CpGの改変Fe3O4磁性ナノ粒子送達は、腫瘍増殖および自発的肺転移を阻害して免疫療法を強化する

背景

悪性腫瘍は、人間の健康と生命を脅かす主要な疾患の1つであり、腫瘍の発生率は継続的に上昇しています[1、2]。残念ながら、放射線療法、化学療法、悪性腫瘍の手術などの従来の治療法の結果は、それほど効果的ではありませんでした。急速に増殖する細胞を死に至らしめる化学療法や放射線療法とは対照的に、免疫療法は、腫瘍細胞を標的にして排除するために宿主自身の免疫防御システムを強化するように設計されています。

免疫療法のCpGが腫瘍の予防と退行における有効性について広く研究されていることは注目に値します[3]。有望な臨床データにもかかわらず、無料のCpGの使用にはまだいくつかの欠点があります。まず、CpGは生物学的条件下でヌクレアーゼを介した分解を受けやすい。第二に、それらは全身投与後の標的細胞への特異性を欠き、細胞への取り込みが不十分です。したがって、改善が必要になる可能性があります。 TLR9はエンドソームに存在するため、腫瘍関連炎症細胞によるCpGの取り込みが不十分であると、臨床反応が弱くなると仮定しました。したがって、CpGの内在化を促進する方法は、その免疫刺激反応を増強する可能性があります。

遊離CpGの欠点を除いて、CpGの投与経路は抗腫瘍能力と毒性に影響を及ぼします。静脈内注射によって投与された遊離CpGおよび他の安定なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、急速に除去され、広い組織分布を有する[4、5]。さらに、全身投与された遊離CpGは、非特異的な免疫活性化を誘発し、免疫細胞の枯渇、リンパ濾胞の破壊、肝臓の損傷、自己免疫疾患の悪化などの重篤な副作用を引き起こす可能性があります[6、7、8]。これらの特性は、ヒト患者に全身投与された遊離CpGの失敗を説明している可能性があります[9]。以前の研究では、CpGの腫瘍内注射は、免疫刺激を腫瘍部位に「集中」させることにより、優れた抗腫瘍効果を発揮することが示されています[10]。腫瘍に注入されたCpGの保持時間をどのように制御するかが問題です。

トール様受容体-9を使用することにより、樹状細胞、マクロファージ、およびNK細胞は、細菌のDNAで一般的なCpGを認識できます[11]。 CpGは、免疫細胞にケモカインとサイトカイン、およびT細胞のアップレギュレーションされた共刺激細胞表面分子を産生するように誘導します[12、13、14、15]。したがって、CpGは強力な1型分極アジュバントとして浮上しています[16、17]。さらに、腫瘍に直接CpGを注入することは、インサイチュ腫瘍を抗原源として使用し、腫瘍内の免疫応答を活性化するためのアジュバントとしてCpGを導入する免疫化の一形態です。したがって、CpGの腫瘍内注射は、1型抗腫瘍T細胞応答経路に応じて、局所樹状細胞の動員と活性化を介して腫瘍の免疫特権を無効にするという仮説を立てました。

前述の問題を克服するために、Fe ₃ に基づく修正磁性粒子プラットフォームを開発しました。 O ₄ 腫瘍部位への腫瘍内注射によるCpGの放出を指示および制御する粒子。 Fe ₃ のいくつかのユニークな特性のため O ₄ 磁性粒子、特にそれらの良好な組織適合性[18]、超常磁性[19、20]、低毒性[21]、および外部磁場による容易な調製と標的化ドラッグデリバリー[22、23]、それらの動きと濃度はFe ₃ を可能にする、外部磁場を備えたボディ O ₄ 遺伝子トランスフェクション効率を高めた遺伝子医療の担体として使用される粒子[24]。さらに、Fe ₃ にAPTESをコーティングします O ₄ 共有結合による粒子は、凝集体の形成を防ぎ、CpGの結合をさらに助けるために、より多くの修飾部位（アミノ基）を提供します[25、26]。この研究では、Fe ₃ O ₄ 磁性粒子は共沈法[27]によって調製され、APTESで修飾されました。 CpGは修飾されたFe ₃ の表面にしっかりと結合していました O ₄ 静電相互作用により粒子を形成し、直径が約50nmのFeNP / CpG粒子を形成します。さらなる研究により、FeNP粒子送達システムは樹状細胞における遊離CpGの取り込み効率と比較してCpGの取り込み効率が向上し、FeNP / CpG粒子の腫瘍内注射は、腫瘍を抑制するだけでなく、効果的な抗腫瘍Th1型免疫応答を刺激することが示されました。その場での増殖だけでなく、invivoでのC26結腸癌および4T1乳癌モデルにおける腫瘍転移を阻害する。したがって、ナノ調製療法は潜在的な腫瘍免疫療法戦略である可能性があります。

