光熱治療および光音響イメージングのためのポリピロール被覆鉄-白金ナノ粒子の合成およびinvitro性能

背景

過去10年間で、多くの新しい治療戦略が癌治療に導入されてきました。それらの中で、光熱療法（PTT）は、高い特異性、正確な時空間選択性、および限られた副作用などの利点のためにかなりの注目を集めました[1、2]。 PTTは、近赤外領域（NIR）光吸収体を利用して、NIRレーザー照射時に癌細胞の熱焼灼のための熱を発生させます[2]。同じ波長のレーザー照射を利用することで、NIR光吸収体は光音響イメージング（PAI）に基づく光熱癌治療に使用できます[3、4]。

最近、鉄-白金ナノ粒子（FePt NP）が、CT / MRIデュアルモダリティイメージングの効果的な薬剤として登場しました[5]。 FePt NPは、NIR領域で金ナノ粒子よりも高い光熱効率を示します[6]。金ナノ粒子と比較して、FePtNPを使用して生成されたより強い光音響信号も最近実証されました[7]。ポリマーによる表面修飾は、癌治療のためのナノ粒子の生体適合性と性能を向上させるためのよく知られた技術です。それらの有望な特性にもかかわらず、生物医学的応用のためのFePt NPの表面修飾に関するいくつかの研究努力がありました[8、9]。

ナノスケール剤の光から熱への変換の高効率は、PTTの最も重要な要素です[10]。したがって、FePt NPの表面改質に選択された材料は、FePtNPコアの光から熱への変換に悪影響を与えないはずです。近赤外領域で強い励起を示すポリピロール（PPy）は、光熱安定性、低コスト、生体適合性などの優れた固有の機能により、生物医学アプリケーションでかなりの重要性を獲得しています[11、12]。最近の研究では、PPyがPTT癌治療[11、13]および深部組織PAI [12]の高性能薬剤として報告されています。本研究では、PTTとPAIを組み合わせるための新規薬剤としてPPyコーティングされたFePt NP（FePt @ PPy NP）を開発しました。 PPyポリマーを使用してFePtNPをコーティングする場合の期待は、FePtNPの光熱効果と生体適合性を向上させることです。

得られたナノ粒子は、優れた生体適合性、光熱安定性、および強力な光熱効果を示しています。 MTTアッセイ研究は、FePt @ PPyNPが効果的な癌治療を示したことを明らかにしました。さらに、FePt @ PPy NPと組み合わせたPAIのファントムテストは、PAIのさらなるアプリケーションに非常に有望な強力な光音響（PA）信号を示しました。

メソッド

資料

プラチナアセチルアセトナート（Pt（acac） ₂ 、97％）は、Acros Organicsから購入し、受け取ったままの状態で使用しました。鉄ペンタカルボニル（Fe（CO） ₅ 、99％）、ヘキサデカン-1,2-ジオール（90％）、オレイルアミン（80–90％）、オレイン酸（70％）、ジオクチルエーテル（90％）、1-オクタデセン（90％）、3-メルカプトプロピオン酸（3-MPA、97％）、ピロール（Py、試薬グレード、98％）、ポリビニルアルコール（PVA、Mw：9000–10,000）、過硫酸アンモニウム（（NH ₄ ） ₂ S ₂ O ₈ 、98％）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、フェロシアン化カリウム、塩酸、および3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）は、Sigma-Aldrichから購入し、使用しました。実験中に受け取ったとおり。トリパンブルー、ヨウ化プロピジウム（PI）、ヘキスト33342などの細胞染色試薬もSigma-Aldrichから購入しました。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、ストレプトマイシン、1×トリプシン、およびリン酸緩衝生理食塩水（PBS）は、HyClone（South Logan、UT、USA）から購入しました。すべての実験に蒸留水（DI）を使用しました。

FePt @ PPyNPの合成

FePt @ PPy NPの合成は、スキーム1で説明した3つのステップで実行されました。

FePt @ PPyNPの合成の概略図

ステップ1-疎水性FePtNPの合成

疎水性FePtNPの合成は、報告されているスキーム[5]に従って行われました。つまり、97 mgのPt（acac） ₂ 、4 mLジオクチルエーテル、66μLFe（CO） ₅ 、195 mgの1,2-ヘキサデカンジオール、100μLのオレイルアミン、および100μLのオレイン酸を50mLの3つ口丸底フラスコに入れました。反応混合物を、アルゴンガス下で15℃/分の加熱速度で240℃に加熱した。 30分後、製品を室温まで冷却しました。 FePt NPを遠心分離（15,000 rpm、30分）で収集し、ヘキサンで数回洗浄しました。最終的なナノ粒子溶液はヘキサンに保存されました。

