PLGAナノ粒子の喉頭がん細胞および免疫細胞への取り込みの定量的解析：薬物送達効率の向上に向けて

概要

ポリ（乳酸-グリコール酸）（PLGA）ベースのナノ医薬品の臨床応用は、食細胞による非特異的な食作用に起因する送達効率の低さによって制限されています。がん細胞と免疫細胞の間のナノ粒子相互作用の理解は依然として不十分です。本研究では、単培養および共培養系において、蛍光標識PLGA粒子（100 nm、500 nm、1 µm）の喉頭癌細胞（UM-SCC-17A）および単球/マクロファージ（THP-1由来）への細胞内取り込みを定量的に調査しました。PLGA粒子は5～20 µg/mLの濃度範囲で優れた生体適合性を示しましたが、500 nmおよび1 µm粒子は20 µg/mLでわずかに細胞生存率を低下させました。顕微鏡観察では、3サイズすべての粒子ががん細胞とマクロファージの両方によって効率的に取り込まれることが確認されました。しかし、定量的蛍光解析により、がん細胞の取り込み指数（がん細胞1個あたりの平均細胞内粒子蛍光強度をマクロファージ1個あたりの値で正規化したもの）は、共培養系において単培養系と比較してすべてのPLGA粒子で有意に低下しました（100 nm：1.35→1.05、500 nm：1.50→0.59、1 µm：1.40→0.47）。フローサイトメトリーを用いた定量解析でも、共培養におけるがん細胞の取り込み指数低下とマクロファージの粒子取り込み数増加が確認されました。さらに、PLGA処理後にマクロファージの融合による多核巨細胞の形成が増加することが判明し、これは腫瘍薬物送達への新たなアプローチとして利用できる可能性があります。総じて、これらの知見はナノ粒子-免疫細胞-がん細胞相互作用に関する新たな洞察を提供し、喉頭癌治療におけるPLGAベースのナノキャリア応用を促進するものです。

はじめに

がんは世界中で主要な死因の一つであり、2018年には約1,000万件の新規死亡例が報告されています[1]。喉頭癌（喉頭から発生する癌細胞）は、頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の中で2番目に多い悪性腫瘍であり、2018年には約18万件の新規症例と9万5千人の死亡が記録されています[2]。現在、手術、放射線療法、化学療法といった従来療法の課題に対処するため、標的薬が選択的治療として開発されています[3]。薬物標的性と効力の向上、副作用の軽減を目的として、新規薬物ナノキャリア（マイクロニードルなど）、個別化抗がん剤、治療用抗体標的送達システムなどの開発が加速されています[4]。

ナノキャリアは、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセルなどの抗がん剤を担持し、水溶性、生体利用率、安定性を改善することで薬物送達と効果を高めるために広く利用されています[3, 4]。一般に、ナノ粒子（NP）ベースの薬物送達は、タンパク質、抗体、ワクチン、核酸など多様な物質を、動物モデルおよび患者において体内の特定部位に送達することを可能にします[4, 5]。しかし、いわゆるEPR効果（高透過性・保持効果）により、がん種によって標的化効率が大きく異なることが知られています[6]。最近の証拠では、ナノ薬物キャリア（ここでは金NP）の腫瘍への沈着は、トランスサイトーシス（物質/NPがエンドサイトーシス、小胞輸送、エキソサイトーシスを経て細胞を横断する生物学的細胞輸送）に優先的に依存することが示唆されています[7]。しかし、標的薬物送達のメカニズムに関する矛盾する結果は、in vitro細胞培養からex vivo組織培養、in vivo動物実験まで、多角的な実験戦略を用いてナノ薬物やNPとの細胞相互作用の基盤を理解することが極めて重要であることを強調しています。