材料と方法

材料と動物

3-アミノプロピルトリエトキシシラン（APTES）は、Aladdin Company、Inc。から入手しました。塩化第二鉄六水和物（FeCl ₃ ∙6H ₂ O）および塩化第一鉄四水和物（FeCl ₂ ∙4H ₂ O）天津光復ファインケミカル工業研究所から購入した。以下のCpGはInvitrogenCo。によって合成された：5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3 '。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）は、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入しました。

ヒト胎児腎臓細胞株（293T）、マウス乳房腫瘍細胞株（4T1）、および結腸癌細胞株（C26）は、American Type Culture Collection（ATCC）から入手し、骨髄由来樹状細胞（BMDC）を入手しました。 BALB / cマウスから。雌の6〜8週齢のBALB / cマウスは、Beijing HuaFuKang Laboratory Animal Co. Ltdから購入しました。マウスを飼育し、病原体のない条件下で飼育しました。すべての動物プロトコルは、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って実施されました。

FeNPの準備

Fe ₃ の合成には、共沈法を使用しました。 O ₄ 粒子[29]。実験手順では、11.68 g FeCl ₃ ∙6H ₂ Oおよび4.30g FeCl ₂ ∙4H ₂ Oを80°Cで200mLの脱イオン水を含む3つ口フラスコに加え、続いて15 mlの25％NH ₃ を加えました。 ・h ₂ O. 1時間の反応プロセス中に、混合物をN ₂ でパージしました。 かき混ぜました。準備されたFe ₃ の30ミリグラム O ₄ 30分間の超音波振動により、60mlの脱イオン水と無水エタノールの混合物に分散させました。準備されたFe ₃ の0.3g O ₄ 30分間の超音波振動により、4mLの脱イオン水と600mLの無水エタノールの混合物に分散させました。次に、1.2 mLのAPTESを、7時間一定の機械的攪拌下で混合物に添加しました。得られた官能化APTES修飾Fe ₃ O ₄ （FeNP）ナノ粒子を磁石で上澄みから磁気的に分離し、エタノールで洗浄し、40°Cで真空下で24時間乾燥させました。最後に、FeNPの沈殿物をさらに使用するために準備しました。

FeNP / CpG粒子の特性評価

Fe ₃ の粒度分布スペクトル O ₄ 、FeNP、およびFeNP / CpG粒子は、Zetasizer Nano ZS90レーザー粒子サイズアナライザー（Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して25°Cで測定しました。各テストは3回実施され、平均値が取得されました。透過型電子顕微鏡（H-6009IV;日立製作所、東京、日本）と走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して、調製した粒子の形態を観察しました。

FeNP粒子のCpG結合能力を評価するために、アガロース遅延アッセイを実施しました。簡単に説明すると、官能化されたAPTES修飾Fe ₃ O ₄ 粒子（FeNP）を1μgのCpGとさまざまな比率（FeNP：CpG、 w ）で混合しました / w ）蒸留水中。室温で30分間共培養した後、混合物を1％（ w ）で電気泳動しました。 / v ）120Vで30分間のアガロースゲル。次に、ゲルをGoldenView™（0.5 mg / mL）で染色し、UVイルミネーター（Bio-Rad ChemiDox XRS、米国）で写真を撮りました。

MTTアッセイ

C26、4T1、および293T細胞株に対するFeNP粒子の細胞毒性は、MTTアッセイで評価されました。 C26、4T1、および293T細胞を5×10 ³ の密度でプレーティングしました。 96ウェルプレートに10％FBSを含む100μLRPMI1640培地でウェルあたりの細胞数を増やし、24時間または72時間増殖させました。準備した細胞を、さまざまな濃度の一連のFeNP粒子に曝露しました。つまり、1.25、0.625、0.3、0.15、0.07、0.03、0.01、および0 mg / mlの6重粒子です。一定時間培養した後、100μlの完全培地と10μlのMTTを各ウェルにピペットで移し、37°C​​で4時間インキュベートしました。 DMSOを溶質に30分間添加すると、ホルマザンが形成されました。次に、Spectramax M5マイクロタイタープレートルミノメーター（Molecular Devices、USA）を使用して570nmで吸光度を測定しました。未処理の細胞の細胞生存率は100％と見なされました。

インビトロトランスフェクション

BMDCはBALB / cマウスから調製されました。簡単に説明すると、大腿骨と脛骨の骨髄細胞を、シリンジを使用して遊離のFBSを含む1640培地で洗い流しました。細胞を1500rpmで3分間遠心分離し、ACK溶解バッファー（Lonza Inc.）で処理して赤血球を除去し、10％FBS、ペニシリン（100 U / mL）、ストレプトマイシン（100 U / mL）を添加したRPMI-1640培地に再懸濁しました。 100 U / mL）、37°C​​、5％CO2、20 ng / mL顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）。次に、細胞を10 ⁶ の密度で6ウェルプレートに播種しました。 ウェルあたりの細胞数、および増殖培地は2日ごとに交換されました。樹状細胞は7日目に採取されました。

