半導体ナノ結晶でコード化された高分子電解質マイクロカプセルに基づく次世代セラノスティック剤：開発と機能特性評価

結果と考察

炭酸カルシウム微粒子の合成と特性評価

基質としての球状無機結晶、特に炭酸カルシウムマイクロスフェロライトの使用は、それらの生体適合性、ならびに生体系に攻撃的な溶媒を使用せずに高分子電解質マイクロカプセルの形成の過程でそれらを除去する可能性によって決定されます。炭酸カルシウム微粒子自体は、放出が変更または延長された薬物送達システムとしても使用でき、薬物をロードし、微小環境への放出を制御するためのマトリックスとして機能します。つまり、送達システムで複数の潜在的な用途があります[36,37 、38,39,40,41,42,43,44,45,46]。

微結晶のサイズと形状を決定する重要な要因は、攪拌の速度と持続時間、および反応混合物のインキュベーション時間です[33、41]。最適なサイズ分布の炭酸カルシウムマイクロスフェロライトを得るための条件を実験的に決定しました。単一のCaCO ₃ 微粒子はほぼ規則的な丸みを帯びた形状をしていることがわかっています。追加ファイル1：図S2は、さまざまな攪拌速度で得られた炭酸カルシウム微粒子のサイズ分布を示しています。これらのデータからわかるように、粒子のサイズの不均一性は、攪拌速度の増加とともに増加しました。攪拌速度が250rpmの場合、得られた粒子のサイズは4.0〜6.0μmの範囲でした。この場合、サンプル内のすべての微粒子は分離しており、それらのサイズ分布は通常に近いものでした（追加ファイル1：図S2a）。ただし、混合物を500 rpmで攪拌すると、小さな粒子の集合体である不規則な形状の粒子が観察されました。個々の粒子の平均サイズは2.7〜5.6μmです（追加ファイル1：図S2b）。 750 rpmの攪拌速度では、粒子サイズのばらつきが増加しました。このサンプルには、3.8〜5.7μmの範囲の個々の微粒子の平均サイズを持つ不規則な形状の凝集体も含まれていました（追加ファイル1：図S2c）。

したがって、250 rpmの速度で反応混合物を攪拌することにより、最適なサイズ分布とほぼ規則的な形状の粒子を得ることができ、粒子の凝集を防ぐことができました。したがって、この攪拌速度での微粒子サイズ分布に対する攪拌時間の影響を推定しました（追加ファイル1：図S3）。反応混合物を15秒間攪拌すると、30秒間攪拌した場合と比較して、より大きな粒子の数が増加しました。攪拌時間を60秒に増やすと、同様の効果がありました。つまり、前者の場合（追加ファイル1：図S3a）は攪拌時間が不十分であり、後者の場合（追加ファイル1：図S3c）は攪拌時間が長すぎました。したがって、250rpmの速度と30秒の持続時間が最適な攪拌条件であると考えました。

走査型電子顕微鏡（SEM）データによると、炭酸カルシウム微粒子の表面は不均一であり、多孔性が特徴です（図1a）。 ×40,000の倍率で、微粒子がより小さなサブマイクロメートルの粒子によって形成されていることがわかりました（図1b）。したがって、得られた微粒子は多孔質構造を有し、基板として適切であるだけでなく、それ自体を送達システムとしても使用でき、それらの特定の表面構造のために層ごとのマトリックスとして容易に使用できる代表的なマトリックスを有した。ポリマーの堆積。

炭酸カルシウム微粒子の走査型電子顕微鏡写真（ a ）およびより高い倍率でのそれらの表面（ b ）

量子ドットでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルの調製と特性評価

調製された水溶性QDは、最大590 nmの発光を持つ広い吸収スペクトルと狭い蛍光スペクトルによって特徴づけられました（図2）。これらのQDサンプルの流体力学的直径は、23.96〜28.2nmの範囲でした。追加ファイル1：図S4は、HS-（PEG） ₁₂ で安定化されたQDのサイズ分布を示しています。 −COOH。 HS-（PEG） ₁₂ によるQD表面の修飾 −COOHは、水相でのQDの安定性と、エンコード手順中に正に帯電した高分子電解質層間でQDを効果的に吸着するのに十分な表面の負電荷を保証しました[22、47]。