リポソーム、アルブミンNP、シリカNP、ポリ（乳酸-グリコール酸）（PLGA）などの多数のナノキャリアが、喉頭癌を含むさまざまな癌の治療に臨床的に用いられています[4]。ミセルやPLGAなどの高分子ベースNPは、ナノ薬物の多彩な処方（単純混合や共有結合）、優れた自己組織化能力、高い薬物担持力、生体適合性により、医療応用において大きな可能性を秘めています[8, 9]。例えば、ポリエチレングリコール（PEG）修飾PLGAナノキャリアにドキソルビシンとインドシアニングリーンを共載せることで、乳癌に対する相乗的化学・光熱療法が実現されています[10]。また、シスプラチン担持ミセルは、HNSCC直行性腫瘍（SAS-L1、HSC-2）に対してin vitroおよびin vivoで優れた抗腫瘍活性を示します[11]。PLGAやミセルなどの高分子ナノ薬物キャリアのいくつかは臨床使用が承認されているか、臨床試験中ですが[4, 6]、さらに多くの高分子ナノ薬物が、さまざまな頭頸部癌細胞株や動物移植腫瘍モデルを用いて非臨床研究段階にあります[11-14]。

ナノ薬物キャリアに対する宿主免疫応答の重要性が指摘されています。一度体内に入ると、NPは免疫系によって避けられず認識されるからです。マクロファージは細胞性宿主防御の第一線であり、食作用とそれに続く免疫応答のプライミングを通じて、アレルゲン、微生物、異物（ナノキャリアなど）の中和と排除を専門としています。新規設計されたナノキャリアの多くは、単核食細胞系（MPS）への効率的な蓄積（肝臓のKupffer細胞、脾臓の赤髄マクロファージなど）により、in vivoで特定の病変部位や腫瘍への標的送達に失敗しています[15]。したがって、単球やマクロファージなどの免疫細胞によるNP取り込みメカニズムを理解することは、ナノキャリアの関連組織および生体液中での寿命を決定するために不可欠です。新たなin vitro共培養システムは、in vivo状態をより良く反映した有意義な結果を得る需要の高まりにより、ナノ医薬学と毒性学の分野で徐々に注目を集めています[16]。実際、共培養系は健康および疾患組織状態の模倣において現実的な状況を示すことが証明されており[17]、NP細胞取り込みと薬物吸収研究に確実に利用されています[18-21]。がん細胞と免疫細胞の共培養モデルは、これらのナノ材料の細胞への取り込み経路とメカニズムを探るための適切なプラットフォームを提供し、がん細胞への標的性を高めつつNP食作用を減らすナノキャリア設計を促進する可能性があります。したがって、免疫細胞存在下でのがん細胞におけるNP取り込み効率と運命を決定することは本質的に重要です。ほとんどのナノキャリアはEPR効果を活用し血中持続性を延ばすために50～200 nmの直径で設計されていますが、より大きなNP（>500 nm）はMPSによって効率的にクリアされることが報告されています[6]。FDA承認ナノキャリアであるPLGAを、異なるサイズ（100、500、1000 nm）で選択し、UM-SCC-17A（古典的な喉頭扁平上皮癌細胞株）[22]とTHP-1（ヒト急性単球性白血病細胞株）の取り込み能力を調査しました。単培養においてPLGAナノキャリアを用いてHNSCC癌細胞に薬物を送達し殺傷するin vitro研究はいくつか存在します[12, 13, 23]が、異なるサイズのPLGAを用いて免疫細胞と喉頭癌細胞のNP取り込み効率とメカニズムを共培養モデルで同時に探ったのは本研究が初めてであり、HNSCC治療のための新規セーフ・バイ・デザイン・ナノ医薬品の開発における基礎的基盤を提供する可能性があります。