7日目に、0.2μgの遊離FITC結合CpG（CpG-FITC）または質量比10：1のCpG-FITCを送達するFeNPに相当する粒子を事前に設計されたウェルに添加しました。トランスフェクションの1〜3時間後、増殖培地を除去し、細胞をDAPIで10分間染色し、生理食塩水で3回洗浄しました。各ウェルの写真をレーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）で撮影し、トランスフェクション効率をフローサイトメトリー（NovoCyte Flow Cytometer、ACEA Biosciences、USA）で測定しました。

InVivo腫瘍抑制アッセイ

10万個のC26または4T1細胞を、各BALB / cマウス（6〜8週齢）の背中に皮下注射しました。続いて、デジタルノギスを使用して腫瘍の体積を測定し、次の式で計算しました。腫瘍の体積=0.5×長さ（mm）×[幅（mm）] ² 。腫瘍が約50mmに達したら ³ サイズでは、処理が適用されました。マウス（ n =10）20μgのCpGに相当するCpG / FeNP（10：1の比率）粒子の腫瘍内注射、またはCpGのみを3日ごとに4回の治療で受けました。同等の生理食塩水（NS）またはFeNP粒子を投与されたマウスを対照群と見なした。腫瘍のサイズと動物の体重を3日ごとに監視しました。 31日目に、すべてのマウスが頸椎脱臼によって犠牲にされた。腫瘍組織および他の重要な器官を4％中性ホルマリンで固定し、続いてパラフィン切片を作成して形態学的差異を評価するためのHE染色および腫瘍微小環境を試験するための免疫蛍光抗体法を行った。 4T1モデルでは、腫瘍の重量を測定し、肺転移結節の数を数えました。

腫瘍の再チャレンジ実験は、C26モデルで処理されました。簡単に説明すると、FeNP / CpG治療で治癒したマウスは、5×10 ⁵ で再チャレンジされました。 C26または4T1セルs.c.それ以上の処理なしで側面の反対側の2つの別々のサイトに。 4T1腫瘍の体積が200〜300 mm ³ に増加したときに、マウスを犠牲にしました。 または20日。

細胞傷害性Tリンパ球アッセイ

ＣＴＬアッセイは、公表された方法に従って実施された。詳細には、エフェクター細胞としての脾臓のリンパ球を採取し、塩化アンモニウムで赤血球を枯渇させ、処理実験の最後にナイロンウールを通過させた。標的細胞としての4T1またはC26は、300mciのNa ₂ で標識されました。 ⁵¹ CrO ₄ 2時間後、PBSで洗浄し、96ウェルプレートに分注しました。調製したエフェクター細胞を、異なるE：T比で標的細胞と共培養しました。標的細胞からの放射能を含む上清をシンチレーションカウンターで測定した。特異的溶解は以下のように決定された：％特異的溶解＝ １００ ［（ＣＴＬ自発的放出の存在下での放出）／（最大放出自発的放出）］。すべての実験で、自発的放出は最大放出の30％未満でした。

ELISpotアッセイ

実験の最後に、コントロールマウスまたはCpG処理マウスから脾細胞を採取し、ELISpotアッセイを、マウスIFN-γ/ IL-4デュアルカラーELISpotキットを製造元の指示に従って使用して実施しました。採取した脾細胞をそれぞれの処理と96時間共培養し、懸濁液を滴下し、細胞を洗浄バッファーで3回洗浄した後、IFN-γとIL-4の混合抗体を添加しました。発色剤で処理した後、顕微鏡下でスポット形成細胞（SFC）の数を数えました。

ELISAアッセイ

製造元の指示に従って、Ct特異的血清抗体価のレベルを決定するためにELISAを実施しました。簡単に説明すると、精製された全Ctタンパク質（BestBio Biotechnology Co. Shanghai、China）でコーティングされたマイクロプレートを、0.05％Tween 20（PBST）を含むPBS溶液ですすぎ、100μlのブロッキングバッファー（PBST中の5％スキムミルク）でブロックしました。 37°Cで1時間。 PBSTで5回リンスした後、プレートを免疫血清（ブロッキングバッファーで1：1000に希釈、100μl/ウェル）または膣洗浄液（ブロッキングバッファーで1:10に希釈、100μl/ウェル）で37℃でインキュベートしました。 °Cで2時間。 PBSTで5回リンスした後、プレートをHRP標識ヤギ抗マウスIgG抗体（ブロッキングバッファーで1：1000に希釈、100μl/ウェル）またはHRP標識ヤギ抗マウスIgA抗体（ 1：2000ブロッキングバッファー、100μl/ウェル）、37°C​​で1時間。