HS-（PEG） ₁₂ で可溶化されたCdSe / ZnSコア/シェル量子ドットの光学特性 −COOHリガンド

高分子電解質層とQDの堆積の各ステップで測定された炭酸カルシウム微粒子サンプルの表面電荷値（表1）により、元のマトリックスの表面電荷、可溶化されたQD、および各ポリマーの堆積後の表面電荷が確認されました。後続の各層を効果的に吸収するには十分です。

合成炭酸カルシウム微粒子の固有の表面電荷と多孔質表面構造により、反対に帯電した高分子電解質とQD堆積のマトリックスとして使用できました（図3）。 QDでエンコードされた高分子電解質ポリマーマイクロカプセルへのPAHおよびPSSポリマーの適用は、生体適合性と非毒性、さらにはシェル内にQDを保持するのに役立つ非生分解性によって決まります。高分子電解質マイクロカプセルの形成にも広く使用されているポリ-l-アルギニン、ポリ-l-リジン、キトサン、アルギン酸ナトリウム塩、および硫酸デキストランの生分解性は、高分子膜からのQD拡散を誘発し、その結果、減少するはずです。微粒子の蛍光特性の分析[3、11、39、48、49、50、51、52]。この研究で使用されたPAHポリカチオンとPSSポリアニオンは、それぞれアミン基と硫酸基を含み、ポリマー層間の静電相互作用を保証します。これにより、ポリマー間複合体が形成されます[16、25、36、37]。最初のポリマー層の選択は、合成された炭酸カルシウム微粒子の表面電荷値によって決定されました。

量子ドットでエンコードされたマイクロカプセルの準備手順：マトリックス表面でのポリカチオン（1）とポリアニオン（2）、それぞれPAHとPSS高分子電解質の層の形成。得られた微粒子を量子ドットでエンコードし、さらに層ごとにポリマーを堆積させます（3）。炭酸カルシウムコアの除去（4）

図4は、基板表面でのポリマーシェル形成の段階のSEM画像を示しています。顕微鏡写真に見られるように、微粒子は炭酸カルシウム粒子のコアとシェルを含み、それは吸着されたポリマー層の数が増えるにつれてより明確になった。高分子電解質層でコーティングされた微粒子の表面は、その特徴的な均質性を備えた基板の形状に従い、多孔性であることを示唆しました（図4a、b）[44]。ポリマーシェルが厚くなると、微粒子の表面はより均一で滑らかになりました（図4c、d）。

4つの（ a ）の適用後の炭酸カルシウム微粒子の走査型電子顕微鏡画像 、 b ）と10（ c 、 d ）高分子電解質層

QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルの準備の最終ステップには、炭酸カルシウムコアの除去とマイクロカプセルの最終構造の形成が含まれていました。炭酸カルシウム粒子からなるマトリックスを溶解するために、微粒子をEDTAで洗浄した。 EDTAが使用された主な理由は、カルシウムを含む2価金属の塩と相互作用すると水溶性複合体を形成し、その低分子量によりEDTAの高分子電解質シェルの透過性とCa ²⁺ との複合体形成が保証されるためです。 。これにより、高分子電解質粒子のコアが溶解し、中空構造が形成されます[45、46]。

私たちの研究で得られたQDでエンコードされた微粒子と高分子電解質マイクロカプセルは、球形またはほぼ球形で、サイズは3.8〜6.5μmでした（図5）。蛍光モードでの微粒子とマイクロカプセルの形態と構造の分析は、高分子電解質マイクロカプセル内の空洞を示しました。これは、微粒子と比較して透明度が高いことから明らかです（図5b）。これは、EDTAによるコア溶解の手順が効果的であることを示しました。共焦点顕微鏡データは、得られた蛍光高分子電解質マイクロカプセルの中空構造も示しました（図6）。これらのマイクロカプセルは単一粒子として区別でき（図6a、b）、BSAコーティングによる表面改質により、表面が粗い球状粒子として特徴付けることができます。

高分子電解質でコーティングされ、量子ドットでエンコードされた炭酸カルシウム微粒子の蛍光顕微鏡画像（ a ）およびそれらから得られた高分子電解質マイクロカプセル（ b ）