ステップ2-リガンド交換

記事[14]で報告されているように、疎水性FePt NPの表面のリガンドは3-メルカプトプロピオン酸（3-MPA）と交換されました。さらに、1mLの3-MPAと1mLのシクロヘキサノンを遠心分離管に入れ、ヘキサンに分散した0.5mLの疎水性FePtNP（〜10 mg）を上記の溶液に加え、ボルテックスを使用して振とうしました。 30分後、FePt NPが沈殿し始め、1時間後にすべてのナノ粒子が沈殿しました。親水性のFePtNPは、遠心分離（3500 rpm、5分）によって収集されました。生成物をそれぞれシクロヘキサノン、エタノール、およびアセトンで洗浄した。最後に、NaOHを添加してDIで希釈した親水性FePtNP。

ステップ3-親水性FePtNPをPPyでコーティングする

5ミリグラムの親水性FePtNPを60mLDIを含む200mLバーカーに溶解し、10分間超音波処理を続けました。次に、6mLの40mMSDSを上記の溶液に添加しました。次に、熱湯に完全に溶解した1gのPVAを上記の溶液に加えた。次に、得られた混合物を500rpmで撹拌しました。次に、10 mLの6-mM（NH ₄ ） ₂ S ₂ O ₈ 撹拌した溶液に加えた。 1時間平衡化した後、6mLの100mMPyを上記の溶液に加えました。数分後、溶液は徐々に黒くなった。 2時間の重合後、得られたナノ粒子を遠心分離（12,000 rpm、30分）で分離し、熱水で数回洗浄して不純物を除去しました。得られたFePt @ PPy NPを、3分間の超音波処理によってPBSで再懸濁しました。

特性評価

ナノ粒子の形態は、電界放出透過型電子顕微鏡（FETEM; JEM-2100F、JEOL、日本）を使用して観察されました。原子組成はエネルギー分散型分光法（EDS）によって分析されました。ナノ粒子の化学官能基は、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）分光計（Perkin Elmer 1320 FTIR分光光度計）を使用して分析されました。ナノ粒子の直径は、電気泳動光散乱分光光度計（ELS-8000、大塚電子株式会社、日本）を使用した動的光散乱法によって決定された。 UV-Vis-NIRスペクトルは、UV-Vis-NIR分光法（Thermo Biomate 5分光光度計）を使用して測定しました。レーザー照射は、出力調整可能な808 nmレーザー（連続波、最大出力=5 W、Hi-TechOptoelectronics Co.、北京、中国）を使用して実行されました。

光熱テスト

調製したままのNPの光熱性能を測定するために、特定の濃度（20、30、50、70、100、および120μg/ mL）のFePt @ PPy NPを含む懸濁液（1 mL）を12ウェルに添加しました。皿。次に、各ウェルを808nmレーザーで1W / cm ² の出力密度で露光しました。 5分間。さらに、808nmレーザーのさまざまな出力密度で照射されたFePt @ PPyNPの温度上昇も記録されました。簡単に説明すると、50μg/ mLのFePt @ PPy NP溶液に、0.5、1、および1.5 W / cm ² の目的の出力密度でNIRレーザーを照射しました。 6分間。温度は、温度計（MASTECH、CA、USA）によって熱繊維を介して記録されました。

光安定性テスト

50μg/ mLのFePt @ PPy NPを、1 W / cm ² の出力密度で808nmレーザーに露光しました。 最高温度に達するまで、その後、レーザーをオフにして室温に戻しました。加熱と冷却のサイクルを6回繰り返しました。照射されたサンプルのUV-Visスペクトルは、照射されたサンプルと比較するために記録されました。

長期ストレージテスト

120μg/ ml濃度の水性懸濁液FePt @ PPy NPを4°Cで30日間保存し、長期保存での安定性を評価しました。比較のために、UV-Vis吸収スペクトルとFePt @ PPyNPの粒子サイズを1日目と最終日に観察しました。さらに、DI、DMEM培地とFBS、PBSなどのさまざまな培地上のFePt @ PPy NPを、調製したFePt @ PPy NPの安定性を評価するために、4°Cで30日間保存しました。

