荷Doxにより、Dox@PNIPAM-ppy-FAのゼータ電位はより負の−28.6 ± 0.23 mVへ変化した。図2bに示す通り、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FAの合成成功をFT-IR分光法で確認した。PNIPAM-AAcスペクトルは、1100–1200 cm⁻¹にC-NとCH₂の伸縮振動ピーク、1545、1645、1750 cm⁻¹にC=O、N–H、COOHのピークを示し、これらはPNIPAM-AAcに属する[15]。PNIPAM-ppyとPNIPAM-ppy-FAのポリピロールは、935と1050 cm⁻¹に追加ピークを示した[30]。PNIPAM-ppy-FAスペクトルでは、1107と2880 cm⁻¹に新たな振動ピークが出現し、PEG鎖のC–O–Cに帰属される[31]。この結果はFA-PEG-NH₂の化学結合成功を示した。しかし、FAの標的リガンドは構造がPEGと類似しているためFT-IRでは検出されなかった。PNIPAMナノコンポジット中のFA存在を確認するため、PNIPAM-AAc、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FAをUV-Vis分光法で測定した（図2c）。PNIPAM-AAcとPNIPAM-ppy（FAなし）は吸収ピークを示さなかったが、PNIPAM-ppy-FAは280 nmにFA特有の追加吸収ピークを示した[32]。この結果は、FA分子がPNIPAMベースナノコンポジット上にグラフトされていることを支持する。

NIRレーザー照射によるPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性

PNIPAMベースナノコンポジットを光熱療法に用いるため、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光学特性をUV-Vis分光法で調べた。図2cに示す通り、PNIPAM-AAcはNIR領域（λ = 700–1000 nm）で吸収を示さなかった。しかし、PNIPAM-ppy、PNIPAM-ppy-FA、Dox@PNIPAM-ppy-FAのスペクトルは、重合ppyナノ粒子により同領域で明確な強吸収を示した。これらの吸収結果は、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットがNIR光を熱に変換可能であることを示した[26]。次に、NIRレーザー照射によるPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱特性を評価した（図3）。光熱効果を最適化するため、PNIPAM-FA（ピロールなし）、PNIPAM-ppy-5-FA（ppy 50 μL）、PNIPAM-ppy-10-FA（ppy 100 μL）を同濃度（0.1 mg/mL）で調製し、808 nm NIRレーザーを出力密度2 W/cm²で20分間照射した（図3a）。PNIPAM-ppy-10-FAの温度上昇は14.5 °Cで、PNIPAM-ppy-5-FAの2倍であった。対照としてPNIPAM-FA（ppyなし）を照射したが、温度上昇は無視できるレベル（2.4 °C）であった。したがって、更なる光熱実験にはPNIPAM-ppy-10-FAを選択した。濃度による温度変化を観察するため、PNIPAM-ppy-FAを異なる濃度（0.05、0.1、0.2 mg/mL）でNIRレーザー照射した（図3b）。濃度に依存して温度上昇は10、14.5、18 °Cであった。さらに、PNIPAM-ppy-FA溶液（0.1 mg/mL）を様々なレーザー出力密度（1–3 W/cm²）で照射した（図3c）。予想通り、ナノコンポジットの温度上昇はレーザー出力に強く依存した。その後、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの光熱安定性を観察した（図3d）。NIRレーザー照射を最低5回繰り返しても、温度は安定して33 °Cまで上昇し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが光熱療法用ナノキャリアとして適していることを示した。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからのNIRおよび温度応答性薬物放出

NIRおよび温度応答による薬物放出プロファイルを評価するため、Dox@PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの封入と放出特性を分析した。最初に、薬物負荷PNIPAM-ppy-FAのUV-Vis吸収スペクトルを測定し、480 nm付近に強い吸収ピークを観察した（図2c）。この結果は、DoxがPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットへ成功裏に負荷されたことを示した。PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのDox負荷効率は、Doxキャリブレーション曲線を用いて15%と計算された（データ未掲載）。図4aでは、PNIPAM-ppy-FAからのDox放出プロファイルを異なる温度で調べた。25 °C、37 °C、50 °Cで72時間Dox放出挙動を観察し、PNIPAM-ppy-FAからのDox累積放出率はそれぞれ15%、42%、67%であった。PNIPAM-ppy-FAのLCSTがわずかに42 °Cへ低下したため、体温での累積放出は室温より相対的に高かった。大量のDoxが放出されたが、放出Doxは治療効率に影響しない。なぜならDox@PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは、前述のように葉酸受容体陽性細胞のみに内部化されるからである[26, 32]。LCST以上（50 °C）では、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからのDox放出量は室温の4倍となり、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが熱応答による制御薬物放出システムに利用可能であることを示唆した。さらに、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのNIR光触発放出挙動を図4bで調べた。Dox@PNIPAM-ppy-FA溶液（1 mg/mL）をNIRレーザー（3 W/cm²）で10分間照射し、この操作を1時間ごとに繰り返した。6時間でNIRレーザー照射による総Dox放出量は35%に達したのに対し、照射なしでは約5%と15%（25 °Cと37 °C）であった。この結果は、NIRレーザー照射がナノコンポジットのLCST以上の温度上昇をもたらし、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからDox放出を誘導することを示した。