組織学的分析

インビボ阻害研究から採取された腫瘍組織および主要臓器は固定され、パラフィンに包埋された。ワックスを除去して再水和した後、ワックスを埋め込んだ組織切片をメイヤーのHEで染色しました。各グループの腫瘍組織内の浸潤リンパ球（TIL）を分析するために、切片を高圧抗原修復に供し、抗マウスFITC-CD4、PE-CD8、およびPE-CD49b（NKメーカーとして）で染色しました（BD、 USA）4°Cで1時間、次にDAPIで10分間染色した後、イメージングのためにPBSで洗浄します。各グループの画像は、陽性蛍光顕微鏡（オリンパス、日本）で撮影されました。

統計分析

データは平均値±標準偏差として表されました。統計分析は、Prism 5.0cソフトウェア（GraphPad Software、La Jolla、CA、USA）SPSS 17ソフトウェアを使用して一元配置分散分析（ANOVA）で実行されました。グループ間の比較は、単一因子分散分析（ANOVA）のテューキーの検定を使用して実行されました。 P <0.05の値は統計的に有意であると見なされました。

結果

FeNP / CpG粒子の調製と特性評価

細胞毒性の低いCpG送達用の磁性粒子を開発するには、Fe ₃ O ₄ 粒子は、図1aに示すように、共沈法を使用して合成されました。 Fe ₃ の表面にAPTESのアミノプロピルシラン基（–O）3Si–CH2–CH2–CH2–NH2をグラフトする O ₄ FeNP粒子を形成します（図1b）。負に帯電したCpG（CpG）は、APTESによって提供される有効な官能基に結合し、図1cに概略的に示されているように、静電相互作用を介してFeNP / CpG粒子を形成します。動的光散乱測定に基づいて、準備されたFe ₃ のサイズ O ₄ 粒子は10.7±4.1nmでした（図2a）。 TEM（図2b）およびSEM（図2c）で観察したように、Fe ₃ O ₄ この作品で開発されたものは、均一でほぼ球形でした。 APTES修飾Fe ₃ の動的直径 O ₄ 粒子は34.5±5.0nm（図2d）であり、TEMの結果（図2e）とよく一致していました。

FeNP / CpG粒子の調製。 a Fe ₃ の合成式 O ₄ 共沈法を用いた磁性粒子。 b シランポリマーの生成を伴う加水分解および縮合反応、およびマグネタイト表面でのAPTESのシラン化反応によるFeNP粒子の形成。 c FeNP / CpG粒子の概略図。 CpGは静電相互作用を介してFeNPの表面に結合し、FeNP / CpG粒子を形成します

FeNP / CpG粒子の特性評価。 a Fe ₃ のサイズ分布スペクトル O ₄ 粒子。 b Fe ₃ の透過型電子顕微鏡画像（TEM） O ₄ 。 c Fe ₃ の走査型電子顕微鏡画像 O ₄ 粒子。 d APTESでコーティングされたFe ₃ のサイズ分布 O ₄ （FeNP）粒子。 e FeNP粒子のTEM画像。 f ゲル遅延アッセイによって決定されたFeNPのCpG結合能力。すべてのデータは3つの独立した実験を表しています

FeNP粒子のCpGへの結合能力を説明するために、ゲル遅延アッセイを実施しました（図2f）。 FeNPとCpGのモル比が10：1の場合、明るいCpGバンドは観察されず、負に帯電したCpGは、電気泳動後の静電相互作用によってFeNP粒子に完全に吸着されることがわかります。したがって、私たちは、私たちの研究でさらに適用するために、その処方比率を選択しました。総合すると、これらの結果は、CpGが静電相互作用を介してFeNPの表面でうまく結合できることを示しており、安定性と小さな寸法を示しています。

InVitroでのFeNP / CpG粒子の細胞生存率とトランスフェクション

in vitroでの生物物理学的特性をさらに詳しく説明するために、24時間または72時間の時点で、293T、4T1、およびC26細胞でFeNPの細胞毒性を検出しました（図3a）。 293T、C26、および4T1細胞では、細胞生存率とFeNP粒子の間に明らかな用量依存的な関係はありませんでした。細胞生存率は、FeNP濃度が1.25 mg / mlの場合でも、3種類の細胞で24時間で80％以上、72時間で60％以上でした。これらの結果は、正常細胞（293T）または腫瘍細胞（C26、4T1）のいずれの場合でも、FeNP粒子の生体適合性を証明しました。