FePt-PPyNPの細胞毒性アッセイ

標準的なMTTアッセイ[15]を使用して、細胞の細胞毒性を定量化しました。 MDA-MB-231乳がん細胞は、FePt @ PPyNPの生体適合性をテストするためのモデルがん細胞として使用されました。 FePtNPで処理された癌細胞を対照として使用した。 MDA-MB-231細胞株は、10％FBSと1％抗生物質を添加したDMEM培地で、37°C​​、5％CO ₂ の加湿雰囲気で培養しました。 。 MDA-MB-231細胞を、96ウェルマイクロプレートに1×10 ⁴ の密度で播種しました。 細胞/ウェル。 24時間後、さまざまな濃度（0、20、30、50、70、100、および120μg/ mL）のFePt @ PPy NP（またはFePt NP）を含むDMEM培地を細胞プレートに添加し、処理した細胞をその後、48時間培養しました。 FePtの量は、FePtNPとFePt-PPyNPを含む2つのテストされたナノ粒子で同じであることに注意してください。次に、0.5 mg / mLのPBSに溶解した100μLのMTTを各ウェルに添加し、細胞プレートをさらに4時間インキュベートしました。生細胞のミトコンドリアに存在するデヒドロゲナーゼ酵素は、可溶性MTTを不溶性紫色のホルマザンに変換しました。次に、100μLのDMSOを加えて、不溶性の紫色のホルマザンを溶解しました。続いて、プレート読み取り分光光度計を使用して570 nmで紫色のホルマザンの吸収を記録し、細胞の生存率を定量化しました。

セルラー取り込み

プルシアンブルー染色を使用して、MDA-MB-231細胞におけるFePt @ PPyNPの細胞取り込みをチェックしました[16]。細胞は1×10 ⁵ の密度で播種されました 12ウェルプレートに細胞/ mLを入れ、24時間インキュベートします。次に、200μg/ mLのFePt @ PPy NPを細胞プレートに加え、さらに24時間インキュベートしました。その後、細胞を冷ホルムアルデヒドで15分間固定しました。次に、10％フェロシアン化カリウムと20％塩酸水溶液（50:50 v / v ）を細胞プレートに加え、1時間インキュベートしました。結果は光学顕微鏡を使用して観察されました。

インビトロ光熱療法

MTTアッセイは、MDA-MB-231乳がん細胞の殺傷能力に対するFePt @ PPyNPの有効性を定量化するために実施されました。簡単に説明すると、MDA-MB-231細胞を96ウェルマイクロプレートで1×10 ⁴ の密度で培養しました。 細胞/ウェル。翌日、特定の濃度（0、10、20、30、50、70、および100μg/ mL）のFePt @ PPy NP溶液を細胞プレートに添加し、処理した細胞をさらに24時間インキュベートしました。 。次に、PBSを使用して未結合のナノ粒子を洗浄しました。続いて、マイクロプレートを1 W / cm ² の出力密度でNIRレーザーに露光しました。 それぞれ4分と6分。結果を得るために、「FePt-PPyNPの細胞毒性アッセイ」セクションの細胞毒性アッセイに従って以下のステップを実施しました。

ヘキスト33342とPIの二重染色は、FePt @ PPyNPを使用した光熱処理の結果として損傷した細胞と死んだ細胞を検出するためにも使用されました。具体的には、MDA-MB-231細胞を1×10 ⁵ の密度で12ウェルプレートに播種しました。 細胞/ウェル。 24時間後、細胞をFePt @ PPy NP（0、50、70、および100μg/ mL）で処理し、37°C​​でさらに24時間継続的にインキュベートしました。次に、PBSで穏やかに洗浄することにより、結合していないナノ粒子を除去した。続いて、セルプレートを1 W / cm ² の出力密度でNIRレーザーに露光しました。 6分間。次に、細胞培養プレートをインキュベーター内で24時間保持した後、照射した細胞をHoechst33342とPIで染色しました。 1.5 mL Hoechst 33342（10μg/ mL）を細胞培養プレートに加え、インキュベーターに20分間保持したことに注意してください。次に、細胞を３回のＰＢＳで洗浄して、過剰な汚れを除去した。次に、細胞を1.5 mL PI（10μg/ mL）で継続的に染色し、室温で5分間インキュベートしました。最後に、細胞を再びPBSで洗浄し、蛍光顕微鏡（Leica Microsystems GmbH、Wetzlar、Germany）で蛍光画像を取得しました。