材料と方法

材料

市販の3種類のPLGA粒子（Sigma-Aldrich）を使用しました。サイズは100 nm、500 nm、1000 nmで、すべて緑色蛍光体（励起/放出波長：460/500 nm）で標識されています。粒子は粉末として受け取り、蒸留水に懸濁して最終濃度10 mg/mLのストック溶液を調製しました。動的光散乱（DLS；Malvern Zeta Sizer Nano、Malvern Instruments Ltd.）により、水動的直径とゼータ電位を測定しました。各粒子について3回繰り返し測定を行いました。

UM-SCC-17AおよびTHP-1細胞の培養と粒子曝露

ヒト喉頭癌細胞株UM-SCC-17A（Sigma-Aldrich、USA）とヒト単球/マクロファージ細胞株THP-1（上海恒亜生物技術公司、中国）を用いてin vitroモデルを構築しました。UM-SCC-17AはDMEM[22]、THP-1はRPMI-1640培地（10% FBS、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、Gibco、ドイツ）で、37℃、5% CO₂条件下で培養しました。THP-1細胞は、播種前に100 nMフォルボール-12-ミリステート-13-酢酸（PMA、Sigma、USA）溶液で72時間処理し、マクロファージへ分化誘導しました。両細胞とも0.5%トリプシン-EDTAで3日ごとに継代し、毎日細胞形態を確認して健全性を確保しました。

WST-1およびLDHアッセイ用に、単培養では0.1×10⁶ cells/well、蛍光顕微鏡用には24ウェルプレートの滅菌ガラスカバースリップに細胞を播種しました。共培養モデルでは、まずUM-SCC-17Aを50,000 cells/wellで24ウェルプレートに播種し、一晩培養した後、THP-1を50,000 cells/well追加しました。粒子は、単培養では各細胞培地、共培養では1:1混合培地に500 µL懸濁し、最終濃度5、10、20 µg/mL（WST-1/LDHアッセイ）または10 µg/mL（蛍光顕微鏡）で24時間曝露しました。

FACS測定用には、12ウェルプレートに単培養で250,000 cells/well、共培養で各125,000 cells/wellで同様に播種しました。1 mL培地で一晩培養後、PLGA粒子を最終濃度10 µg/mLで24時間曝露しました。

細胞生存率アッセイ

WST-1キット（Roche、ドイツ）を用いてメーカーの指示に従って測定しました。WST-1溶液を各培地（単培養：各々の培地、共培養：1:1混合培地）で1:10に希釈し、曝露後上清を除去、500 µLのWST-1作業液を加えて37℃で30分インキュベートしました。試料を14,000 rpm、10分遠心して粒子を除去し、450 nmで吸光度を測定（Infinite®F200、Tecan、USA）しました。ブランク（WST-1作業液のみ）の値を差し引き、未処理対照を100%として相対細胞生存率を算出しました。

細胞膜漏出アッセイ（LDH）

市販のLDH細胞毒性検出キット（Roche、ドイツ）を用いて、細胞膜損傷の指標である細胞外LDH放出量を測定しました。曝露24時間後の上清を回収、14,000 rpm、10分遠心後、200 µL完全培地で1:10に希釈しました。陽性対照は0.2% Triton X-100で37℃、15分処理し、200 µL完全培地で1:50希釈したものを用いました。LDHアッセイ作業液100 µLを加えて室温で30分反応させ、1% HCl 50 µLで反応停止後、492 nmで吸光度測定（Infinite®F200、Tecan、USA）を行い、以下の式で相対LDH濃度を算出しました。

相対LDH濾度 = (試料OD - ブランクOD) / (陽性対照OD - ブランクOD) × 5 × 100%

蛍光顕微鏡観察

Hoechst染色により粒子の局在を可視化しました。曝露24時間後、PBSで3回洗浄、4%ホルマリンで室温10分固定後、Hoechst（1:1000希釈）と1% BSAを含むPBS 200 µLで30分染色しました。カバースリップをガラススライドに逆さまに載せ、DAKO蛍光抗フェード剤で封入しました。明視野（細胞形態）、DAPI（核）、GFP（粒子）の4光学チャネルで観察し、粒子チャネルの露光時間を記録して蛍光強度を均一化しました。ImageJ（https://imagej.nih.gov/ij/）を用いてランダムに選択した領域の蛍光強度から細胞内粒子数を算出しました。取り込み指数は、各細胞タイプで50個の細胞について平均蛍光強度（MFI）を算出し、がん細胞のMFIをマクロファージのMFIで正規化して求めました。計算式は以下の通りです。