量子ドットでエンコードされ、BSAでコーティングされた高分子電解質マイクロカプセルの共焦点顕微鏡画像：マイクロカプセルの断面（ a ）;単一の高分子電解質マイクロカプセルの3D投影（ b ）

エンコーディング効率の見積もり

符号化の効率は、微粒子の正に帯電したポリマー表面に吸着された量子ドットの量によって推定されました。微粒子のコード化に使用された元の溶液およびQD溶液との微粒子のインキュベーションの前後の上清中のQDの量の推定は、微粒子表面に結合したQDの数が、反応混合物中のQD含有量の増加とともに直線的に増加することを示しました。 0.36〜2.241 mg（図7a）。溶液中のQDの量をさらに増やすと、吸着されたQDの数が減少しました。これは、QDの量が多すぎて、結果として表面が飽和するために、微粒子表面のPAHのアミン基によって決定される正電荷の密度が不十分であることが原因である可能性があります。明らかに、QDの量が2.241 mg未満の場合、立体的に良好な条件と相互の付着との干渉が少ないため、QDはより効率的に吸着されました。エンコーディングに使用されるソリューションのQDコンテンツに対するエンコーディング効率の依存性のパターンは、以前のデータ[22]と一致しています。

量子ドットの量が異なる微粒子のエンコード効率の推定（ a ）およびそれらの蛍光特性（ b ）。アスタリスクは、QDでエンコードされたマイクロビーズとQDでエンコードされたマイクロカプセルの有意差を示します（ p <0.05）

得られた高分子電解質マイクロカプセルの光学特性の推定は、符号化効率の評価の重要な段階です。その結果は、与えられた技術が、QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルに基づく造影剤の製造にどれほど適しているかを示しています。

図7bは、微粒子とマイクロカプセルの蛍光強度を、それらをエンコードするために使用されるQDの量に応じて、灰色の平均正規化強度として測定したものを示しています。図からわかるように、コード化された微粒子の蛍光強度は、それらから得られたマイクロカプセルの蛍光強度よりも高かった。同時に、異なる量のQDでエンコードされたマイクロカプセルは、蛍光強度（ p ）において互いに有意差はありませんでした。> 0.05）。マイクロカプセルの蛍光強度は多少低下しますが、上記のQDの量でエンコードすることにより、効果的なイメージングに十分なコントラストが保証されます。

エンコードされた高分子電解質マイクロカプセル内の量子ドット蛍光寿命

上記のように、高分子電解質マイクロカプセルの蛍光強度は、それらの製造に使用され、同じ量子ドットでコード化された微粒子と比較して減少した。したがって、元のQDと、マイクロ粒子またはマイクロカプセルのポリマー壁に埋め込まれた同じQDの両方の蛍光寿命を推定しました。

QD蛍光動態曲線（図8）は、次の式に従って、時間に対する蛍光強度の単指数関数的依存性を特徴としています。

製造された微粒子とマイクロカプセルに組み込まれた590nmに蛍光ピークを持つ可溶化CdSe / ZnS量子ドットの蛍光寿命

ここで私 （ t ）は、励起パルスと A に応答するQD蛍光の強度です。 ₁ 、х 、および t ₁ 時間の経過に伴う強度の変化を表すパラメータです。

各サンプルの蛍光寿命を決定しました（表2）。元の可溶化QDの蛍光寿命は最長でした。 QDが微粒子に吸着され、ポリマーシェルの構造に組み込まれた後、それは減少しました。これは、以前に[22]で見つけたように、QDとPAHの間の相互作用に起因している可能性があります。マイクロカプセルの場合、QD蛍光寿命は、マイクロカプセルが製造された微粒子内のQDと比較してさらに減少する傾向がありました。この減少の考えられる原因は、マイクロカプセルの製造に伴う技術的要因、すなわち、コアの溶解とそれに関連する必要な洗浄回数の増加でした。

マイクロカプセルの製造後、蛍光寿命も時間とともに減少する傾向があることに注意する必要があります。ただし、マイクロカプセルの製造から48時間後以降、平均蛍光寿命のそれ以上の変化は重要ではありませんでした。蛍光減衰は、カプセルのシェルに埋め込まれたQDの蛍光量子収率の低下によって明らかに引き起こされました。この効果は、コア除去後のポリマーシェルの内層における電子ポテンシャルの分布の変化とQDの幾何学的再配列に起因する可能性があり、隣接する電荷移動による非放射再結合の可能性が高まりました。 QDまたはQDとポリマー分子の間[22]。

