異なる粒子サイズのアベルメクチンナノデリバリーシステムの製造、特性評価、および生物活性

背景

農薬は、植物の病気や害虫を防除し、国の食料安全保障を守るために重要です。ほとんどの従来の農薬製剤はオープンシステムであり、分散不良、有効成分の分解、液滴ドリフトなどの問題があります。農薬の有効成分の損失率は最大70〜90％です。これは、生分解、化学的分解、光分解、蒸発、表面流出、地下水の浸透によるフィールドスプレーの結果として発生します。これらはすべて、食品の安全性と環境への懸念を引き起こします[1、2]。したがって、農薬の散布と配送を改善することは、重要な研究トピックになっています[3,4,5]。

近年、ナノテクノロジーとナノマテリアルの開発により、農薬散布の効率を改善するための新しいアプローチが提供されています[6、7、8、9、10、11、12、13、14、15]。農薬のナノ粒子製剤は、ナノ粒子のサイズが小さく表面積が大きいため、葉の表面に農薬の空間分布を改善することが提案されており、効率が向上します[16、17、18、19]。農薬のナノデリバリーシステムは、農薬の有効成分を高分子ナノ材料の中に閉じ込めて、標的作物への有効成分のゆっくりとした制御された放出を可能にすることを含みます[20、21、22]。さまざまなポリマーの中で、ポリ乳酸（PLA）は、その非毒性、優れたバイオアベイラビリティと生体適合性、および食品医薬品局による人間への使用の承認により、多くの生物活性分子の徐放性ナノデリバリーシステムでナノ粒子担体として広く使用されています。 [23、24]。農薬の分野では、担体材料としてのPLAに関する研究は限られています。 PLAは、環境に優しく、低コストで、スケールアップが容易なため、農薬をカプセル化するための非常に有望なコーティング材料です。

農薬のナノデリバリーシステムはまた、標的の害虫と農薬粒子の間の接触面積を拡大します[25、26]。

アベルメクチン（Av）は、さまざまな農業害虫を防除できる、非常に効率的で広域スペクトルの安全な生物農薬です。 Avは光酸化により劣化しやすくなります。 Avはまた、水中での半減期が短く、フィールドアプリケーションでの害虫駆除に影響を与えます。 Avの有機炭素吸着係数は高い。これは、Avが有機物としっかりと結合し、土壌中の害虫駆除に影響を与えるため、Avが土壌中で容易に移動しないことを意味します。マイクロカプセル化技術によるAvの生物学的活性の保護に多くの努力が注がれています[27、28]。ただし、Avを含むマイクロカプセルのサイズを制御することは困難です。それらは一般に大きく、サイズは約1〜5 µmで、サイズ分布が広くなっています[29、30]。分散と均一性が悪いこと、およびサイズが大きいことは、葉の表面への農薬の付着を改善したり、有害な昆虫の透過性を高めたりするのに役立ちません。さまざまなサイズのAv用の農薬ナノデリバリーシステムの合成と生物活性については、限られた調査しか行われていません[31、32、33、34]。ナノマテリアルのカプセル化によってAvのナノデリバリーシステムを構築すると、その光安定性を大幅に改善し、土壌吸着やその他の悪影響を減らし、農薬の防除効果を向上させることができます。さらに、Avナノデリバリーシステムは、従来のマイクロカプセルと比較して、浸透性が高く、対象作物への有効成分の放出をより遅く、より制御することができます。

本研究は、PLAを使用した乳化重合によってAvナノデリバリーシステムのさまざまな粒子サイズを準備し、安全で生分解性の担体としての性能を特徴づけることを目的としました。 Avナノデリバリーシステムの放出特性と生物活性に対する粒子サイズの影響を調査しました[35、36、37、38、39]。活性物質とその前駆体の濃度、およびエマルジョンシステムの特性は、最終的なAvナノデリバリーシステムのサイズ分布を確立するための主要な要因です。 Avナノデリバリーシステムは、制御された粒子サイズ、高いAv負荷、効果的なサイズ制御と徐放性、および優れた紫外線（UV）シールドと安定性を備えた良好な粒子分散を示しました。