取り込み指数 = (I_total1 - I_auto1 (MFI_Um-SCC-17A)) / (I_total2 - I_auto2 (MFI_THP-1))

フローサイトメトリー（FACS）

粒子-細胞相互作用を定量的に評価するためにFACSを実施しました。曝露24時間後、PBSで3回洗浄、0.5%トリプシン-EDTA 200 µLで37℃、4分処理して剥離し、2 mL完全培地で反応停止後、ガラスチューブに移し、300×G、4℃、5分遠心しました。上清を慎重に除去し、200 µL PBSに再懸濁して氷上保存しました。生細胞をFSC-A/SSC-Aでゲーティングし、共培養細胞はAPCチャネル対FSC-AでUM-SCC-17Aとマクロファージを細胞サイズに基づき分離しました。各サンプル30,000細胞を解析し、各細胞の平均蛍光強度を算出して粒子間で正規化しました。さらに、曝露24時間後の培養上清、洗浄液（3回洗浄で残留表面付着粒子を除去）、細胞（トリプシン消化）を回収し、マイクロプレートリーダー（Infinite®F200、Tecan）で蛍光強度を測定し、細胞取り込み粒子割合を算出しました。例えば、12ウェルプレート（総計250,000細胞）で5 µgの100 nm PLGA粒子を単細胞あたり約30,000粒子曝露した場合、平均13,000粒子が単細胞で取り込まれ、投与量の約43%が細胞に送達されました。この送達率を用いて共培養系での各細胞タイプの粒子数をFACSから算出しました。

細胞融合の定量化

マクロファージ融合による多核巨細胞（MGC）は、正常な細胞質内に2つ以上の核を含む巨大細胞として形態学的に定義され、明視野画像と蛍光画像の両方で明確かつ同時に同定できます[26]。細胞融合率は、MGCの核数（手動カウント）を総細胞数（ImageJで自動算出）で正規化して求めました。

統計解析

GraphPad V8.0（GraphPad Software Inc.、USA）を用いました。一元配置分散分析（ANOVA）後、多群比較にはHolm-Sidak法、二群比較にはt検定を実施しました。すべての実験は独立に3回繰り返し、データを平均±標準偏差（SD）で示しました。p < 0.05 (*) および p < 0.01 (**) を有意としました。

結果と考察

PLGA粒子の特性評価

PLGA粒子の蛍光顕微鏡像（図1a-c）は強い蛍光強度を示し、調製後14日間で蛍光信号の有意な減少は見られませんでした（追加ファイル1: S1）。これは比較的均一なサイズ分布と高い蛍光安定性を示唆します。メーカー表示では100、500、1000 nmでしたが、DLS測定ではそれぞれ約80.6±19.3 nm、542.6±128.3 nm、951.9±237.5 nmでした（図1d-f）。ゼータ電位はそれぞれ-20.6±5.3、-17±4.6、-16.5±3.5 mV、多分散性指数は0.057、0.056、0.062で、高い単分散性を示しました。全粒子をボルテックス後、水浴超音波処理（5分）で凝集をほぼ除去しましたが、100 nmと1000 nm粒子では約4-6 µmの小さなピーク（全体の3-4%）が観察されました。

