抗EpCAMアプタマー修飾リポソームによるドキソルビシン標的送達：C26結腸癌モデルにおける有効性

概要

本研究では、PEG化ナノリポソーム封入ドキソルビシン（DOX）であるCaelyx®の表面を、抗EpCAM（上皮細胞接着分子）アプタマーと結合したDSPE-mPEG₂₀₀₀の挿入後法により機能化し、ED-lipを調製しました。粒子径、電荷、放出プロファイル、細胞毒性、細胞取り込みを評価しました。ED-lipの特性評価では、粒子径とPDI（多分散指数）のわずかな増加、ゼータ電位の低下が認められ、挿入後法が効率的に行われたことを示唆しました。フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡の結果、ED-lipはC26細胞株においてCaelyx®と比較して細胞取り込み率を有意に向上させました。また、ED-lipはCaelyx®よりも強い細胞毒性を示し、抗EpCAMアプタマーが標的リガンドとして有効であることを示しました。C26腫瘍を移植したマウスにおける薬物動態と組織分布の解析では、ED-lipはCaelyx®と比較してDOXの分布プロファイルを変化させませんでしたが、腫瘍へのDOX蓄積を効果的に改善し、生存期間を延長しました。これらの結果は、抗EpCAMアプタマーでCaelyx®を機能化することががん治療において有望であり、さらなる研究が価値があることを示しています。

はじめに

100–200 nmのナノ薬物送達システム（NDDS）は、血管内皮の緩みとリンパ管排水の不全によるEPR効果（高透過性・保持効果）を通じて、受動的に腫瘍微小環境に蓄積します。しかし、近年のデータでは、投与薬物の1%未満しか腫瘍部位に到達しないことが示されています[1]。腫瘍の密な細胞外マトリックス（ECM）への浸透不足、放出薬物の循環への回帰、腫瘍の不均一性などが原因とされています[2]。内因性・外因性刺激を用いたNDDSの腫瘍蓄積改善戦略が検討されています[3]。これらのNDDSは光などの外因性刺激に応答し、腫瘍イメージングへの応用が可能です[4]。抗がん剤として機能する無機ナノ材料も多数報告されています[5,6]が、それらの毒性と環境安全性には注意が必要です[7-11]。

能動的標的送達は、NDDSが治療薬を腫瘍により効率的に送達し、非標的組織への曝露を最小限に抑える重要なアプローチです[12,13]。理想的な標的分子は、特定の細胞や組織成分で上昇発現している細胞表面タンパク質や受容体に親和性を持つ分子です[14]。

上皮細胞接着分子（EpCAM）はトランスメムブレングリコ蛋白であり、能動的標的送達の候補リガンドとされています。近年の知見では、EpCAMは正常上皮細胞では低発現ですが、癌細胞では最大1000倍まで高発現することがわかっています[15-17]。癌発生に伴い、EpCAMの発現パターンは正常上皮の基底・基底側膜から腫瘍上皮の頂面へと変化します[18]。この差別的発現により、EpCAMは薬物送達における魅力的なリガンドとなり、治療指数の改善が期待されています[19]。

EpCAMはがん幹細胞（CSC）または腫瘍開始細胞（TIC）のマーカーとして実証されており、その過剰発現は不良予後と関連しています[20]。CSC/TICは自己複製能を持ち、腫瘍の発生と転移に重要な役割を果たします[21]。様々な固形腫瘍のCSCでEpCAMの過剰発現が報告されています[22]。近年、アプタマーは幅広い研究で注目され、NDDSの標的リガンドとして強力な分子として浮上しています[23,24]。アプタマーはDNAまたはRNAベースのオリゴヌクレオチド配列で、細胞表面受容体などの標的への親和性を持つ二次・三次構造を形成します[23,24]。アプタマーは抗体と比較して非免疫原性、低分子量（8–25 kDa）、化学的・熱的安定性、低コスト・スケーラブルな合成と化学修飾などの利点があります[25]。抗EpCAM特異的アプタマーによるNDDSの選択的標的化は、化学療法薬を腫瘍微小環境へ送達する効果的な標的化オプションと考えられています[19,26]。実際、抗EpCAMアプタマー修飾ナノキャリアが抗がん剤の腫瘍細胞への送達を効果的に改善することが複数の研究で示されています[15,27,28]。