invitroでのFeNP / CpG粒子の細胞毒性と取り込み活性。 a MTTアッセイ。さまざまな濃度のFeNP粒子で24時間または72時間処理した後、293T、4T1、およびC26細胞の生存率を検出しました。どの用量のFeNPでも細胞生存率に有意差はありませんでした。 b 、 c BMDCでのFeNP / CpG取り込みの検出。 GM の後に作成されたBMDC - CSF 7日間の処理は、CpG-FITCまたはFeNPで送達されたCpG-FITCで1時間または3時間トランスフェクトされた後、集中的に洗浄され、固定され、DAPIでラベル付けされました。画像は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）によってキャプチャされました。遊離FITC標識CpGと比較して、蛍光強度が強化されたFeNP / CpG（ b ）およびトランスフェクション効率は統計的に有意でした（ c ）。これらのデータは、3つの独立した実験、平均±標準誤差を表しています。 * P < 0.05、* P < 0.01、および*** P < 0.001対未処理グループ

CpGの主要な受容体細胞としての樹状細胞は、TLR9によって媒介される抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たします。強力な1型分極アジュバントとしてのCpGは、ケモカインとサイトカインを分泌することにより、DCが腫瘍内の免疫応答を活性化するように誘導します。したがって、DC細胞へのCPGの効率的な送達は、抗腫瘍反応を達成するために重要です。私たちの研究では、FITC結合CpGを使用して、invitroでのDCへのFeNP粒子の送達能力を調査しました。トランスフェクションの1時間後または3時間後、レーザー走査型共焦点顕微鏡（LSCM）を介して、FITC結合CpGコーティングFeNP粒子（FeNP / CpG-FITC）処理グループの細胞蛍光強度は同等量の遊離CpGグループ（図3b）。 FeNP / CpG-FITC粒子は、1時間後に最大18.3％のDCをトランスフェクトすることができました。その後、トランスフェクションの3時間後に、陽性細胞の比率は39.2％に増加しました（図3c）。一方、遊離のFITC結合CpG処理細胞に関しては、トランスフェクションの3時間後でも、10％未満のトランスフェクションで、最小限の蛍光が観察されました。したがって、FeNP粒子によるCpGの送達は、CpGの細胞取り込みを増加させることが示唆されています。

FeNPはCpGを異種移植片に送達し、腫瘍の成長とinvivoでの自発的肺転移を抑制します

CpG / FeNP粒子の抗癌活性は、最初にC26結腸癌および4T1乳癌皮下移植腫瘍モデルでinvivoで評価されました。腫瘍の体積が約50mmの場合 ³ 、マウスをランダムに4つのグループに分けて、治療を開始しました（ n =10）。マウスは、実験全体を通してCpG / FeNP粒子の腫瘍内注射で3回治療されました（図4a）。私たちの研究では、FeNP / CpG粒子の腫瘍内注射により、対照群と比較して異種移植腫瘍の増殖が有意に抑制され、抑制率は最大69％でした（ P <0.05対NS）（図4b）。通常の生理食塩水（NS）治療群（0.90±0.08 g）およびFeNP群（0.81±0.03 g）と比較して、FeNP / CpG粒子治療群では、腫瘍重量が統計的に有意に減少しました（0.38±0.03 g、 P <0.001）。比較すると、遊離CpGグループは最小限の抗がん能力（0.68±0.03 g）を示しました（図4c）。さらに、PBS対照群のマウスは広範囲の肺転移を発症しましたが、FeNP / CpG粒子で治療したマウスは、肺の腫瘍結節の数が64.1％減少し（図4d、e）、その力を示しています。転移性腫瘍の治療におけるFeNP / CpG粒子の役割。図4fに示すように、肺のH＆E染色では、FeNP / CpG治療後、他のグループよりも明らかに肺転移を伴う肺負荷の減少が示されました。これらの結果は、4T1細胞へのFeNP送達CpGが4T1腫瘍増殖を有意に阻害しただけではないことを示しています（ P <0.001対NS）だけでなく、乳がんの肺への転移も抑制しました。

インビボでのFeNP / CpG粒子の抗腫瘍能力。 a インビボでの腫瘍内注射によるC26結腸癌および4T1乳癌異種移植モデルの両方におけるFeNP / CpG粒子による抗腫瘍の治療スケジュール。 b – d FeNP / CpG粒子治療は、4T1腫瘍の成長を抑制しました。 b 4T1腫瘍モデルの代表的な腫瘍増殖曲線。 c 平均腫瘍重量。 d 各グループの平均肺腫瘍結節は、FeNP / CpG腫瘍内注射後の肺転移を明確に示しています。 e 、 f 肺の明視野イメージングとH＆E染色： e 目に見える肺転移の数、矢印は肺転移を示します。 f 肺転移のH＆E染色。スケールバー、H＆E染色用に100μm。 g 、 h FeNP / CpG粒子は、C26異種移植腫瘍の増殖を有意に抑制しました： e 実験中の各グループの腫瘍増殖曲線と f 平均腫瘍重量。各グループに10匹のマウスがいた。 g 腫瘍の再チャレンジ実験。 i C26モデルでは、FeNP / CpG治療で治癒したマウスを5×10 ⁵ で再チャレンジしました。 C26（右脇腹）または4T1セル（左脇腹）s.c。それ以上の処理なしで側面の反対側の2つの別々のサイトに。示されている画像は、腫瘍の再チャレンジから20日後の代表的なマウスです。すべてのデータは、3つの独立した実験、平均±SEMを表しています。 * P < 0.05、* P < 0.01、および*** P < 0.001