細胞生存率と細胞毒性の評価

PLGA粒子は優れた生体適合性と生分解性により、FDAと欧州医薬品庁（EMA）で生物医学用途に承認されています[27, 28]。現在臨床で使用され、前臨床研究でナノキャリアとして広く応用されています。しかし、標的化効率と治療効果は免疫系によって少なくとも部分的に阻害されます。例えば、肝臓のKupffer細胞による高い粒子食作用がナノ薬物キャリアの腫瘍部位到達を大きく制限します[15]。したがって、がん細胞、免疫細胞、粒子の相互作用を研究し、薬物送達のin vivo状況をより良く模倣する高度なin vitroモデルの確立が極めて重要です。UM-SCC-17Aは原発性喉頭癌検体から単離された特異的な喉頭扁平上皮癌細胞株です[29]。しかし、共培養系（マクロファージとがん細胞の共存培養など）におけるそのin vitro細胞取り込み効率に関する情報は依然として不十分であり、in vivo応答の予測能力向上のために解決が必要です。また、粒子サイズと表面修飾が動物モデルと細胞培養における固形腫瘍、病変部位、がん細胞への送達能力に重要な役割を果たすことが証明されています[30-33]。ここでは、3サイズのPLGAをUM-SCC-17A癌細胞に適用し、粒子サイズが単培養と共培養系における細胞取り込みと細胞内分布に及ぼす影響を調べました。

WST-1法により、単培養THP-1とUM-SCC-17A、および両者の共培養での細胞生存率を測定しました。100 nmと500 nm PLGAでは全濃度で明らかな細胞死は見られませんでしたが、500 nmと1 µm PLGAは最高濃度（20 µg/mL）で単培養UM-SCC-17Aの細胞生存率を有意に低下させました（図2a）。予想通り、THP-1細胞生存率は全サイズ・全濃度（5-20 µg/mL）で有意な影響を受けませんでした（未処理対照比≥95%、図2b）。共培養系でも、100 nmと500 nm PLGAでは3用量すべてで細胞生存率に変化はありませんでしたが、20 µg/mLの1 µm PLGAで有意に低下しました（図2c）。

LDHアッセイによる細胞毒性評価では、細胞質酵素LDHの細胞培養上清への放出（不可逆的細胞死の特徴）を測定しました。単培養UM-SCC-17Aでは、1 µm PLGAの高用量でLDHレベルがわずかに上昇しましたが、最高濃度（20 µg/mL）でも明確な細胞毒性は観察されませんでした（図3a）。単培養THP-1では、全サイズ・全濃度で実質的なLDH放出は誘導されず、細胞生存率結果と高度に一致しました（図3b）。共培養実験では、すべての粒子・濃度で両細胞に対して優れた生体適合性を示しました（図3c）。ここでは100 nmから1 µmまでの幅広い粒子サイズを用いましたが、これは典型的なナノキャリアサイズ（50-200 nm：リポソーム、ミセル、デンドリマー、高分子、ミニセル）をカバーし、サブミクロンサイズ（500 nm粒子は依然NPと見なされ、肺では10-100 nm NPと同じクリアランス経路をたどる[34]）とミクロンサイズ（1 µm）も含みます。これらのPLGA粒子のいずれも、単培養および共培養系でTHP-1および/またはUM-SCC-17Aに明らかな細胞毒性を示しませんでした。ただし、500 nmと1 µm PLGAが最高濃度でUM-SCC-17Aと共培養細胞に対してわずかな生存率低下を示しましたが（それでも85%以上の細胞が生存）、薬物送達システムへの応用に適していることが示されました。