動物実験

FePt @ PPyNPの光熱特性のinvivoテストを実行するために、6週齢のメスのBALB / cヌードマウスに100μLの100μg/ mLFePt @ PPyNPを含むPBSを皮下注射しました。注射なしの別のヌードマウスを対照として使用した。その後、マウスの注射部位に1 W / cm ² の808nmレーザーを照射しました。 6分間。動物を使った実験手順は、釜慶国立大学の動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施されました。

インビトロ光音響イメージング

PAIの設定

ファントムのPAIは、FePt @ PPyNPのPA信号を評価するために実行されました。私たちのグループは、以前の研究[17]で報告されているように、非侵襲的PAIシステムを開発しました。 PAIセットアップの概略図を図11に示しました。パルスNd-YADQスイッチレーザー（Surelite III、CA、USA）を組み込んだ光学システムを使用しました。レーザーは、波長808 nm、周波数10 Hz、パルス動作5nsに設定されました。焦点距離が50mmの入力光ファイバー（Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州、米国）を平凸レンズに接続しました。出力光ファイバーは、集束トランスデューサー（Olympus NDT、USA）にリンクされ、照明ゾーンの中心に調整されました。 PA信号を記録するために、データはデジタル化され、レーザーシステムと統合されたDAQ（データ取得）システムを介して保存されました。その後、記録されたデータを使用して、LabVIEWプログラムによってファントムの2D画像を再構成しました。

サンプル準備

組織を模倣するために、PVAファントムを8％PVAで調製しました。事前に播種したMBA-MD-231がん細胞を、さまざまな濃度のFePt @ PPy NP（50、100、および200μg/ mL）で24時間処理した後、細胞を回収し、ファントム上で4％ゼラチンと混合しました。 （図12a）。次に、ファントムを４％ゼラチンの小層で覆い、固化させた。最後に、ファントムはPAI処理のために水タンクに固定されました。

結果と考察

FePt @ PPyNPの合成と特性評価

FePt NPの合成プロセスをスキーム1に示します。これらのナノ粒子のEDS分析により、FeとPtの最終的な原子組成はそれぞれ20％と80％であることが明らかになりました（追加ファイル1：図S1）。疎水性FePtNPは3-MPAで修飾されました。したがって、それらは平均サイズ8.3nmの親水性FePtNPになります。疎水性のFePtNPは、表面にオレイン酸とオレイルアミンが存在するため、ヘキサンに分散します。ただし、粒子はリガンド交換後に水溶性になります。疎水性FePtNPと親水性FePtNPのFTIRスペクトルは、表面のオレイン酸、オレイルアミン、および3-MPAの吸収リガンドからの特徴的なバンドを明らかにしました（図3;スキーム2）[14、18]。 FTIRデータ（図2）と親水性FePt NPの水への良好な溶解性（スキーム1、ステップ2）により、リガンド交換プロセスの成功が確認されました。

光熱療法と光音響イメージングにおけるFePt @ PPyNPの合成と応用の概略図

FePt NPは、（NH ₄ を使用した化学酸化重合によってPPyでコーティングされました。 ）S ₂ O ₈ 酸化剤として、PVAを安定剤として。 PPy層は、厚さが約10 nmのTEMイメージング（図1c）ではっきりと観察され、FePt @ PPyNPの平均サイズは42nmです（図1d）。 FePt @ PPy NPのFTIRも実装され、FTIR周波数の変化を調べることでPPy NPのコーティングを確認しました（図3c）。 PPyの特徴的なピークは、以前のレポート[19]で十分に分析されています。 1620および1446​​cm ^-1 のFTIR振動バンド PPyリングのC–CおよびC =C伸縮振動に割り当てられました。 1236 cm ^-1 のバンド C–N伸縮振動、および1076 cm ^-1 のバンドに起因していました。 C–N面内変形モードの存在を示しました。さらに、798および600 cm ^-1 のバンド は、それぞれC–HおよびN–Hの面内変形振動とC–Hの外側曲げ振動に起因していました。 FTIRとTEMを組み合わせることで、PPy外部FePtNPのコーティングを成功させることができます。