本研究の目的は、抗EpCAM DNAアプタマー（SYL3C）修飾PEG化ナノリポソームにドキソルビシン（DOX）を封入したED-lipをNDDSのモデルとして開発することです。この機能化は、アプタマーのアミノ基とDSPE-mPEG₂₀₀₀のカルボキシル基との間でEDC/NHSカップリング化学反応を行い、リポソームへ挿入後法で導入することで達成しました（図1）。ED-lipについて、粒子径、ゼータ電位、DOX封入率、放出プロファイル、細胞毒性を評価しました。さらに、C26結腸癌腫瘍移植マウスを用いて、ED-lipがin vitroで細胞取り込みを改善し、in vivoで標的送達により腫瘍へDOXを送達できるかを検証しました。

結果と考察

Caelyx®（PEG化リポソーム封入ドキソルビシン）は最も広く使用される化学療法薬の一つで、卵巣癌、AIDS関連カポジ肉腫、多発性骨髄腫の治療に対してFDA承認された最初のナノ粒子製剤です。Caelyx®はEPR効果により受動的に腫瘍部位に到達します[29]。Caelyx®はDOXの薬物動態と半減期を大幅に改善しましたが、主な限界は細胞取り込みの不十分さと腫瘍部位での薬物放出速度の低さです[29]。本研究では、SYL3Cアプタマーを標的リガンドとしてリポソームDOX（ED-lip）を機能化し、癌細胞表面のEpCAM分子を標的とすることで、能動的標的送達プロセスを通じてDOXを特定の標的部位へ送達することを試みました。

DSPE-mPEG₂₀₀₀とアプタマーの共役化

本研究では、アミノ基修飾抗EpCAMアプタマーをDSPE-mPEG₂₀₀₀-COOHの活性化カルボキシル基とEDC/NHSカップリング化学により共役化しました。この反応によるアミド結合形成の利点は、その安定性とアプタマー間の非特異的相互作用の低減です[30]。アプタマーは一次アミノ基またはチオール基で修飾し、それぞれ活性化カルボキシル基またはマレイミド基のピロール基と共有結合できます[31]。チオール修飾アプタマーはDSPE-PEG₂₀₀₀のマレイミド基と共役化され、その後リポソーム構造へ挿入後法で導入され、リポソーム外表面を修飾します[32]。マレイミド-チオール化学の重要な限界は、保存中にアプタマーのチオール基が酸化を受け、2つのチオール修飾アプタマー間でジスルフィド結合（S-S）が形成され、ジマー化アプタマーがマレイミド基との共役化反応に参加できなくなることです[30]。したがって、EDC/NHS反応の使用は生成物収率を向上させ、挿入後法を改善します。

アプタマーは抗体と比較して、合成とスケールアップの容易さ、全身毒性の低さ、免疫原性の欠如などの利点があります[33]。ここでは、アプタマーを脂質に共役化した後、挿入後法を用いて抗EpCAMアプタマー修飾Caelyx®（ED-lip）を調製しました。一般的に、挿入後法はアプタマーをリポソーム表面に結合させる簡便で効果的な方法であり、リポソームへのアプタマー導入率を高めます[34]。

アプタマーのリポソーム表面への挿入後導入を評価するために、ゲル電気泳動移動度変化アッセイを実施しました。図2に示すように、負に帯電したアプタマーはゲル中を移動しバンドが観察されましたが、ED-lip製剤では対応するバンドが観察されませんでした。これはED-lipがウェルにとどまりゲルを通過できなかったためです。この結果は、アプタマー共役ミセルがリポソーム表面へ効率的に挿入後導入されたことを示しています。

