吸入された多層カーボンナノチューブが血圧と心臓機能に及ぼす影響

背景

潜在的な幅広い産業用途と生産の増加に伴い、多くの産業部門でナノマテリアルへの曝露の可能性が高まっています。したがって、ナノマテリアルへの曝露による健康への悪影響が大きな注目を集めています。動物実験では、人工ナノ粒子への短期間の肺曝露は、試験したナノ材料の物理的および化学的特性に応じて、肺に重度または軽度の炎症反応を引き起こす可能性があることが示されました。さらに、カーボンナノチューブ（CNT）への肺への曝露は、肺線維症と癌の促進に関連しています[1,2,3,4,5]。ナノマテリアルへの職業的曝露に最近重点が置かれているが、心血管系ではなく肺疾患と発癌に焦点が当てられているが、疫学的および最近の動物研究からの証拠は、ナノ材料への肺曝露がナノ粒子誘発性炎症、転座によって心血管系に影響を与える可能性があることを強く示している、および/またはニューロンの調節[6,7,8,9]。私たちの研究では、超微細二酸化チタン（UFTiO ₂ ）および多層カーボンナノチューブ（MWCNT）は、肺に軽度の急性炎症反応を引き起こす用量で、末梢ニューロンの神経伝達物質合成を一時的に増加させ[8]、自律神経系の活動に変化をもたらす可能性があります（ ANS）[10]。さらに、我々は以前に、単離された心筋細胞のUFTiO ₂ への直接曝露についても報告しました。 心筋細胞の生物学的活性を変化させなかった[11]。まとめると、私たちの研究は、肺にわずかな急性効果を示す用量のいくつかのナノ材料が、ナノ粒子の心臓への直接転座ではなく、神経系に影響を与えることによって心血管系に影響を与えることを強く示唆しました。

ANSは、正常な心血管機能を維持する上で重要な役割を果たします。 ANS障害は、心血管系の機能障害を引き起こす可能性があり、高血圧、脳卒中、または心不整脈を引き起こす可能性があります[12、13、14、15]。疫学研究は、吸入されたナノ粒子が心血管後遺症を誘発する可能性を支持しています。たとえば、わずか数時間の粒子状大気汚染の吸入は、人々、特に既存の心血管状態の人々のANSバランスを変化させることにより、心血管疾患に関連する死亡率と罹患率を増加させました[16]。疫学研究はまた、超微粒子（UFP）が粒子状大気汚染の心臓血管への影響に大きく寄与する可能性があることを示しています。これは、UFPの肺胞沈着が微粒子よりも比較的効率的であることが一因です[17]。伝導性気道に沈着するより大きな空中浮遊粒子は、肺クリアランスの主要なメカニズムである粘液線毛エスカレーターによって迅速に除去することができます。ただし、ナノサイズの粒子は、この最初の防御システムをバイパスし、気管と肺に深く浸透して、感覚ニューロンの終末を持続的に刺激する可能性があります。吸入されたMWCNTが心拍変動（HRV）を大幅に変化させることを以前に示しました[10]。本研究では、ラットモデルを使用して、MWCNTへの肺曝露が心血管系の機能に及ぼす影響をさらに解明し、これらの変化をANSの活動と相関させました。

メソッド

動物

Hilltop Lab Animals（Scottdale、PA、USA）のオスのSprague-Dawley（Hla：（SD）CVF）ラット、体重275〜300 g、ウイルス性病原体、寄生虫、マイコプラズマ、ヘリコバクターおよび繊毛関連呼吸器（CAR）を含まないバチルスはすべての実験に使用されました。ラットは到着後1週間順応させ、温度と湿度を制御し、12時間の明期と12時間の暗期のサイクルでフィルタートップケージに収容しました。食料（Teklad 7913）と水道水は自由に与えられました。動物施設は特定病原体除去され、環境管理されており、国際実験動物管理協会（AAALAC）の認定を受けています。研究中に使用されたすべての動物の手順は、国立労働安全衛生研究所の動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されています。