単培養および共培養系におけるPLGAの細胞取り込み能力

図4は、単培養および共培養系における100 nm PLGA NPの細胞形態（図4a,d,g）、核とNP（図4b,e,h）、合成拡大像（図4c,f,i）を示します。対照群の未処理細胞では粒子は観察されませんでした（追加ファイル1: S2）。単培養マクロファージの細胞質に大量の大型100 nm PLGA NP凝集体が観察されました（図4c）。一方、単培養UM-SCC-17Aは100 nm PLGAの優れた取り込み能力を示し、細胞膜内に明るい緑色蛍光信号が観察されました（図4f）。共培養におけるTHP-1またはUM-SCC-17AへのPLGA粒子蓄積と細胞外粒子をより明確に示すため、明視野像と蛍光像のオーバーレイを追加ファイル1: S3に示します。共培養系では、明視野像で両細胞タイプが形態とサイズで区別でき、マクロファージは丸く小型、がん細胞は大型で細長い形状を示しました。しかし、共培養系ではマクロファージによる100 nm PLGAの高取り込みのため、がん細胞の細胞内取り込みが不十分でした。これはマクロファージが異物除去のための食作用を担う効率的で特異的な免疫細胞であるため、予想通りの結果です。同様に、図5と図6は500 nmと1 µm PLGA粒子の単一細胞または混合細胞培養における定性的取り込み能力を示します。いずれの粒子サイズでも、10 µg/mL濃度で24時間処理後、両細胞の形態に変化はありませんでした（図4a,d,g、図5a,d,g、図6a,d,g）。500 nmと1 µm PLGAは、単独UM-SCC-17A細胞（図5e,f、図6e,f）で単独THP-1細胞（図5b,c、図6b,c）よりも強い蛍光強度を示しました。共培養インキュベーション（図5h,i、図6h,i）では、がん細胞で明らかな信号減少が見られ、粒子蛍光強度がマクロファージよりも低くなりました。マクロファージはすべての粒子タイプを迅速かつ効果的に食作用するため、共培養系ではがん細胞が十分な粒子を取り込めません。

異なるサイズのPLGA粒子について、食作用ががん細胞の取り込み能力に及ぼす影響を定量化するため、半定量的光学解析を行いました。簡単に言えば、例えば各細胞タイプで50個の粒子取り込み細胞に基づき粒子蛍光強度を算出し、平均値を求め、がん細胞の取り込み指数をがん細胞1個あたりの細胞内粒子蛍光強度をマクロファージ1個あたりの値で正規化して決定しました（図7）。単培養では、100 nm PLGAのがん細胞取り込み指数は約1.34±0.19で、単一細胞培養ではがん細胞がマクロファージより多くの粒子を取り込んでいることを示唆します。これはPLGA粒子の高粘性と喉頭癌細胞の大きなサイズによるものと考えられます。同様に、500 nmと1 µm PLGAも単培養で取り込み指数約1.50±0.25と1.40±0.31で、がん細胞によって多く取り込まれました。しかし、共培養系ではマクロファージ存在下で大きな粒子の取り込み指数が大幅に低下しました（500 nm：0.59±0.12、1 µm：0.47±0.10）。一方、100 nm PLGAでは共培養で両細胞タイプの細胞内取り込み能力がほぼ同等でした。全体として、がん細胞とマクロファージによる粒子取り込みは、単培養と共培養環境で異なる取り込み経路に依存する可能性があります。さらに、マクロファージの存在は特に大きな粒子について、がん細胞によるPLGA粒子の細胞内取り込みを減少させることが明らかになりました。これはin vivoナノ医薬品送達研究でも観察されている生物学的現象です[3, 15]。