ED-lipの物理化学的特性

Caelyx®とED-lipの物理化学的特性を表1に示します。Caelyx®の抗EpCAMアプタマーによる修飾は、粒子径に有意な影響を与えませんでした（p > 0.05）。アプタマー挿入前のCaelyx®のリポソーム径は約96 nm、PDI 0.11でしたが、挿入後（ED-lip）では径が117 nm、PDI 0.14に部分的に増加し、腫瘍送達に望ましいサイズを維持していました。先行研究でも、標的リガンドの導入によりリポソームの径とPDIが増加することが報告されています[35,36]。また、ED-lipのゼータ電位（−19.25）はCaelyx®（−12）よりも負にシフトしました。RNAアプタマーのリポソームへの共役化によりゼータ電位が低下することが示されています[37]。ED-lipの径増加と負のゼータ電位シフトは、共役アプタマーがリポソーム表面へ効率的に挿入後導入された証拠となります[38]。これらの結果は、アプタマーのCaelyx®表面への結合が粒子径のわずかな増加と、アプタマー機能化Caelyx®でのより負のゼータ電位をもたらすという先行研究と一致します[38,39]。ただし、挿入後法の効率はインキュベーション時間と温度の観点からさらなる検証が必要です。Caelyx®とED-lipの封入効率はともに100%でした（表1参照）。

リポソーム表面へのアプタマー挿入後導入数は、文献[6]に従って決定しました。リン酸アッセイで測定したリポソーム製剤の総リン脂質含量は14 mMでした。平均径100 nmのリポソームあたりの平均脂質分子数は8×10⁴であるため、1 mLあたりのリポソーム数は約10¹⁴個となります[38]。アプタマーの分子量はg/molです。DSPE-mPEG₂₀₀₀-アプタマーの数は、リン酸アッセイ法に基づき、リン酸分子のモル数が共役分子のモル数に対応することから決定しました。これらのデータに基づき、1 mLアリコート溶液あたりのアプタマー分子数は10¹⁵個となります。

DOX放出プロファイル

アプタマー共役ミセルのCaelyx®外表面への挿入がDOXの放出プロファイルに影響を与える可能性があるため、5%デキストロース中50% FBS存在下で、ED-lipとCaelyx®からのDOX放出を比較評価しました。この培地は血漿中での製剤の放出挙動を模倣します[40]。図3に示すように、24時間の観察期間中、Caelyx®とED-lip製剤からのDOX放出に有意差はなく、わずかな量のDOXのみが放出されました。これは、アプタマーのリポソーム表面への導入が膜安定性とDOX放出プロファイルに影響を与えないという先行研究と一致します[38,39]。これは主に、Caelyx®製剤がpH勾配駆動型リモートローディング法により調製されており、安定性が高いためです[41]。

蛍光顕微鏡による細胞相互作用と細胞取り込み

リポソーム製剤の細胞相互作用と細胞取り込みを4℃と37℃で評価し、図4に示しました。ED-lipの標的効力評価では、CHO-K1細胞においてCaelyx®とED-lipの平均蛍光強度（MFI）に4℃と37℃で差は認められませんでした（図4a, c）。しかし、C26細胞では、ED-lipが4℃と37℃の両方でCaelyx®と比較して有意に高い取り込みを示しました（図4b, d）、37℃では統計学的有意差がありました（p < 0.0001）。ED-lipはCaelyx®と比較して有意に高い取り込みを示しました（p < 0.001）。これらの結果は、抗EpCAMアプタマーがCHO-K1細胞よりもC26細胞株に高い親和性を持つため、ED-lipが標的特異性を高めることを示しています。遊離DOXは脂質二重層を自由に通過して細胞内に入るため、すべての製剤中で最も高い細胞取り込みと細胞毒性を示します。Caelyx®の場合、PEG化によりエンドサイトーシス速度が制限され、細胞毒性が低下します。しかし、リポソーム表面に抗EpCAMアプタマーが存在すること（ED-lip）で、製剤の細胞内取り込み速度が向上し、Caelyx®と比較して細胞毒性が増加します[38]。蛍光顕微鏡のデータでは、C26細胞株における37℃でのED-lipと遊離DOXの細胞取り込み差は有意ではありませんでした（図5）。しかし、内在化DOXの強度に基づくスケーリング（表2）では、ED-lipとDOXの両方がC26細胞取り込みにおいてCaelyx®と統計学的有意差を示しました（p < 0.001）。C26細胞は表面に低レベルのEpCAMを発現していますが[42]、本研究のデータは抗EpCAMアプタマーの存在がリポソームの内在化プロセス速度を向上させる可能性を示唆しています[43]。