肺MWCNT吸入暴露

MWCNTは、Hodogaya Chemical Company（MWCNT-7、ロット番号061220-31）から入手しました。オスのSprague-Dawleyラット（250〜300 g）をMWCNTエアロゾル（5 mg / m ³ ）に曝露しました。 ）5時間。ラットは、静水圧フレキシブルチューブを介してメイン露光チャンバー（この研究では混合チャンバーとして使用）に接続された密閉ケージに個別に配置されました。 Gilian gilair-5 Rベーシックエアサンプリングポンプ（Sensidyne、St。Petersburg、FL 33716 USA）を密閉ケージに取り付け、MWCNTのエアロゾルをメインの曝露/混合チャンバーまたはろ過された空気（コントロールグループ）から密閉ケージに引き込みました。 1.25 l / minの流量で。密閉ケージ内のMWCNTエアロゾルの粒子質量分布は、カスケードインパクター（MOUDI、モデル110および115、MSP Co.、ミネソタ州ショアビュー）によって決定されました。 MWCNTの質量濃度は、テフロンフィルターを使用した物理的重量分析によって決定されました。エアロゾル生成システム、曝露チャンバー、およびMWCNTエアロゾルの物理的特性は、他の場所で説明されています[10、18、19]。 1.5または2.7％の沈着率と186 ml / minの平均分時換気量を使用して[5]、私たちの曝露スキームでの総肺負荷は5 mg / m ³ として計算されます。 （曝露濃度）×186 ml / min（分時換気量）×10 ^{− 6} m ³ / ml（体積変換）×300分（曝露時間）×1.5または2.7％（肺胞沈着率）。これは、ラットのMWCNTの4.2または7.5μgにほぼ相当します。労働者が40μg/ m ³ のレベルでMWCNTに曝露した場合、同じ肺負荷に達するのに14〜25日しかかかりません。 、これは実行可能な人間の職業被ばくです[19、20]。

テレメトリ送信機の埋め込み

手術前は、ラットを別々に静かに保ち、苦痛を避けるために穏やかに扱った。手術器具と消耗品はオートクレーブ処理され、無菌操作が外科手術全体で使用されました。麻酔は、誘導チャンバー内で3％イソフルランと1 l /分の酸素で誘導され、手術中は2％イソフルランと1/2リットル/分の酸素で維持されました。温度制御された加熱パッドを使用してラットの正常な体温を維持し、これを手順全体を通して肛門プローブを介して監視した。心肺反応は、麻酔の適切な深さを決定するために、脊髄反射とともに術中モニタリング技術として調べられました。切開部位を切り取り、次にポビドンヨード、続いて70％アルコールで無菌的に調製した。正中線の腹部切開を行い、滅菌綿棒を使用して腹部大動脈を露出させた。遠隔測定送信機（HD-S21、Data Sciences International、セントポール、MN）の圧力カテーテルを腹部大動脈に挿入し、上流に誘導しました。組織接着剤（Vetbond、3M Animal Care Products、ミネソタ州セントポール）を使用して、カテーテルを固定し、止血を行いました。遠隔測定装置の本体は、切開の左側の腹壁の下に配置され、4–0の非吸収性縫合糸（Surgical Specialties Corporation、ペンシルベニア州ワイオミッシング）を使用して腹筋に縫合することによって所定の位置に固定された。術後ケアには、5 mg / kgのメロキシカム（Metacam、Boehringer Ingelheim Vetmedica、Inc。、ミズーリ州セントジョセフ）を1日1回、4日間皮下投与しました。ラットの全身状態、体重、および食物と水の消費量を綿密に監視した。ラットは、データ取得と吸入暴露の前に3週間の回復期がありました。