a TEMおよび b 純粋なFePtNPの対応するサイズ分布。 c TEMおよび d FePt @ PPyNPの対応するサイズ分布

（a）疎水性FePt NP、（b）親水性FePt NP、および（c）FePt @ PPyNPのFTIRスペクトル

純粋なFePt、PPy、およびFePt @ PPyNPのUV-Vis-NIRスペクトル

同量のFePtを含む純粋なFePtNPとFePt @ PPyNPの光熱加熱曲線。すべての溶液に1-W / cm ² を照射しました。 6分間の808nmレーザー

a さまざまな濃度のFePt @ PPyNPのUV-Vis-NIRスペクトル。 b 異なる濃度のFePt @ PPyNPの光熱崩壊。 c 照射されたサンプルの対応するNIRサーモグラフィ画像。すべての溶液に1-W / cm ² を照射しました。 808nmレーザーで5分間

a 50μg/ mLのFePt @ PPy NPの光熱挙動を、808nmレーザー下でさまざまな出力密度で6分間維持しました。 b オン/オフレーザー実験（1 W / cm ² ）での50μg/ mLのFePt @ PPyNPの6回の加熱/冷却サイクルのリアルタイム温度記録 ）。 c 照射前後のFePt @ PPyNPのUV-Vis-NIRスペクトル

異なる濃度のFePtおよびFePt @ PPyNPと48時間インキュベートしたMDA-MB-231細胞の細胞生存率（MTTアッセイを使用）

異なるレーザー出力密度と異なる照射時間の下でFePt @ PPyNPで処理された細胞から生きている細胞のパーセンテージ。 a 照射は4分間行いました。 b 照射は6分間行われました

さまざまな条件下でのMDA-MB-231細胞の明視野および蛍光画像。 a コントロール。 b レーザーのみ。 c 50μg/ mLFePt @ PPy NPs +レーザー。 d 70μg/ mLFePt @ PPy NPs +レーザー。 e 100μg/ mLFePt @ PPy NPs +レーザー。すべての溶液に1W / cm ² を照射しました。 6分間の808nmレーザー

a FePt @ PPyNPの注射前のヌードマウスの光学画像および対応するNIRサーモグラフィー画像。 b 左側：皮下注射したヌードマウスの光学画像。赤い破線の円は、注射の場所を示しています。右側：808 nmレーザー（1 W / cm ² ）を照射して6分後のヌードマウスのNIRサーモグラフィー画像 ）。最大加熱は注射部位に対応することに注意してください。 c 注射部位および808nmレーザー（1 W / cm ² ）を照射したマウスの皮膚表面の温度変化 ）6分間

PAIシステムの実験セットアップ

さまざまな濃度でのFePt @ PPy NPのPA応答の評価： a ファントムと b 対応するPA画像

純粋なFePt、PPy、およびFePt @ PPy NPのUV-Vis-NIR吸収スペクトルを図3に示します。複合ナノ粒子では、NIR領域での強い吸収が観察されました。 FePtとPPyの吸収スペクトルは、一緒にFePt @ PPyNPの吸収スペクトルに寄与する可能性があります。さまざまな濃度（20〜120μg / mL）のFePt @ PPy NP水性分散液の光学特性も、UV-Vis-NIR分光法によって記録されました。図4aにプロットされているように、FePt @ PPy NP濃度の増加に伴い、UV-Vis-NIR領域全体の光吸収強度が増加しました。

FePt @ PPyNPの光熱性能

純粋なFePtおよびFePt @ PPyNPの光熱挙動を図4で比較しました。固定FePt量の純粋なFePtおよびFePt @ PPy NPに、1 W / cm ^{の出力密度で808nmレーザーを照射しました。 2} 。 FePt @ PPy NPは、純粋なFePtNPと比較して優れた光熱挙動を示しました。このデータは、PPy層がシステム全体の光熱効果を高めたことを示しています。