細胞毒性試験

遊離DOX、Caelyx®、ED-lip製剤の細胞毒性効果を図6に示します。様々な濃度の製剤で細胞を1、3、6時間処理し、さらに72時間培養しました。データはすべての製剤が時間依存的かつ用量依存的に細胞に影響を与えることを示しました。ED-lip製剤で処理したC26細胞の生存率は、Caelyx®処理群と比較して低下しました。EpCAM陰性細胞であるCHO-K1細胞ではC26細胞と比較してED-lipへの応答が低かったため、抗EpCAMアプタマーがCaelyx®の標的細胞への特異的送達を増加させることが示唆されます。これらの結果は、ED-lipのC26細胞への特異的細胞取り込みを確認するものです。特定の標的分子を用いた標的薬物送達により、オフターゲットを回避して薬物の副作用を軽減しながら標的細胞へ選択的に薬物を送達することの重要性が強調されます[44]。先行研究でも、アプタマーや抗体などの特定の標的リガンドによるCaelyx®の能動的標的化が、活性腫瘍標的化と標的細胞への特異的薬物送達を増加させ、結果としてDOXの治療効果を高めることが報告されています[35,39]。

生体分布と薬物動態

抗EpCAMアプタマーがDOXの生体分布に与える影響を評価するため、皮下にC26結腸癌腫瘍を移植したマウスに、ED-lipとCaelyx®を10 mg/kgの用量で静脈投与しました。投与後3、12、24、48、72時間における血漿中DOX濃度を図7に示します。両群の血漿DOX濃度の推移は類似しており、両製剤間に有意差は認められませんでした。表3に示すように、抗EpCAMアプタマーのリポソーム表面への共役化により、循環半減期が39.3時間から34.2時間へ、平均滞在時間（MRT）が47.6時間から42.9時間へわずかに減少しました（表3参照）。薬物動態パラメータは、アプタマーのリポソーム表面への共役化がt_½とMRTをわずかに減少させることを示し、アプタマー共役化がリポソームのクリアランスを加速するという先行報告と一致しました[38]。タンパク質吸着と単核食細胞系（MPS）によるその後の除去が、リガンド共役ナノ粒子の血中クリアランス加速の理由と考えられます[45]。

図8に、Caelyx®とED-lip投与群における主要採取臓器でのDOX濃度を比較示します。遊離DOXの最も重要な副作用は心毒性ですが、Caelyx®はこの有害作用のリスクを大幅に低減します[46]。ED-lipの肝臓、肺、脾臓への生体分布は、投与後3時間でCaelyx®と比較して有意に高値を示しました。挿入後法によるED-lipの粒子径とPDI増加、これらの臓器の漏出性血管が、早期により多くのED-lipがこれらの組織に蓄積する理由と考えられます。ナノ粒子径が150 nmに増加すると、肝臓、肺、脾臓への蓄積が増強されることが示されています[47]。一方、生体分布試験の結果は、ナノ粒子の腫瘍蓄積におけるEPRメカニズムを明確に示しています。図8は、ED-lipとCaelyx®の両方が腫瘍部位に徐々に蓄積し、約12時間で最大に達し、24時間までプラトーを維持し、その後48、72時間で徐々に減少することを示しています。興味深いことに、3、12、24、48、72時間のすべての時点において、ED-lipの腫瘍蓄積はCaelyx®よりも有意に多く、これは抗EpCAMアプタマーによる能動的標的化の効果によるものと考えられます。これらの結果は、アプタマーのリポソーム表面への導入が腎臓でのDOX分布に影響を与えないことを示しています。したがって、抗EpCAMアプタマーはリポソームの腫瘍特異的浸透を効果的に促進し、これは腫瘍血管内皮細胞におけるEpCAM分子の過剰発現による可能性もあります[48]。以前、抗EpCAMアプタマーが異種移植腫瘍での腫瘍浸透を増強することが示されています[49]。CSC/TICも抗EpCAM療法の標的です。標的リガンドとして抗EpCAMアプタマーを投与しEpCAMを標的とすることは、CSC標的化において有望な効果を示しています[22,50]。ここでは、ED-lipの効率的な抗腫瘍効果の一部は、CSCの標的化に成功したことによる可能性が示唆されます。