実験的

資料

PLAとAvは、それぞれNatureWorksとQiluPharmaceutical Co.、Ltd。（内モンゴル、P。R。中国）から提供されました。ポリビニルアルコール（PVA）、平均M _w で87〜90％加水分解 30,000〜70,000ドルは、Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co.、Ltd。（上海、中華人民共和国）から購入しました。ゼラチンはSinopharmChemical Reagent Co.、Ltd。（北京、中華人民共和国）から購入しました。透析膜はBeijingTianan Technology Co.、Ltd。（中華人民共和国）から購入しました。その他の化学試薬は分析グレードであり、Beijing Chemical Works（北京、中華人民共和国）から購入しました。すべての実験で使用された水はMilli-Qグレード（18.2MΩcm、TOC≤4ppb）であり、Milli-Q Advantage A10システム（Millipore、米国マサチューセッツ州ミルフォード）から入手しました。

アベルメクチンナノデリバリーシステムの準備

Avナノデリバリーシステムは、超音波およびせん断物理乳化プロセスと組み合わせた水中油型（O / W）エマルジョン法によって調製されました。簡単に説明すると、PLAとAvを油相として塩化メチレンに溶解しました。水相では、ゼラチンを40°Cの水に溶解し、PVA水溶液と混合しました。次に、油相を高剪断乳化（ＦＡ２５、ＦＬＵＫＯ、Ｒｕｈｒ－ｇｅｂｉｅｔ、ドイツ）下で大量の水相にゆっくりと滴下して、粗いエマルジョンを調製した。次に、粗いエマルジョンを超音波乳化（JY 92-IIN、SCIENTZ、寧波、中華人民共和国）によって均一に分散させました。次に、均一なエマルジョンを一晩磁気撹拌下で固化させた（ＲＷ２０、ＩＫＡ、シュタウフェン、ドイツ）。硬化したAvナノデリバリーシステムを遠心分離によって収集し、脱イオン水で3回洗浄しました。遠心分離により生成物を収集し、次に凍結乾燥（FD-81、EYELA、東京、日本）して、自由流動性の粉末を得た。乾燥した粉末は使用するまで4℃で保存しました。

ナノデリバリーシステムの特性評価

各Avナノデリバリーシステムの形態は、5 kVの加速電圧で走査型電子顕微鏡（SEM、JSM-6700 F、JEOL Ltd.、昭島市、日本）によって調査されました。 ＳＥＭサンプルは、シリコンスライスの表面に滴下して堆積された。液滴を室温で乾燥させた後、スパッタコーター（EM ACE600、ライカ、ウィーン、オーストリア）を使用して白金の薄層でコーティングし、SEM観察中の帯電を防止しました。 Avナノデリバリーシステムの粒子のサイズは、ゼータサイザー（Zetasizer NanoZS90; Malvern、Worcestershire、UK）を使用したレーザー散乱によって25°Cで測定されました。

ナノデリバリーシステムでのアベルメクチン負荷の測定

ナノデリバリーシステムのAvの量は、紫外可視（UV-vis）分光光度計（TU901、島津製作所、京都、日本）を使用して、波長245nmで測定されました。詳細には、Avをロードした試料を秤量し、クロロホルムに一晩溶解させた後、減圧蒸留により溶液を乾燥させた。次に、メタノールを加えて、乾燥した沈殿物からAvを溶解させた。最後に、混合物をろ過して透明な溶液を生成し、UV-vis分光光度法で分析しました。

ナノデリバリーシステムからのアベルメクチンの制御放出

異なるサイズのナノデリバリーシステムからのAvの放出プロファイルを以下のように調査した。各サイズのAvナノデリバリーサンプルを10mLのエタノール/水混合物（1：1、 v ）に懸濁しました。 / v ）。次に、懸濁液を透析バッグに移し、90 mLのエタノール/水混合物（1：1、 v ）を入れた茶色のフラスコに密封しました。 / v ）放出媒体として。フラスコをインキュベーターシェーカー内で300rpm、室温でインキュベートしました。定義された時間間隔の後、5.0 mLの溶液が除去され、5.0mLの新しい溶媒と交換されました。ナノデリバリーサンプルからのAvの放出速度は、放出媒体に溶解したAvの濃度をさまざまな間隔で測定することによって計算され、徐放性を評価するために使用されました。 Avの濃度は、波長245nmでUV-vis分光光度計を使用して測定しました。テクニカルアバメクチン（TC、テクニカルグレードの有効成分）をコントロールとして使用しました。