図1と図2に示すように。 5a、同じNIRレーザー条件（5分、1 W / cm ² ） ）、20μg/ mlFePt @ PPy NPを含む溶液の温度は25から39.3°Cに上昇しましたが、120μg/ mlFePt @ PPyNPを含む溶液の温度はすぐに71°Cに達しました。さらに、サーモグラフィー画像（図5c）は、808nmレーザーで照射されたFePt @ PPyNPを含むサンプルの光熱効果的な変換を示しています。 FePt @ PPy NP（50μg/ mL）は、0.5、1.0、および1.5 W / cm ² のさまざまなレーザー出力密度でNIRレーザー照射にさらされました。 6分間で、結果の温度はそれぞれ41.1、51.3、59.4°Cでした。これらの実験結果は、曝露時間、ナノ粒子の濃度、およびレーザー出力強度が、FePt @ PPyNPの光熱性能に大きく影響する重要なパラメーターであることを明らかにしました。

FePt @ PPyNPの光熱安定性テスト

強力な光熱変換に加えて、ナノ粒子の光安定性はPTTで重要です。 50μg/ mLのFePt @ PPy NP溶液に、808 nmNIRレーザーを1.0W / cm ² で照射しました。 溶液が最高温度に達するまで、レーザーをオフにして自然に室温まで冷却します。加熱と冷却を6サイクル行った後、FePt @ PPy NPの熱曲線は各サイクルでほぼ同じままでした（図4d）。レーザー照射前後のUV-Vis-NIRスペクトルを図6cに示します。スペクトル全体で有意な変化は観察されませんでした。上記の結果は、長期間のNIRレーザー照射に対するFePt @ PPyNPの良好な光熱安定性を示しています。

長期ストレージテスト

調製したナノ粒子の粒子サイズとUV-Vis-NIR吸収スペクトルを、30日間の保管中に監視しました。まず、FePt @ PPy NPを含むすべてのソリューションで凝集は観察されませんでした（追加ファイル1：図S3a）。次に、120μg/ mL濃度の細胞培養培地中のFePt @ PPy NPは、30日間の保存後、UV-Vis-NIRスペクトル（追加ファイル1：図S3b）に有意な変化を示しませんでした。さらに、FePt @ PPy NPの平均粒子サイズは、長期保存中ほとんど変化しませんでした（追加ファイル1：図S3c）。上記のすべての結果は、調製されたナノ粒子の安定性を明らかに証明しました。

インビトロ細胞細胞毒性アッセイ

癌治療のために、ナノ粒子は優れた生体適合性を備えている必要があります。図7に示すように、MDA-MB-231乳がん細胞は、異なる濃度の純粋なFePtおよびFePt @ PPy NPで処理され、48時間インキュベートされました。テストした最高濃度（120μg/ mL）でもFePt @ PPy NPの有意な細胞毒性は観察されず、MDA-MB-231乳がん細胞の細胞生存率は95％を超えていました。純粋なFePtNPに対して、120μg/ mLの照射ナノ粒子は20％の癌細胞を殺しました。この結果は、PPy層のコーティングがFePt NPの生体適合性を改善し、FePt @ PPyNPは非毒性材料と見なすことができることを示しています。

セルラー取り込み

酸性溶液中の鉄とフェロシアン化カリウムの反応に基づくプルシアンブルー染色を実施して、FePt @ PPyNPの細胞取り込みを検出しました。追加ファイル1：図S2に示すように、ほとんどの細胞は細胞内で青い染みで染色されており、FePt @ PPyNPの細胞への取り込みを示しています。

インビトロ光熱療法

標準的なMTTアッセイは、MDA-MB-231乳がん細胞の殺傷能力に対する照射されたFePt @ PPyNPの有効性を評価するために実行されました。まず、がん細胞をさまざまな濃度のFePt @ PPy NPと24時間インキュベートし、次に1 W / cm ² の808nmレーザーに曝露しました。 4分間。図8に示すように、処理されたナノ粒子の濃度が増加すると、細胞生存率のパーセンテージは徐々に減少しました。照射されたFePt @ PPy NPの濃度が100μg/ mLの場合、細胞の約50％が死にました。より多くの癌細胞を殺すために、照射時間は最大6分に延長されました。 With 100 μg/mL concentration, approximately 70% of dead cells were observed. A comparison of the photothermal therapy performance between the proposed system and some reported nanoparticles was conducted in Additional file 1:Table S1. It is found that the proposed system shows comparable capability in killing cancer cells (i.e., 70% cell death) with quite low nanoparticle concentration (i.e., 100 μg/mL) under relatively weak power density condition (i.e., 1 W/cm ² ) and short irradiation time (i.e., 6 min).