InVivo血行動態測定

MWCNTへの曝露後のドブタミンに応答した左心室機能は、麻酔をかけたラットの左心室に配置された圧力-体積ループカテーテルによって評価されました。暴露後1日と7日目に、ラットを誘導チャンバー内で毎分2リットルの酸素を含む3％イソフルランで麻酔し、手術中は毎分1リットルの酸素を含む1〜2％イソフルランで維持しました。心肺反応（心拍数、呼吸数、深さ）とつま先をつまんだ脊髄反射を術中モニタリング技術として調べた。正常な体温は、温度制御された加熱パッドによって維持され、手順全体を通して肛門プローブを介して監視されました。ラットを背臥位に置き、切開部位を切り取ってから、ポビドンヨード、続いて70％アルコールで無菌的に調製した。 MillarのMikro-Tip®超小型PVループカテーテル（SPR-901、Millar、Inc。、テキサス州ヒューストン）を頸動脈から左心室に挿入しました。左心室のカテーテル先端の正しい位置は、コンピューターモニターで視覚化された圧力-体積ループの波形によって確認されました。 20分間安定させた後、PowerLab 4/30に接続されたPVコンダクタンスシステム（MPVS-Ultra、Millar Instruments、ヒューストン、テキサス州、米国）を使用して、左心室機能の信号を1000サンプル/秒のサンプリングレートで継続的に記録しました。データ取得システム（AD Instruments、コロラドスプリングス、コロラド州、米国）。 USPグレードのドブタミン（Hospira、Inc。、イリノイ州レイクフォレスト）は、医薬品の滅菌生理食塩水（1.25、2.5、5、10μg / kg /50μl）で調製し、Pump 11 Elite ProgrammableSyringeによって頸静脈から塗布しました。ポンプ（ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州、米国）を各用量で30秒間ポンプします。

データの取得と分析

覚醒している自由に動いているラットの血圧を、曝露前の24時間、MWCNT曝露中、曝露後1日および7日にわたって継続的に記録しました。暴露日に、ラットを30分間チャンバーに順応させた後、暴露中に5時間（午前9時〜午後2時）の連続記録を行いました。各動物の血圧データを収集し、Excelスプレッドシートプログラム（Excel 2010、Microsoft Corporation、ワシントン州シアトル）にエクスポートしました（DataquestART分析ソフトウェア; Data Sciences International）。収縮期血圧（SBP）、拡張期血圧（DBP）、および平均血圧は、対照群とMWCNT曝露群を比較するために、5時間の曝露（午前9時〜午後2時）の過程で平均化されました。

統計分析

データは、二元配置（日ごとの処理）の反復測定分散分析を使用して比較されました。その後のペアワイズ比較は、FishersLSDを使用してテストされました。すべてのデータはSASソフトウェア（バージョン9.3）を使用して分析され、差異は p のレベルで統計的に有意であると見なされました。 <0.05。図中の値は平均±SEとして表されています。

結果

この研究では、密閉された暴露ケージ内のMWCNTエアロゾルの粒子質量分布と質量濃度が決定されました。結果は、空気力学的質量の中央値が1.4 µm（図1）であり、MWCNTの質量濃度が5 mg / m ³ であることを示しています。 （データは表示されていません）。

密閉された露出ケージ内のMWCNTエアロゾルの典型的なサイズ分布。これは、空気力学的直径の中央値が1.4μmであることを示しています

。

血圧は、遠隔測定装置を備えた自由に動くラットで測定され、曝露前からの変化率として比較されました。私たちの結果は、収縮期血圧、拡張期血圧、および平均血圧がすべて、対照群と比較した場合、MWCNT曝露群の5時間の曝露期間中に有意に増加したことを示しました（図2a–c）。曝露後1日では、MWCNT曝露群の収縮期、拡張期、および平均血圧の変化率は依然として対照群よりも高いままでしたが、差は有意ではありませんでした（図2a–c）。曝露後7日では、2つのグループ間で血圧に差は見られませんでした（図2a–c）。

a 曝露期間中および曝露前の基礎レベルからの曝露後1日および7日での収縮期血圧（SBP）の変化率を示す棒グラフ（曝露前対照対MWCNT：127.0±3.0対127.6±1.7mmHg）。 b 曝露期間中および曝露前の基礎レベルからの曝露後1日および7日での拡張期血圧（DBP）の変化率を示す棒グラフ（曝露前のコントロールとMWCNT：85.1±2.0と86.9±1.2 mmHg）。 c 曝露期間中および曝露前の基礎レベルからの曝露後1日および7日での平均血圧（MAP）の変化率を示す棒グラフ（曝露前対照対MWCNT：99.1±2.3対100.4±1.4mmHg）。各値は、8匹のラットの平均±SEを表します。 P <対照群と比較して0.01（*）