ナノデリバリーシステムにおけるアベルメクチンの光分解挙動

ナノデリバリーシステムにおけるAvの光分解挙動は、コントロールとして市販のAvWDGを使用して評価されました。サンプルをメタノール/水に溶解しました（1：1、 v / v ）、培養皿に均等に分割し、得られたサンプルを、波長365 nmで最大強度のUVランプ（500 W）の下で25°Cで必要な時間照射しました。指定された時間間隔（12、24、36、48、60、および72時間）で、培養皿をリアクターから取り出し、サンプルのAv濃度を分析しました。

安定性テスト

Avナノデリバリーシステムの安定性は、CIPAC MT46およびGB / T 19136–2003に従ってテストされました。サンプルをガラス管に詰め、0±2°Cで7日間、54±2°Cで14日間保存しました。次に、ナノデリバリーシステムのAv量の変化を調べました。

バイオアッセイ

さまざまなサイズのAvナノデリバリーシステムのバイオアッセイは、リーフディップ法を使用して実施されました。サンプルは、さまざまなAv濃度のTritonX-100水溶液で希釈されました。キャベツ（ Brassica oleracea L.）葉を希釈したAv懸濁液に浸し、室温で乾燥させ、ペトリ皿に取り付けた。アブラムシの幼虫を各皿に入れ、処理したアブラムシを25°C、相対湿度75％のインキュベーターで培養しました。対照試験と比較するために、4回の反復を実施しました。死亡率は、治療後48時間で評価されました。濃度-死亡率データは、DPSv12.01統計ソフトウェアを使用して分析されました。致死濃度の中央値（LC ₅₀ ）およびそれらの95％信頼限界が計算されました。コントロールとして市販のWDGを使用しました。

結果と考察

アベルメクチンナノデリバリーシステムの構築と特性評価

Avナノデリバリーシステムは、図1に示す手順に従って構築されました。プロセス中に、水相と油相は上記の方法に従って準備されました。油相を高剪断乳化により水相（水中油型エマルジョン）に乳化し、粗いエマルジョンを調製した。次に、コースエマルジョンを超音波乳化によって均一に分散させた。これに続いて、得られたナノ粒子を攪拌、蒸発、および遠心分離した。デリバリーシステムの粒子サイズは、農薬の放出特性と生物活性に影響を与える最も重要な要因の1つです。図2に示すように、粒子サイズが344〜827 nmのAvナノデリバリーシステムは、合成パラメータを制御することによって構築されました。粒子サイズは、農薬の制御放出特性の重要なパラメーターです。 Avナノデリバリーシステムの粒子サイズは、PVA /ゼラチン濃度比を変更することで制御できます。図3に示すように、さまざまなAvナノデリバリーシステムが、サイズが344〜827 nm、Av含有量が33.4〜57.5％（33.4、44.9、45.2、および57.5％）で準備されました。すべてのAv製品は滑らかでした。表面と球状粒子の形態。