In addition, by using the fluorescence imaging technique of five groups, we conducted experiments on the cancer cells to consider the killing capability of the prepared nanoparticles:the control groups (only cells), the laser-only group (cells were exposed to the 808-nm laser), the 50-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), the 70-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser), and the 100-μg/mL FePt@PPy NPs + 808-nm laser (cells were treated with 50-μg/mL of FePt@PPy NPs and exposed to the 808-nm laser).

Double staining of Hoechst 33342 and PI was used to explore the damaged and dead cells. Hoechst 33342 is a DNA dye, which can be permeable in both dead and viable cells [20]. The changes in the size and shape of nuclei of the Hoechst 33342 stained cells can be observed under fluorescence microscopy. With the apoptosis cells, Hoechst 33342 will make the condensed chromatin brighter than that in a normal cell. PI dye also binds to DNA, but it only permeates through the membrane of damaged and dead cells [21]. Thus, double staining can differentiate between dead cells and live cells by each treatment method.

As shown in Fig. 9, the cancer cells exposed to the NIR laser in the presence of the FePt@PPy NPs emit strong fluorescence, whereas the slight fluorescence is emitted by cancer cells in the absence of the nanoparticles. Only a few dead cells with the red nuclei were observed in the control and laser-only group (Fig. 9a, b). In contrast, many cells in the FePt@PPy NPs + 808-nm laser groups died and displayed red nuclei, as observed in Fig. 9c–e. After incubation for 24 h, some dead cells lost the binding ability and were washed out of the cell disk. Therefore, the intensity of cancer cells in the 100-μg/mL of FePt@PPy NPs + 808-nm laser group was less than the others. Conclusively, almost cancer cells which were treated with 100-μg/mL of FePt@PPy NPs was destructed after being exposed to the 808-nm NIR laser at a power density of 1.0 W/cm ² 。

In Vivo Laser Heating Experiment

The potential ability of FePt@PPy NPs for laser-induced heating was finally tested in an animal model. The nude mouse was subcutaneously injected with 100 μL of an aqueous FePt@PPy (100 μg/mL) NPs in PBS. Figure 10a presents the optical and NIR thermographic images of the nude mouse before injection, pointing out the temperature of mouse surface’s skin is about 36 °C. Fig. 10b (left side) shows an optical image of the mouse in which the injection site is indicated by a dashed red circle. The injected area was irradiated with the 808-nm laser at 1 W/cm ² for 6 min, and the NIR thermographic image of this mouse is shown in Fig. 10b (right side). The temperature of the skin’s surface was continuously monitored with an NIR thermographic camera. The time evolution of the surface temperature during the 6 min irradiation is shown in Fig. 10c, figuring out a temperature increment of the skin about 19 °C. From that, we can see clearly that the injected FePt@PPy NP area with laser irradiation produced a high temperature, as required for tumor ablation. Moreover, the heating area was found to be well localized at the injection site as shown in the NIR thermographic image (Fig. 10b, right side). Conclusively, with the excellent laser-induced heating properties, FePt@PPy could be a novel promising agent for photothermal therapy.

In Vitro Photoacoustic Imaging

The top-view image of the phantom filled with pretreated cancer cells is shown in Fig. 12a. The corresponding PAI acquired at the 808-nm laser from the sample in Fig. 12a is illustrated in Fig. 12b.

PAI is an emerging imaging modality and can be used to assist phototherapy [22]. All the samples containing pretreated cells were clearly visible, whereas the controlled samples with 4% gelatin did not produce any PA signal. The magnitude of the PA signal was increased when the concentration of nanoparticles increased. The ability to image FePt@PPy NPs inside phantom with the PAI system is very promising for image-guided photo-induced cancer therapy. The laser system for PAI, which was used in conjunction with FePt@PPy NPs, also showed the potential for future implementations.

Conclusions

In this study, we developed the photoabsorber FePt@PPy NPs and evaluated their efficiency on in vitro PTT and PAI (Scheme 2). The prepared FePt@PPy NPs showed many good properties for PTT and PAI including excellent biocompatibility, photothermal stability, and high NIR absorbance. Moreover, in vitro investigation confirmed the effectiveness of the FePt@PPy NPs in killing the cancer cells under the NIR laser. So far, the phantom test of PAI used in conjunction with FePt@PPy NPs showed a strong PA signal. Owing to their good properties, the novel FePt@PPy NPs could be considered as promising multifunctional nanoparticles for further applications in PTT and PAI.