フローサイトメトリーによる細胞取り込みの定量化

フローサイトメトリーは、粒子-細胞相互作用の定量的評価に広く用いられます（例：20-1000 nmポリスチレン粒子の樹状細胞へのサイズ依存的取り込みin vivo[35]）。FACSを用いて、単培養および共培養系におけるNP陽性細胞割合とそれらの細胞内NP数を解析しました。次に、粒子取り込み細胞の総蛍光強度を投与総蛍光強度で正規化して、単一細胞あたりの平均NP数を算出しました。例えば、500 nm PLGAの約70%ががん細胞に沈着し、残りは培養上清に残留しました（追加ファイル1: S4）。このTecanリーダーで測定した蛍光強度を、平均/総FACS信号（図8のP5、P6のFITC信号値）と比較して、共培養系での粒子数を推定しました。共培養では約半分がマクロファージ、残りががん細胞と認識されました。単培養では、100 nm PLGAはがん細胞に約13,000個、マクロファージに約9,700個蓄積しました（図8i）、これは顕微鏡観察と一致します。一方、500 nmと1 µm PLGAでは、単培養がん細胞の取り込み数が大幅に少なく（それぞれ164±30個、45±15個）、マクロファージでもわずかに少ない値でした（図8i）。単一細胞あたりの取り込み粒子数は文献値と良く一致します[24]（例：セチルトリメチルアンモニウムブロミド修飾金NPが上皮細胞に平均2,500個沈着、PEG修飾金NPでは数十個/細胞[36]）。共培養系では、意外にも100 nm粒子のがん細胞取り込み数がわずかに増加しましたが、マクロファージでの取り込み増加がより顕著でした。単培養から共培養への取り込み指数変化を見ても、100 nm PLGAで約25%減少、500 nmと1 µm PLGAでは約2.5倍と3倍の有意な減少が見られました（図8i）。総じて、マクロファージの存在は特に大きな粒子について、がん細胞の取り込み能力を大きく制限することが、上記観察結果とも優れた一致を示して確認されました。

現在、がん細胞による異なるサイズ・表面修飾粒子の取り込み経路として、クラスリン依存性エンドサイトーシス、カベオラ依存性エンドサイトーシス、クラスリン・カベオラ非依存性エンドサイトーシス、ミクロピノサイトーシス、マクロピノサイトーシスなどが報告されています[37]。例えば、<200 nmの酸化鉄凝集体はMCF-7細胞でクラスリン依存性エンドサイトーシスで取り込まれる一方、より大きな凝集体はマクロピノサイトーシスで取り込まれることが示されています[38]。別の研究では、100 nmプレーンポリスチレン粒子は主にマクロピノサイトーシスで、カルボキシル化ポリスチレン粒子はクラスリン依存性エンドサイトーシス経路を好むことが実証されています[25]。食作用は、好中球、樹状細胞、そして最も重要な単球/マクロファージなどの免疫細胞における古典的な取り込み経路です。取り込み経路は、粒子サイズ、化学組成、表面修飾、培養環境中のタンパク質、細胞タイプなど、薬物送達ベシクルのさまざまなパラメータに強く依存します。通常、複数の取り込み経路が粒子摂取に関与し、例えばカベオラ依存性エンドサイトーシス、クラスリン依存性エンドサイトーシス、マクロピノサイトーシスが、ヒトHeLa細胞における300-400 nmキトサンNPの細胞内取り込みに参加することが見つかっています[39]。また、63 nmコレステロール修飾プルランNPがヒト肝細胞癌（HepG2）細胞にマクロピノサイトーシスとクラスリン依存性エンドサイトーシスで取り込まれることも観察されています[40]。先行研究では、PLGA粒子の細胞取り込みにはさまざまなエンドサイトーシス経路が関与し、クラスリン非依存性エンドサイトーシスがin vitroモデルでのPLGA内在化の主要経路であることが示されています[23, 24, 37]。しかし、一度細胞内に入ると、ここで用いたPLGA粒子は、初期エンドソーム、リサイクリングエンドソーム、後期エンドソーム、リソソームからなるエンド・リソソーム系に高確率で捕捉されます[41]。なお、共培養または三重培養系in vitroでの細胞取り込みメカニズムを示した研究は不足しており、今後検証が必要です。