In Vivo抗腫瘍活性

ED-lipの治療効果をC26結腸癌腫瘍モデルで評価しました。腫瘍サイズ、体重、生存期間を約2ヶ月間モニタリングし、結果を図9と表4にまとめました。データは、ED-lipがCaelyx®と同様にマウスの体重に明らかな影響を与えないことを示しています（図9a参照）。図9bに示すように、Caelyx®とED-lipの静脈投与後、投与後30日目まで腫瘍増殖率は効率的に抑制され、リポソーム製剤群間に有意差はありませんでした。投与後30日以降、腫瘍増殖率は加速しましたが、薬物投与群ではPBS投与群より増殖率は依然として遅かったです。Caelyx®群とED-lip群の差は投与後30日間で有意ではありませんでした。生存結果はKaplan-Meierプロットで示しています。図9cは、ED-lipがPBS群やCaelyx®群と比較して生存曲線を改善することを示しています。生存試験の主要指標を表4にまとめました。ED-lip群の3匹のマウスで腫瘍が完全に治癒したため、この群のMST（中央生存期間）は未定義です。ED-lip治療によりTTE（エンドポイント到達時間）が41.1日から49.7日に延長し、90.27%のTGD（腫瘍増殖遅延率）による効果的な抗腫瘍活性を示し、3匹で腫瘍が完全消失したためMSTは未定義となりました（表4参照）。

腫瘍サイズデータは、ED-lipが腫瘍増殖を劇的に抑制できることを示しています。生存解析の結果、ED-lip治療によりMSTとTTEが増加しました。ED-lip投与群はCaelyx®と比較してより高いTGD%を示し、より効果的でした。これらの知見は、ED-lip投与群の腫瘍組織におけるDOX濃度が高いことと一致します。したがって、アプタマー共役リポソームDOXは腫瘍部位への浸透と薬物蓄積を改善し、結果としてCaelyx®の効果を高め、生存データにおけるより高いTGD%をもたらします。総合すると、これらの知見は抗EpCAMアプタマーが薬物送達の重要な標的化剤として機能しうることを示しています。

結論

本研究では、抗EpCAM（SYLC3）アプタマーを挿入後法によりCaelyx®表面に機能化し、ED-lipを調製しました。フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡により、C26細胞でのDOX取り込みレベルが高く、アプタマーがED-lipの内在化プロセス速度を向上させることが示されました。薬物動態データでは、DSPE-mPEG-EpCAMの挿入後導入がCaelyx®と比較してDOXの薬物動態を変化させないことが示されました。しかし、組織分布では、投与後72時間経過後でもED-lipの腫瘍蓄積がCaelyx®より多いことが示されました。C26腫瘍移植マウスにおいてED-lipが改善された治療効果を持つことを実証しました。ED-lip治療マウスでの改善された生存パラメータは、EpCAM標的DOXリポソームががん治療のための有望な薬物送達キャリアであり、さらなる研究に値することを示唆しています。

材料と方法

材料

5′-アミノ抗EpCAM DNAアプタマー（配列：5′ -CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3′）（SYL3C）をBIONEER（大田、韓国）から購入。DSPE-mPEG₂₀₀₀-COOHをAvanti Polar Lipids（アラバスター、AL）から購入。Dowex®、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ペニシリン・ストレプトマイシン、Fluoroshield™ with DAPIをSigma-Aldrich（セントルイス、MO）から購入。市販のCaelyx®をBehestan Darou Company（テヘラン、イラン）から購入。