同様に、FeNP / CpG治療群による有意に増強された抗腫瘍効果が、C26培養マウスの皮下モデルで観察されました。図4gに示すように、腫瘍はコントロールマウス、ビヒクルグループ、CpGグループで急速に成長し、平均腫瘍体積は約2300±239.4 mm ³ でした。 、2116.7±360.9 mm ³ 、および1353.3±158.9 mm ³ 、それぞれ、31日目まで。対照的に、FeNP / CpGグループでは、腫瘍の成長が極端に抑制され、平均腫瘍体積は約153.7±62.7 mm ³ でした。 （ P <0.01対NS）および94.4％の抑制率。腫瘍は最初の治療後にゆっくりと成長したように見え、腫瘍の一部は3回の治療の終了後に徐々に消え始めました。さらに重要なことに、FeNP / CpG粒子治療群では、マウスのほぼ半数の腫瘍が実験の終わりまでに完全に消失していました。図4hに示すように、FeNP / CpG治療群の平均腫瘍重量は、他の群よりもはるかに低かった（ P <0.001）：FeNP / CpG治療群（0.14±0.08 g）、NS群（2.41±0.26 g）、FeNP群（2.50±0.4 g）、およびCpG群（1.44±0.32 g）。 FeNP / CpG粒子が特定の抗腫瘍反応を媒介するのに十分であるかどうかを決定するために、腫瘍再チャレンジ実験がC26モデルで処理されました（図4i）。 C26結腸癌モデルにおけるFeNP / CpG粒子治療後に腫瘍が完全に退行したマウスに、BALB / cマウスの異なる位置に4T1およびC26腫瘍を皮下接種し、それ以上の治療は行わなかった。すべての4T1腫瘍は急速に成長し、チャレンジ後20日目までにその体積は1000mm3を超えました。対照的に、C26モデルでは肉眼では見えない固形腫瘍があり、FeNP / CpG粒子グループが特定の抗腫瘍反応を刺激したことを示唆しており、これらの結果は、FeNP / CpG粒子の腫瘍内注射が効率的に皮下異種移植。

FeNP / CpG粒子は強化された体系的な抗腫瘍免疫応答を刺激します

上記の2つのモデルにおけるFeNP / CpG粒子のinvivo抗腫瘍メカニズムをさらに研究した。免疫応答のタイプを研究するために、ELISpotアッセイを適用して、マウス脾臓のIFN-γ/ IL-4レベルを分析しました。脾臓リンパ球のIFN-γレベル（ELISpotボードに紅斑を示す）がIL-4レベル（ELISpotボードに青い斑点を示す）よりも大幅に高い場合、刺激される免疫応答のタイプはTh1、つまりCD8を活性化することでした。 sup> + Tリンパ球と主に体のCTL応答。それ以外の場合、免疫応答のタイプはTh2でした。つまり、主にCD4 ⁺ を活性化します。 Tリンパ球、したがってBリンパ球を刺激し、抗原特異的抗体を産生します。さまざまな処理におけるIFN-γとIL-4の発現を測定するために、デュアルカラーELISpotアッセイを実施しました（図5a）。他の3群と比較して、マウス脾臓リンパ球から分泌されるIL-4およびIFN-γのスポット形成細胞（SFC）の数は、FeNP / CpG粒子治療群で増加傾向にあり、SFCの数はIFN-γの分泌はIL-4の1.5倍でした（ P <0.05）、これは、FeNP / CpG粒子の腫瘍内注射後の抗腫瘍細胞性免疫応答の増強を意味します。さらに、NS、FeNP、CpG、およびFeNP / CpGで処理したマウスの血清を、3回の免疫後の総腫瘍特異的IgGの存在についてELISAアッセイを使用して分析しました。 C26腫瘍モデルでは、FeNP / CpG免疫マウスは他のグループよりも有意に高い力価の腫瘍特異的IgGを発現しましたが（図5b）、FeNP / CpG免疫マウスとCpG免疫マウスの間に統計的差異はありませんでした。 。