Avナノデリバリーシステムの準備を示す概略図

SEM画像（ a – d ）およびサイズ分布（ e ）さまざまな粒子サイズのAvナノデリバリーシステムの

さまざまな粒子サイズのAvナノデリバリーシステムにおけるAvの量

インビトロでのナノデリバリーシステムからのアベルメクチン放出

近年、農薬放出システムの開発は、以前の低速で定性的な放出システムとは対照的に、正確で定量的な放出に移行しています。制御可能な放出を達成するために、さまざまな粒子サイズのAvナノデリバリーシステムの放出プロファイルを体系的に調査しました。図4は、同じ時間間隔後の、粒子サイズが異なるナノデリバリーシステムからのAvの放出率を示しています。テクニカルAvのリリースレートは速く、25時間後にほぼ完全にリリースされました。農薬の持続性の有効期間は、長期間有効性を維持するために農薬の持続放出を必要とします。技術的なアバメクチンのバースト放出と比較して、準備されたすべてのナノデリバリーシステムは比較的遅い速度でAvを放出し、長期間持続放出を維持しました。ナノデリバリーシステムからのAv放出プロファイルは、バースト放出とそれに続く実験の240時間の時間枠にわたる段階的放出で構成されていました。配信システムのサイズが827nmから344nmに減少すると、240時間後に累積リリースが53.2％から79.4％に増加しました。結果は、ナノデリバリーシステムからのAv放出速度が粒子サイズの減少とともに徐々に増加することを示した。これは、より高い表面積が周囲にさらされ、ナノデリバリーシステムのシェルにある農薬の浸透と流出を助けるためでした。結果は、ナノデリバリーシステムからのAv放出速度が粒子サイズを変更することによって効果的に制御できることを示しました。

エタノール/水中での粒子サイズが異なるAvナノデリバリーシステムの放出挙動（50：50、 v / v ）200時間以上

生物活性

アブラムシに対するさまざまな粒子サイズのナノデリバリーシステムから放出されたAvの生物活性を図5に示します。LC ₅₀ Avナノデリバリーシステムの粒子サイズの減少に伴い、徐々に減少しました。ナノエマルジョンのバイオアベイラビリティは、粒子サイズが小さく、表面積対体積比が高いため、従来のエマルジョンよりも高いと報告されています。したがって、より小さな粒子サイズのAvナノデリバリーシステムのより高い生物活性は、小規模な効果によって引き起こされる分散性、湿潤性、および保持の増加に起因していました。すべてのAvナノデリバリーシステムのLC ₅₀ は低かった 価値と商用AvWDGよりも高い活動。高い効果は、ナノサイズの粒子が作物の表面へのAv農薬の付着と浸透を促進し、噴霧中の漏れによる農薬の損失を減らすことによるものでした。

異なる粒子サイズのAvナノデリバリーシステムのバイオアッセイ結果

ナノデリバリーシステムにおけるアベルメクチンのUVシールド特性

ナノデリバリーシステムにおけるAvのUV遮蔽特性を検証するために、Avの光分解速度を人工照射によって推定しました。照射時間によるAvの光分解速度の分析を図6に示します。48時間後のアバメクチンの光分解率は、ナノデリバリーシステムで18.7％、市販のAv WDGで46.7％でした。 72時間後、アバメクチンの光分解率は、ナノデリバリーシステムで25.6％、市販のAv WDGで51.5％でした。これらの結果は、壁担体の保護効果のために、ナノデリバリーシステムがAvの光分解の抑制を示したことを示しました。

UV照射下での市販のWDGおよびナノデリバリーシステムとのAv光分解率の比較

ストレージの安定性

さまざまな粒子サイズのAvナノデリバリーシステムの安定性は、0、25、および54°Cの温度での負荷量を測定することによって評価されました。図7は、ナノデリバリーシステムが安定しており、室温および低温での保管中にAv負荷に大きな変化がないことを示しています。高温でのAvの劣化により、54°Cで14日後にAvのわずかな損失が観察されました。これらの結果は、Avナノデリバリーシステムの保存安定性が良好であることを示しています。

さまざまな保管温度でのAvナノデリバリーシステムの安定性

結論

Avの制御放出、化学的安定性、および生物活性を改善するために、乳化重合法を使用して、平均粒子サイズが異なるAvナノデリバリーシステムを合成しました。 Avナノデリバリーシステムは一貫した放出挙動を示しました。ナノデリバリーシステムからのAv放出速度は、表面積が大きいため、粒子サイズが小さくなるにつれて徐々に増加しました。 Avナノデリバリーシステムの生物活性は、接着性と浸透性が向上したため、粒子サイズが小さくなるにつれて徐々に増加しました。 Avナノデリバリーシステムは、優れた光分解防止特性と安定性を示しました。デリバリーシステムは、環境感受性、望ましくない土壌吸着、短い活動時間など、現在の生物農薬の欠点を克服します。これにより、農薬の有効性が向上し、必要な散布頻度が減少します。