MWCNTへの曝露後の心機能は、曝露後1日と7日で麻酔をかけたラットのドブタミン投与量の増加に応じて左心室のパフォーマンスを測定することによって評価されました。結果は、MWCNTへの曝露により、基礎一回拍出量（SV）、心拍出量（SW）、および心拍出量（CO）がわずかに低下したが、一回拍出量、一回拍出量、および心拍出量の増加した用量に対する応答性が大幅に低下したことを示しました。ばく露後1日目のドブタミン（図3、4、5）。曝露後7日では、2つのグループ間に差は観察されませんでした（図3、4、および5）。ドブタミンの用量を増やした場合の血圧も測定され、対照群とMWCNT曝露群の間に差はありませんでした（図6）。

一回拍出量（SV）の曝露前の基礎レベルからの変化率を示す線グラフ（曝露前のコントロールと1日後のMWCNT：109.3±7.0対106.7±10.4μl、コントロールと7日後のMWCNT：118.8±5.7） vs 127.5±3.7μl）。各値は、8匹のラットの平均±SEを表します。 P <曝露後1日で対照群と比較して0.01曝露（*）

曝露前の基礎レベルからの脳卒中仕事（SW）の変化率を示す線グラフ（曝露前のコントロールと1日後のMWCNT：11276±1165対11,151.7±727.9mmHg×μl、コントロールと7日後のMWCNT：13245 ±893.4対13,644.2±536.5mmHg×μl）。各値は、8匹のラットの平均±SEを表します。 P <曝露後1日で対照群と比較して0.01曝露（*）

曝露前の基礎レベルからの心拍出量（CO）の変化率を示す線グラフ（曝露前のコントロールと1日後のMWCNT：42243.3±4500.1と40,556.6±2308.8μl/分、コントロールと7日後のMWCNT：44903.3 ±2906.0対46,210±1624.8μl/分）。各値は、8匹のラットの平均±SEを表します。 P <曝露後1日で対照群と比較して0.01曝露（*）

曝露前の基礎レベルからの平均血圧（MBP）の変化率を示す線グラフ（対照対MWCNTの1日後：97.7±2.8対98.1±2.6、対照対MWCNTの7日後：102.5±4.2対100.9± 5.5）。各値は、8匹のラットの平均±SEを表します

ディスカッション

心臓血管機能の調節における自律神経系（ANS）の役割はよく研究されています[21]。 MWCNTの肺吸入は、ラットの交感神経系と副交感神経系の両方の活動を増加させることにより、心拍変動（HRV）を変化させ、心拍数（HR）を低下させることを以前に報告しました[10]。労働者では、TiO ₂ への肺曝露 直径が300nm未満の粒子は、HRVの変化と関連しており、この変化は自律神経系に対する粒子の影響と一致しています[22]。したがって、疫学研究により、周囲空気中の粒子状物質の超微細成分が心血管自律神経活動の調節に重要な役割を果たすことが確認されました[23]。ただし、ENへの肺曝露に起因する自律神経系の変化が心血管機能に影響を与えるメカニズムは不明なままです。交感神経系と副交感神経系は、心血管機能を調節するために相互に作用する傾向があります。しかし、我々の発見は、交感神経と副交感神経の両方の活動が、MWCNTへの曝露後に同時に増加したことを示しています[10]。心血管機能におけるENへの曝露後のANS活動の変化の結果を解明するために、以前に報告したようにHRVの研究に使用した同じ覚醒している自由に動くラットから血圧を記録して分析しました[10]。私たちの結果は、収縮期血圧、拡張期血圧、および平均血圧がすべて、対照群と比較した場合、MWCNT曝露中に有意に上昇し（図2a–c）、曝露後1日でいくらか高いままであったことを示しました（有意ではありませんが）。 MWCNTへの肺曝露後の有意に高い血圧は、5時間の曝露を通じて反応が維持され、濾過された空気対照の反応とは異なるため、ストレス反応による可能性は低い。ストレス反応は通常、副交感神経系の抑制効果により、戦うか逃げるか反応、血圧の上昇と心拍数の加速を伴う生理学的反応、およびより強い心臓収縮をもたらします。私たちの以前の研究では、交感神経系の活動はMWCNT吸入によって直接刺激され、交感神経系の活動のMWCNT刺激による増加が、本研究でのMWCNTへの曝露後の血圧上昇の原因であることを示唆しています。