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性と細胞取り込み解析

文献[33, 34]に従い、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの細胞毒性を肺がんと乳がん細胞で調べた（Additional file 1: Fig. S2）。サンプル濃度に関わらず、PNIPAM-ppy-FAで24時間培養後、両細胞の生存率は85%以上で観察された。したがって、我々のPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは薬物送達用ナノキャリアとして細胞毒性を示さない[35, 36]。PNIPAM-ppy-FAが選択的にがん細胞へ送達可能か調べるため、共焦点レーザー走査顕微鏡で細胞内PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの蛍光信号を調べた（Additional file 1: Fig. S3）。葉酸受容体陰性（A549）と陽性（MDA-MB-231）細胞株で、PNIPAM-ppy-FAとDox@PNIPAM-ppy-FAの細胞取り込み挙動を評価した[37]。MDA-MB-231乳がん細胞をDox@PNIPAM-ppy-FAで培養後、強い赤色蛍光が観察され、Dox@PNIPAM-ppy-FAがMDA-MB-231細胞のリソソームへ内部化されたことが示された。対照的に、A549細胞にPNIPAM-ppy-FAとDox@PNIPAM-ppy-FAを処理した場合、Dox信号は観察されなかった。これらの共焦点像は、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが葉酸受容体過剰発現がん細胞へ受容体仲介エンドサイトーシス経路で選択的に内部化されることを実証した[38, 39]。

NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットの化学・光熱抗がん効果

PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットのインビトロ併用治療効果を確認するため、MDA-MB-231細胞でNIRレーザー照射あり/なしで評価し、MTTアッセイで細胞生存率を測定した（図5a）。光熱療法では、MDA-MB-231乳がん細胞をPNIPAM-ppy-FAで12時間培養後、NIRレーザー（5 W/cm², 5分）照射した。MDA-MB-231の細胞生存率はPNIPAM-ppy-FA濃度に依存して70–90%へ低下した。化学療法のみの効果を確認するため、Dox負荷PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを処理した。ナノコンポジットからのDox放出（図4の放出プロファイルに対応）により、生存率は50%まで低下した。興味深いことに、Dox@PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット処理MDA-MB-231細胞にNIRレーザー照射を行うと、細胞生存率が劇的に24%まで低下し、対照群（NIR照射ありPNIPAM-ppy-FA、NIR照射なしDox@PNIPAM-ppy-FA）より高い効果を示した。この結果は、NIRレーザー照射仲介の化学・光熱併用療法の最適な相乗効果を示している。さらに、治療効率を直接観察するためライブ/デッドアッセイを実施した（図5b）。対照群として、NIRレーザー照射あり/なし（5 W/cm², 5分）のMDA-MB-231単独を観察し、ほとんどの細胞が緑色蛍光（生細胞）を示した。これはNIRレーザー照射単独が細胞生存率に明確な影響を与えないことを示した。また、NIR照射下のPNIPAM-ppy-FA処理MDA-MB-231ではわずかな赤色蛍光（死細胞）が観察され、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジット由来の光熱治療効果を示した。NIR照射なしのDox@PNIPAM-ppy-FA処理MDA-MB-231でもわずかな散発的赤色蛍光が観察され、化学療法効果を示した。さらに、ナノコンポジット処理とNIRレーザー照射を併用したMDA-MB-231では、最も多くのがん細胞が赤色蛍光を示した[39, 40]。これらの結果は、NIRレーザー照射と温度応答性Dox@PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットによる化学・光熱療法の相乗的治療効果を支持する。

結論

がん標的NIRおよび温度応答性PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットを化学・光熱併用療法用に構築することに成功した。808 nm NIRレーザー照射による制御放出と光熱効果誘導のため、重合法でppyナノ粒子をPNIPAM-AAc上に均一に装飾した。Dox負荷PNIPAM-ppy-FAは有意な光熱効果と光安定性を示した。さらに、Dox@PNIPAM-ppy-FAは異なる条件下で好ましい温度感受性転移特性を示し、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットからの薬物放出がNIR光と温度応答で制御可能であることを示した。インビトロ研究で、PNIPAM-ppy-FAナノコンポジットが優れた生体適合性と乳がん細胞への向上した治療効果を示すことを検証した。ナノコンポジットによる抗がん効果増強は以下の理由による：（1）葉酸受容体仲介エンドサイトーシスによるナノコンポジットの特定的細胞取り込み、（2）NIRおよび温度応答によるPNIPAM-ppy-FAからの蓄積的Dox放出、（3）化学・光熱併用による相乗的治療効果。したがって、我々のPNIPAM-ppy-FAナノコンポジットは、副作用を低減しつつ、異なる種類のがんに対する相乗的治療アプローチのための多機能ナノキャリアとして潜在的に利用可能である。

データと材料の入手可能性

現在の研究におけるデータと分析は、合理的な要請に基づき責任著者から入手可能です。

略語

PTT:

光熱療法

NIR:

近赤外

FA:

葉酸

FA-PEG-NH₂:

FA-PEGアミン

LCST:

下部臨界溶解温度

PNIPAM:

ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)

ppy:

ポリピロール

TEM:

透過型電子顕微鏡

UV-Vis:

紫外-可視分光法