DSPE-mPEG₂₀₀₀とアプタマーの共役化

抗EpCAMアプタマーを、アプタマーの一次アミノ基（-NH₂）とDSPE-mPEG₂₀₀₀のカルボキシル基（–COOH）の共有結合によりDSPE-mPEG₂₀₀₀に連結しました（図1）。共役化はEDC/NHSカップリング化学により実施しました[51]。簡潔に述べると、DSPE-mPEG₂₀₀₀を2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸（MES）緩衝液（pH 6.5）に分散させ、400 mM EDCと100 mM NHSを添加しました。15分間撹拌して脂質のカルボキシル基を活性化しました。次に、抗EpCAMアプタマーを添加し、室温で暗所にてさらに2時間撹拌しました。脂質：抗EpCAMアプタマーのモル比は1:1、EDC/NHSのモル比は脂質の10倍としました。

DSPE-mPEG-抗EpCAMアプタマーによるCaelyx®の修飾

ED-lipは挿入後法により合成しました。挿入後法では、DSPE-mPEG-抗EpCAMアプタマーミセルを1 mLのCaelyx®に添加し、60℃で30分間インキュベートしました。DSPE-mPEG-EpCAMアプタマーの量はBartlettリン酸アッセイ[52]に従って決定しました。Caelyx® 1 mLあたりのリポソーム推定数が約10¹⁴個であることから、DSPE-mPEG-抗EpCAMアプタマーの量を調整し、1リポソームあたり10個のアプタマーとなるようにしました[36]。アガロースゲル電気泳動で挿入後導入を確認しました[39]。

物理化学的特性評価

粒子径、多分散指数（PDI）、表面電荷を動的光散乱装置（DLS）（Nano-ZS；Malvern、UK）で測定しました。遊離DOXを除去するため、リポソームをDowex®樹脂と混合し60分間回転させ、Poly-Prepカラム（Bio-Rad Laboratories Inc.）でDowex®を除去しました[53]。リポソーム製剤中のDOX量を蛍光分光光度計（LS-45；Perkin-Elmer、UK）で測定しました（励起：蛍光 485:590 nm）。

放出試験

DOX放出を評価するため、1 mLの製剤を9 mLのデキストロース（50%胎仔牛血清（FBS）含有）に添加し、特定の時間間隔（0、1、2、4、6、12、24時間）でサンプルを採取しました。Dowex®樹脂で遊離DOXを除去後、蛍光分光光度計でリポソームに残存する薬物量を測定し、放出率を算出しました[39]。

細胞培養

C26結腸癌細胞株と中国ハムスター卵巣（CHO-K1）細胞株をイラン・パスツール研究所から購入。RPMI1640培地に10% FBS（Gibco、Thermos Fisher Scientific、USA）、100 IU/mLペニシリン、100 mg/mLストレプトマイシンを添加して培養。37℃、5% CO₂、95%湿度の雰囲気で培養しました。

細胞相互作用と細胞取り込みアッセイ

製剤の細胞相互作用と細胞取り込みをそれぞれ4℃と37℃で評価しました。CHO-K1とC26の2細胞株を使用。12ウェルプレートの各ウェルに2.5×10⁵個/ウェルの密度で播種。37℃で一晩培養後、製剤を添加し、4℃と37℃でさらに3時間インキュベート。PBSで洗浄後、トリプシン化。DOXの蛍光強度をフローサイトメトリー（BD FACSCaliburサイトメーター）で測定。データはFlowJoバージョン7.0ソフトウェアで解析しました。