本研究では、MWCNTへの曝露中の血圧上昇が、対照群と比較して、覚醒している自由に動いているラットの心拍数の低下と関連していることを示唆しています（統計的有意性（ p =0.054））（データは表示されていません））。曝露中に観察された心拍数の低下は、MWCNTへの曝露中に副交感神経活動が増加したという以前の報告と一致していました[10]。副交感神経活動の増加とMWCNTへの曝露後の心拍出量への影響との相関関係の証拠は、麻酔ラットにおける基礎心臓機能とドブタミン（βアドレナリン受容体アゴニスト）に対する心臓反応性を研究することによって裏付けられました。曝露後1日で、心拍数、心拍出量、左心室収縮末期圧の基礎心臓活動はすべてMWCNT曝露ラットで低かったが、差異は統計的差異に達しなかった（データは示していない）。副交感神経活動の増加が心臓に及ぼす影響は、一回拍出量、心臓の仕事、およびドブタミンに対する心拍出量の反応性の低下としてさらに示されました（図3、4、および5）。ドブタミンはβ受容体アゴニストです。心臓のβ受容体の活性化は、交感神経の効果を模倣します。したがって、ドブタミンに対する心拍出量の反応性の低下は、交感神経活動の低下が原因である可能性があります。しかし、本研究では、ドブタミンの存在下での心拍出量の低下は、MWCNT曝露中の副交感神経活動の増加に起因する可能性が高いです。これは、以前の研究で、覚醒している自由に動くラットでのMWCNT曝露後も交感神経活動が高いままであることが示されたためです[10]。 。意識のある自由に動くラットと麻酔をかけたラットの血圧と心機能の測定にはタイミングの違いがありましたが、意識のあるラットの心拍数の低下とドブタミンに対する心機能の反応の低下（図3、4、5）はMWCNTへの曝露後の副交感神経活動の上昇とその心臓への影響。

この研究で発生した血圧の上昇とともに、心拍数と心拍出量の低下に寄与する可能性のある2つのメカニズムがあります。 1つは、十分に確立された圧受容器反射反応です。 2つ目は、以前に報告したように、MWCNTの吸入後の心血管中枢における副交感神経出力の直接的な増加です[10]。どちらのメカニズムも副交感神経系に関係していますが、経路は異なります。血圧の上昇は、活動電位生成の基礎速度を上昇させることによって圧受容器を興奮させ、孤束核（NTS）に信号を送り、それが血管運動中枢を抑制し、迷走神経核を刺激することはよく知られています[24 、25]。その結果、心拍数と心臓の収縮性が低下し、血圧が狭い変動範囲に保たれます。私たちの研究では、心拍数と心拍出量の低下は、意識のあるラットでのMWCNT曝露後の有意に高い血圧と関連していました。これは、圧受容器反射を引き起こす高血圧が原因である可能性があります。ただし、麻酔をかけたラットでは、対照群と曝露群の間で基礎血圧に差は見られませんでした（対照群とMWCNT：平均血圧98.6対97.9 mmHg）。これはおそらく麻酔の影響によるものです[26]。 MWCNT曝露群の心拍出量は、対照群と比較して基礎レベルで比較的弱かった（図3、4、および5の凡例を参照）。興味深いことに、ドブタミンの増加した用量に対する一回拍出量、心臓の働き、および心拍出量の応答性は、MWCNTに曝露されたラットでは有意に弱かったが、対照間でドブタミンに応答した心機能と同時に測定された血圧に差はなかった。およびMWCNTグループ（図6）。これらの観察は圧受容器反射の役割を除外し、MWCNTへの肺曝露が圧受容器反射以外のメカニズムを介して副交感神経系の活動を増加させる可能性があることを強く示唆しました。カーボンナノチューブによる副交感神経活動の直接刺激の証拠は、別の動物研究でも観察されました[27]。この研究では、気管内に注入された単層カーボンナノチューブが、ラットの血圧を上昇させることなく心拍数を低下させることがわかりました[27]。曝露中の急速な発症とANS、血圧、および心臓のパフォーマンスに対する一時的な影響を考慮して、私たちの研究はまた、心血管機能の調節におけるナノ粒子誘発性炎症およびナノ粒子転座の可能な役割を除外し、肺曝露がナノ粒子は、自律神経制御に関与する脳領域に直接影響を与える可能性があり、それが次に心血管機能に影響を及ぼします。