量子ドットの相互作用- 食細胞を含むコード化高分子電解質マイクロカプセルinvitro

共焦点顕微鏡を使用して、QDでエンコードされた高分子電解質マイクロカプセルと生きている食細胞との相互作用、細胞によるそれらの取り込み、および細胞標識の可能性を分析しました。マウス肺胞マクロファージ（MH-S）細胞は、異種物質を貪食する能力があるため、モデルとして使用されました。

MH-S細胞は約1.2×10 ⁶ で処理されました 短期（4時間）または長期（24時間）のインキュベーションによるQDエンコードマイクロカプセルの分析。どちらの場合も、マイクロカプセルの一次取り込みの兆候が観察されました。短期および（図9a–d）長期インキュベーション（図9e–h）の後です。高分子電解質マイクロカプセルまたはそれらの集合体は緑色で見ることができた。マイクロカプセルは、細胞の外部環境とMH-S細胞の内部の両方で明確に区別でき、遠赤色DNA染色DRAQ5によって染色されたMH-S細胞のマイクロカプセルと核の間の距離によって証明できます。すべての顕微鏡写真で赤い球形の物体として見られます。個々のマイクロカプセルとして、およびそれらの集合体として、取り込みプロセスを受けることが検出された。マイクロカプセルが細胞内環境にあるか、少なくともマクロファージの表面に付着しているという事実は、核と高分子電解質マイクロカプセルの間の明確に区別された短い距離によって確認されます（図9b、d、g、h）。図9gでは、マクロファージの細胞質膜の残留染色境界がはっきりと見られます。これは、効果的な取り込みを示しており、よく識別できるマイクロカプセルは、細胞内のいずれかの表面に付着していることを簡単に検出できます。

BSAでコーティングされたQDエンコード高分子電解質マイクロカプセルで処理されたMH-S細胞の共焦点画像。上の行は、4時間の短期間のインキュベーション後のサンプルの画像を示しています。マイクロカプセルは白い矢印で示されています（ a – d ）。下の行は、24時間の長期インキュベーション後のサンプルの画像を示しています。マイクロカプセルは白い矢印（ e ）で示されています – h ）。マクロファージの核は、遠赤色のDNA染色DRAQ5で対比染色されました

短期間のインキュベーション中に、単一のマイクロカプセルが、微粒子の集塊の前にMH-S細胞によって貪食されることが見出された。長期間のインキュベーション（24時間）後、取り込みプロセスを経て細胞内にあるか、少なくとも細胞表面に付着した高分子電解質マイクロカプセルの集塊の量は、短期間のインキュベーション後よりも有意でした。したがって、この研究で得られた高分子電解質マイクロカプセルは、生細胞のイメージングと追跡のための有望なツールとして使用されました。

結論

私たちの研究は、最適化された蛍光特性と狭いサイズ分布を備えた安定したQDエンコード高分子電解質マイクロカプセルの製造の実現可能性を実証しました。水溶性で安定化された3官能性ポリエチレングリコール誘導体コア/シェルQDをマイクロカプセルのポリマー壁に組み込む技術と、実験手順の各段階での詳細な特性評価により、マイクロカプセルの効率的な蛍光エンコーディングが保証されました。マウスマクロファージによる開発されたQDエンコードマイクロカプセルの効率的な細胞内取り込みが実証され、生細胞イメージングおよび生細胞内でのマイクロカプセルの輸送と送達の視覚化のための開発されたシステムの効率的な使用の可能性が確認されました。

略語

EDTA：

エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム

PAA：

ポリアクリル酸

PAH：

ポリカチオンポリ（アリルアミン塩酸塩）

PEG：

ポリエチレングリコール

PSS：

ポリアニオンポリ（4-スチレンスルホン酸ナトリウム）

QD：

量子ドット

RPMI培地：

ロズウェルパーク記念研究所培地

SEM：

走査型電子顕微鏡

TOPO：

トリオクチルホスフィンオキシド