PLGA NPによる細胞融合の誘導

単球/マクロファージの融合による多核巨細胞（MGC）形成が、幅広い生物学的プロセスで起こることは広く知られています[42, 43]。一般に、生体材料の移植は、マクロファージのMGCへの融合と線維性カプセル化を特徴とする異物反応を引き起こします[44]。肺胞マクロファージ、脾臓マクロファージ、ミクログリア、骨髄由来マクロファージ、血液単球などのヒトおよびマウス一次細胞、RAW264.7やUG3などの細胞株でも、in vitroでMGC形成が頻繁に観察されます[26, 45]。マクロファージは、粒子やインプラントのサイズが大きすぎて食作用で取り込めない場合、融合性表現型を形成することが知られています。しかし、100-1000 nmの範囲で容易に食作用される粒子サイズにおいて、in vitroマクロファージ細胞融合が粒子サイズに関連するかどうかは不明でした。ここでは、すべての群で顕微鏡観察により細胞融合が確認されました（図9）。細胞融合は、明視野像と蛍光像の両方で複数の核が同じ細胞質を共有している場合にのみ確認されました。粒子未処理の対照群でもTHP-1細胞の自発的巨細胞形成が起こり（図9a）、融合率は全細胞の約10%でした（図9h）[46]。100 nmと500 nm PLGA粒子でサイズ依存的な細胞融合が見られた一方、1 µm PLGAでは単培養で有意な融合増加は見られませんでした。これは1 µm PLGAの細胞あたり曝露粒子数が少ないため（10 µg/mLで約60個/細胞）と考えられます。マクロファージをがん細胞と共培養すると、すべての群で対応する単培養群と比較してMGC形成率が増加しました。特に、1 µm PLGAで共培養時に有意な融合増加（19%）が認められました。最も顕著な融合増加は共培養500 nm PLGA群で見られ、これは粒子サイズが大きく、細胞あたり取り込み粒子数が十分だったためと考えられます。

マクロファージ融合に関わる分子機構は広く研究され、実質的な進展があります[43]。例えば、マクロファージ融合受容体CD47とCD44の形成が融合プロセスとその後の巨細胞分化を仲介し[42]、miR-223をNPベシクルで送達することで抑制できることが報告されています[47]。したがって、今後は粒子誘導性マクロファージ融合を制御する主要分子と、巨細胞膜で発現する優占受容体の同定に焦点を当てるべきです。もう一つの重要な懸念はMGCの運命です。粒子や刺激と融合したMGCは、その後アポトーシスやネクロシスを経験すると考えられています[48]。これにより未消化粒子や巨大物質がin vitroでは他の細胞に、in vivoでは生体組織に放出され、長期的な炎症反応や肉芽腫を誘発する可能性があります。一方で、マクロファージ融合自体がNP薬物送達に有益である可能性もあります。例えば腫瘍組織では、マクロファージからがん細胞への薬物再放出が、腫瘍殺傷能力を高める可能性があります。より重要なのは、今後のナノ医薬研究では、マクロファージ融合をナノキャリア薬物送達にどう活用し、疾患診断と治療を改善するかを検討すべきです。マクロファージは体内で豊富な免疫細胞でありナノ薬物の優れた取り込み能力を持つだけでなく、標的遺伝子送達による損傷組織修復にも利用できるからです。

結論

私たちの知る限り、本研究は100 nmから1 µmのサイズ範囲のPLGA粒子について、共培養UM-SCC-17A喉頭癌細胞とTHP-1単球/マクロファージにおける競合的細胞取り込みを報告した最初の研究です。ここで得られたデータは、免疫細胞がin vitroでがん細胞による粒子内在化を変化/低下させることを証明しており、これはin vivoナノキャリア薬物送達研究での先行知見と類似しています。PLGA粒子によるサイズ依存的かつ培養条件依存的なマクロファージ細胞融合も実証されました。今後の研究では、共培養系での取り込みメカニズムを探り、食細胞存在下で喉頭癌細胞の取り込み指数を高める新規アプローチを設計すべきです。さらに、in vivo動物実験や臨床試験の前に、3D共培養または三重培養系におけるナノ薬物キャリアの細胞内輸送と運命の詳細な評価が必要です。これらはin vivo条件をより良く模倣するからです。