蛍光顕微鏡評価

滅菌カバーグラスを挿入した6ウェルプレートの各ウェルに1×10⁶個のC26細胞を播種。37℃、5%湿度で一晩培養後、遊離DOX、Caelyx®、ED-lipで24時間処理し、完全な細胞取り込みを確保[54]。PBSで洗浄後、4%ホルマリンで固定。Fluoroshield™ with DAPIでカバーグラスを染色し、スライドグラスにマウント。処理はトリプレートで実施。各スライドから×200倍視野で6ゾーンを選択。DOXの固有蛍光を用いて薬物の細胞取り込みを評価。スケーリングは各顕微鏡視野でのDOX細胞取り込みを示す細胞の割合に基づいて実施：

1: 0–20%、2: 20–40%、3: 40–60%、4: 60–80%、5: 80–100%

細胞毒性評価

遊離DOX、Caelyx®、ED-lipのIC50値をMTTアッセイで決定。CHO-K1とC26細胞を96ウェルプレートに5×10³個/ウェルの密度で播種し、37℃で一晩培養。リポソーム製剤と遊離DOX溶液をFBSフリー培地で連続希釈し、細胞培養に添加、37℃で1、3、6時間インキュベート。その後、細胞を洗浄し72時間培養。光学密度（OD）をStat-Fax 2100マイクロプレートリーダー（Awareness Technology Inc.、USA）で570 nm（バックグラウンド630 nm）で測定。IC50値を算出しました。

動物実験

雌BALB/cマウス（4–6週齢、18–20 g）を個別ケージで22±2℃、標準ペレット食と水を自由摂取下で飼育。ケタミンとキシラジンの腹腔内投与（ケタミン100 mg/kg、キシラジン10 mg/kg）で麻酔[55]。C26細胞3×10⁵個/マウスを60 μL PBSに懸濁し、右側腹部に皮下接種。接種2週間後、腫瘍サイズが約5 mm³に達した時点で、マウスを無作為に3群に分けました（生体分布試験：n=3/群、抗腫瘍試験：n=5/群）。すべての実験プロトコルはマシュハド医科大学動物倫理委員会の承認を受け、動物の権利に関する国際規則に従って実施しました。

生体分布と薬物動態試験

腫瘍接種14日後、Caelyx®とED-lipを10 mg/kgの用量で尾静脈から静脈投与（i.v.）。対照群には200 μL PBSを投与。投与後特定の時点（3、12、24、48、72時間）でマウスを安楽死させ、血液サンプルと組織サンプル（肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓、腫瘍）を採取。各サンプル中のドキソルビシン濃度を蛍光分光光度計（LS-45；Perkin-Elmer、UK）を用いた蛍光強度に基づき測定。血中濃度-時間プロファイルから非コンパートメントモデル解析により薬物動態パラメータを算出。曲線下面積（AUC）、一次モーメント曲線下面積（AUMC）、半減期（t_1/2）、分布容積（V_d）、C_max、T_max、平均滞在時間（MRT）、クリアランス（Cl）を計算しました。

In Vivo抗腫瘍活性

抗腫瘍活性を評価するため、腫瘍接種10日後、触知可能な腫瘍サイズのマウスにCaelyx®とED-lipを10 mg/kgの単回静脈投与。PBS投与群を陰性対照としました。エンドポイント到達時間（TTE）、腫瘍増殖遅延率（TGD）、中央生存期間（MST）、生存期間を決定。試験中、マウスの健康状態と体重変化を観察。腫瘍体積はデジタルノギスで測定し、以下の式で計算：

$$ \mathrm{Tumor\ Volume}=(\mathrm{Height}\times \mathrm{Length}\times \mathrm{Width})\times 0.52 $$

倫理的観点から、腫瘍体積が>1000 mm³、体重減少>20%、虚弱兆候が観察された場合はマウスを除外しました。

統計解析

データはGraphPad Prism 6.0（GraphPad Software, Inc.、サンディエゴ、CA、USA）で解析。データは平均±SEMで表示（少なくとも3回の独立実験）。放出試験、フローサイトメトリー、製剤の生体分布結果の評価にはt検定を使用。蛍光顕微鏡と腫瘍体積の結果評価にはANOVAを使用。生存パラメータ（TTE、MST、TGD%）の算出にはKaplan-Meier法を使用。p < 0.05を統計学的有意とみなしました。