The mechanism of antitumor immune response. a ELISpot assay. Splenocytes were harvested from NS or treated mice after the final treatment, and ELISpot assays were performed using the mice IFN-γ/IL-4 Dual-Color ELISpot kit in the C26 xenograft model. b In the C26 model, serum antibody titers in tumor-bearing mice treated by FeNP/CpG particles were tested using an ELISA assay. Each symbol represents an individual mouse, and horizontal lines indicate the median as determined by Mann–Whitney U tests. c CTL assays. The cytotoxicity of splenocytes against C26 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay. d Representative immunofluorescence images showing infiltrating immune cells in tumor tissues in each group. The FeNP/CpG particles treatment groups with enhanced CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T and NK (CD57 ⁺ ) cell infiltration in tumors compared to that of other groups. e The cytotoxicity of splenocytes against 4T1 cells were examined in a 4-h 51Cr-release assay

To assess the cell-mediated immune response stimulated by the FeNP/CpG, CTL activity was assessed using the 51Cr release assay on C26 and 4T1 cells ex vivo (Fig. 5c, e). When the killing activity of CTL was at a 100:1 ratio of effector cells to target cells, in the C26 cells, the effectors in the FeNP/CpG groups showed 8.2-fold more tumor-killing activity than that in the NS group and 9.7-fold and 1.7-fold more than that in the FeNP and CpG groups (P  < 0.05 versus NS) (Fig. 5c). Similarly, this observation was coincident with the result in the 4T1 cells; the FeNP/CpG group had 7.4-fold more tumor-killing activity than that of the NS group and 6.6-fold and 1.4-fold more than that of the FeNP and CpG groups (P  < 0.01 versus NS). These results illustrated that compared to that of free CpG, the use of APTES-coated Fe₃ O ₄ to deliver CpG can stimulate a more intense humoral immune response and result in a better antitumor efficiency in vivo.

The FeNP/CpG Increases Infiltrating Lymphocytes in Tumors and Alters Tumor Microenvironments

Tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), a primary immune component infiltrating solid tumors, are considered the manifestation of the host antitumor reaction. Immunofluorescence analyses were performed to study TILs in tumors. The intensity of infiltration by CD4 ⁺ T cells, CD8 ⁺ T cells and CD49B ⁺ NK cells was studied (Fig. 5d). There was a significant increase in the intensity of infiltration of NK cells, CD4 ⁺ T cells, and CD8 ⁺ T cells in tumors from the FeNP/CpG groups compared with that in the FeNP, CpG, and NS groups (P  < 0.005), which suggests that FeNP/CpG not only stimulates a higher immune response but also alters the tumor microenvironment by activating more immune cells into the tumor tissues. During the entire experiment, the mouse body weight and state were observed, and there was no piloerection, poor appetite, weight loss, or abnormal behavior in the C26 xenograft model (Fig. 6a). As shown in Fig. 6b, no significant pathological changes in heart, liver, spleen, lung, or kidney were observed through HE analysis. No histopathological changes and changes of body weight were observed in the 4T1 subcutaneous xenograft model (data not shown). Overall, our data suggested that the developed FeNP particles for CpG delivery were capable of treating cancer and inhibiting tumor metastasis with high safety.

Safety and toxicity evaluation of FeNP/CpG formulation. （ a ) Body weight changes in NS, FeNP, CpG, and FeNP/CpG groups. b The section of the heart, liver, spleen, lung, and kidney in each group was collected and stained with H&E staining. No significantly pathological changes were observed in any group (magnification, × 200)

ディスカッション

Synthetic CpG, identified as an effective drug in immunotherapy by simulating the immune activation of natural bacterial DNA [28,29,30], have been characterized in a variety of tumor models. CpG intratumoral injection is one of treatments in clinical trials on CpG. Molenkamp and his colleagues showed that the intratumoral injection of CpG alone or combined with radiotherapy could obviously increase the tumor-specific CD8 ⁺ T cell immune response in lymphoma or melanoma patients, causing systemic tumor regression [31]. So far, CpG combined with other treatments showed both a great antitumor effect and good security, which suggests that CpG are quite effective in tumor immunotherapy. However, the greater challenge of CpG truly coming into clinical application is if they can efficiently be delivered into the cells to combine with receptors such as TLR9 to stimulate an immune response. Nanotechnology can address such concerns by enhancing the delivery of CpG to antigen-presenting cells, and a number of nanocarriers have been explored for this purpose [32,33,34]. The nanoparticle formulations explored include gelatin particles, liposomes [35, 36], and DNA origami structures, but these were only explored in the context of combination treatments.

In this study, we first developed a non-viral delivery system, FeNPs, which were easily formed via APTES-modified Fe₃ O ₄ , to deliver CpG into BMDCs. The CpG surrounded the surface of the modified magnetic Fe₃ O ₄ particles via electrostatic interactions to form FeNP/CpG particles with a small size distribution. The FeNP/CpG particles not only showed enhanced transfection efficiency compared to that of free CpG but also had a great antitumor effect in subcutaneous tumor models of C26 colon cancer, with 94.5% tumor inhibition, and 4T1 breast cancer, with a 64.3% inhibitory rate, though intratumoral injection in vivo. Moreover, FeNP/CpG treatments significantly stimulate an effective antitumor immune response and alter the tumor microenvironment by recruiting a number of immune cells to tumor tissues.