私たちの研究は、心血管系に対するANSのMWCNT誘発性変化の影響は、明らかに自律神経の分布に基づいていることを示しています。血管系では、血管は主に交感神経によって神経支配されており、これらの交感神経の大部分は、α ₁ に結合するノルエピネフリン（NE）を放出します。 -血管収縮を引き起こすアドレナリン受容体。体内では、副交感神経コリン作動性または交感神経コリン作動性神経によって神経支配される血管のタイプはごくわずかであり、どちらもムスカリン受容体に結合して血管拡張を引き起こすアセチルコリン（ACh）を放出します。したがって、交感神経活動と副交感神経活動の両方の増加の全体的な効果は、血管収縮によって血圧を上昇させることです。心臓は、副交感神経線維と交感神経線維の両方によって神経支配され、心拍数（変時作用）、収縮力（変力作用）、および弛緩作用（変弛緩作用）を相互に調節します[28、29]。 MWCNTへの曝露は、ドブタミンに反応して心拍数を低下させ、一回拍出量、一回拍出量、心拍出量を低下させました（図3、4、5）。これは、副交感神経系の活動の増加が心拍数と心臓のパフォーマンスの制御に支配的であることを示唆しています。交感神経活動の増加に直面しても、MWCNTへの肺曝露後。

本研究は、MWCNTへの曝露がANSの変化を誘発し、それが心血管機能に大きな影響を与える可能性があることを報告した最初の研究でした。吸入したMWCNTが血圧、心拍数、心機能に及ぼす影響は主に曝露期間中に観察され、血圧の一時的な上昇と心臓のパフォーマンスの低下は健康な動物に急速に適応しますが、このような心血管機能の一時的な変化は心不全や高血圧などの既存の心血管疾患を患っている人に心血管イベントを引き起こすリスク要因となる可能性があります。最近のinvivo虚血/再灌流（I / R）研究は、MWCNTへの肺曝露が有意な循環炎症反応がない場合でもI / R損傷を有意に増加させることを示しました[30]。自律神経系の障害がI / R損傷を増加させ、心臓虚血中の心臓組織の損傷を増加させる可能性があることはよく研究されています[31]。心不全の間、心臓は、心筋の衰弱のために、酸素交換のために肺および体の残りの部分に十分な血液を送り出さず、適切な臓器機能を維持する。その妥協した状態では、MWCNTの曝露によって血圧がさらに上昇し、心収縮性が低下すると、すでに破壊されている心血管機能と臓器灌流が悪化する可能性があります。私たちの研究は、MWCNTへの曝露が心血管機能の変化に関連するANS活動を刺激する可能性があることを明確に示しています。私たちの研究からの観察は、数時間または数週間だけ周囲空気中の粒子状物質<2.5μmへの曝露が心血管疾患に関連する死亡率と罹患率を既存の心血管患者に引き起こす可能性があるというアメリカ心臓協会の結論に関連している可能性があります条件[16]。

結論

本研究の観察結果は、ナノ粒子への肺曝露がANS活性の変化により心血管機能に影響を与える可能性があるという、以前の発見と仮説を裏付ける基本的な証拠を提供します。結論として、我々の研究は、ANSにおけるMWCNT誘発性変化への曝露が心血管機能に有意に影響を与える可能性があることを示しています。心血管機能の一時的な変化が、既存の心血管状態のある人にさらに深刻な悪影響を与える可能性があるかどうかを調査するために、さらなる研究が必要です。

略語

CNT：

カーボンナノチューブ

CO：

心拍出量

DBP：

拡張期血圧

EKG：

心電図

EN：

人工ナノ粒子

HR：

心拍数

HRV：

心拍変動

MAP：

平均血圧

MWCNT：

多層カーボンナノチューブ

SBP：

収縮期血圧

SV：

一回拍出量

SW：

脳卒中の仕事