We further discuss possible reasons to account for the enhanced transfection and therapeutic efficiency of FeNP/CpG particles over that of free CpG. First, the developed FeNPs take advantage of characteristics such as their good histocompatibility, superparamagnetism, and a strong positive charge (for the Fe₃ O ₄ particles) to assist in delivering the CpG into the intracellular space, resulting in drug-carrier particles focusing on the tumor site to increase the drug concentrations in the area, reduce the drug loss, and improve drug utilization. Simultaneously, APTES was used to modify Fe₃ O ₄ , providing more CpG binding sites to firmly bind the CpG onto the carrier. FeNPs exerted higher cell viability on 293T, C26, and 4T1 cells in vitro, and there was no remarkable pathological change after FeNP/CpG treatment by intratumoral injection that could avoid the side effects due to CpG entering into circulation by systemic administration. Second, the FeNP load CpG into DCs with a higher transfection efficiency than that of free CpG, increasing opportunities for integration with intracellular TLR9, which is widely expressed in macrophages, NK cells, DCs, and so on. The combination of CpG and TLR9 induces the secretion of local cytokines and chemokines, recruiting and activating immune cells of the innate immune response to stimulate the antitumor immune response; additionally, NK cells and CTLs could kill tumor cells directly or use IFN-γ or granzyme B to kill tumor cells [37, 38]. We suspected that FeNP/CpG may be taken up by the recruited immune cells to trigger the secondary cascade amplification of the immune response. Third, some studies have indicated that CpG can react with tumor cells expressing TLR9, aiming to induce tumor cell autophagy [39]. Autophagy may enhance the sensitivity of tumor cells to the immune response, and the ATP dependent on autophagy could be released extracellularly and used to recruit DCs into the tumor tissue, activating the tumor-specific T cell immune response. This therapy is a form of immunization that uses the in situ tumor as a source of antigen and introduces CpG as an adjuvant to activate an immune response within the tumor. In our study, although the FeNP/CpG was injected without any specific tumor antigen, a cell-specific and systematic immune response could be elicited, and the contralateral tumors appear regressive, as shown in the tumor re-challenge experiment and the two-tumor site model. In addition, being coated with the lysate of tumor cells in a 96-well plate, the ELISA assay showed after FeNP/CpG intratumoral injection in mice that the antitumor antibody titer in the serum appeared to significantly increase. The ELISpot assay suggested that FeNP/CpG treatment, to a great degree, increased the spleen lymphocyte secretion of IFN-γ and IL-4, especially that of IFN-γ , which indicated that the humoral immunity responses and cellular immunity responses were both enhanced by treatment with FeNP/CpG in mice. In addition, immunohistochemistry analyses were performed to study TILs in the tumor microenvironment. Compared to that in the other groups, in the FeNP/CpG group, the number of CD4 ⁺ T, CD8 ⁺ T, and NK cells in the tumors showed a significant increase. Taken together, our study suggested that FeNP/CpG particle intratumoral injection may be a potential tumor immunotherapy strategy.

In recent years, treatment strategies based on nucleic acids have become one of the important areas of tumor treatment. The negative charge of the lipid bilayer of cell membranes makes it difficult for nucleic acid drugs with the same charge to pass through the cell membrane into the cell. Thus, APTES-modified Fe₃ O ₄ as a safe and efficient delivery system is expected to be used for other nucleic acid drugs to contribute to the carrier solution.

結論

In summary, magnetic APTES-modified Fe₃ O ₄ particles (FeNP) were used to deliver CpG adjuvants via intratumoral injection to treat C26 colon carcinoma and 4T1 breast cancer, with enhanced antitumor ability over that of free CpG. The prepared FeNPs showed high stability, low toxicity, and high transfection ability for CpG in vitro and in vivo. Our results demonstrated the potential capacity of FeNP particles in non-viral nucleic acid drug delivery and offered an alternative strategy for CpG immunotherapy.

略語

APTES:

3-アミノプロピルトリエトキシシラン

BMDC:

Bone marrow-derived dendritic cell

CpG:

Cytosine-phosphate-guanine

CpG-FITC:

FITC-conjugated CpG

FeNP:

3-Aminopropyltriethoxysilane-modified Fe₃ O ₄ nanoparticle

FeNP/CpG:

FeNP-delivered CpG particles

FeNP/CpG-FITC:

FeNP-delivered CpG-FITC particles

GM -CSF ：

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor