M2マクロファージ由来microRNA-18aがTGFBR3を標的としTGF-β経路で上咽頭癌進行を促進

要旨

目的

上咽頭癌（NPC）は高い転移・浸潤性を持つ上咽頭疾患です。腫瘍関連選択的活性化（M2）マクロファージがNPCに関与することが知られています。本研究は、M2マクロファージ由来のmicroRNA-18a（miR-18a）のNPCにおけるメカニズムと関与を探究することを目的とします。

方法

末梢血単核球をマクロファージに分化させ、インターロイキン-4でM2型に極性化させました。SUNE-1およびCNE2細胞を、miR-18aまたはトランスフォーミング増殖因子-βIII型受容体（TGFBR3）の回復/枯渇でトランスフェクトし、TGF-βシグナル経路の関与下でNPC進行におけるそれらの役割を探りました。次に、miR-18aまたはTGFBR3を回復/枯渇させたM2マクロファージとSUNE-1およびCNE2細胞を共培養し、TGF-βシグナル経路の関与下でのこれらの因子の複合的役割を理解しました。

結果

NPC細胞ではmiR-18aが高発現、TGFBR3が低発現でした。miR-18a回復、TGFBR3ノックダウン、またはmiR-18aミミックまたはsi-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージとの共培養は、SUNE-1細胞進行、マウスでの腫瘍増殖を促進し、p-Smad1/t-Smad1を減少、p-Smad3/t-Smad3を増加させました。miR-18aダウンレギュレーション、TGFBR3過剰発現、またはmiR-18aインヒビターまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージとの共培養は、CNE2細胞進行、マウスでの腫瘍増殖を抑制し、p-Smad1/t-Smad1を増加、p-Smad3/t-Smad3を減少させました。

結論

本研究は、M2マクロファージ由来miR-18aがTGFBR3抑制を介し、Smad1不活性化とSmad3活性化を伴ってNPC細胞進行とヌードマウスでの腫瘍増殖を促進することを解明しました。

はじめに

上咽頭癌（NPC）は局所浸潤と早期遠隔転移をきたしやすい上皮性悪性腫瘍です。NPC患者はしばしば第6脳神経麻痺やホルネル症候群を訴えます。現在の主たる治療は放射線療法、および放射線化学療法の併用です。残念ながら、これらは予期せぬ合併症を伴うことがあり、放射線療法に対する獲得抵抗性がNPCの転帰を妨げています。したがって、潜在的な標的療法の探求が優先課題となっています。

制御不全のmicroRNA（miRNA）は、NPCの腫瘍形成、転移、浸潤、放射線/化学療法抵抗性に関与することが記録されています。miRNAのサブファミリーであるmiR-18aは、genitalia 1の形成抑制因子阻害とmTOR経路活性化を通じてNPC進行を促進することが見つかっています。また、miR-18aはDICER1制御を介してNPC細胞増殖と転移を活性化することも検証されています。さらに、miRNA生合成障害を通じてNPC細胞進行を駆動すること、NPC転移に決定的役割を果たすことも記録されています。選択的活性化（M2）マクロファージは固形および造血器悪性腫瘍の重要な構成要素で、進行、転移、治療抵抗性と関連します。M2極性化腫瘍関連マクロファージはNPCの不良予後と関連します。Epstein-Barrウイルス陰性/陽性NPCにおけるM2マクロファージの差異も興味深く記録されています。miR-18aがM1マクロファージ誘導により大腸癌細胞の肝転移を抑制する研究もあります。トランスフォーミング増殖因子-βIII型受容体（TGFBR3）は、II型TGF-β受容体リガンドを提供してシグナル伝達を刺激し、細胞表面のバランスをとるTGF-β共受容体であり、可溶性TGFBR3は癌進行中の調節因子です。低発現TGFBR3は免疫寛容性腫瘍微小環境を誘導すると報告されています。逆に、TGFBR3の一過性過剰発現はヒトNPC細胞でアポトーシスを誘導します。我々の知る限り、miR-181aによるM2マクロファージ極性化が、Kruppel-like factor 6とCCAAT/enhancer binding protein α軸を介してM2マクロファージ媒介腫瘍細胞転移を促進する研究があります。

以上のように、miR-18a、TGFBR3、M2マクロファージのNPCにおける独立した役割は多くの研究で発見されていますが、これら3因子の複合的相互作用は依然として不明です。本研究は、これらの因子のNPCにおけるメカニズムと関与を解明するために実施されました。

材料と方法

倫理声明

実験は中南大学第三湘雅病院倫理委員会の承認を受け、医学倫理基準を満たしました。全ドナーから文書による同意を得て実施しました。動物実験は国立実験動物管理および使用規則に準拠しました。

末梢血単核球の採取

健常ドナーの末梢血から粘着法で単球を得ました。末梢血検体は中南大学第三湘雅病院血液内科の健常ドナーから採取しました。密度勾配遠心分離（Ficoll-Paque、GE Healthcare）でバフィコートから単核球（PBMCs）を分離し、12ウェルプレート（NalgeNunc、NY、USA）でDMEM（10%ヒト血清、ペニシリン/ストレプトマイシン補充）に2.0×10⁶ PBMCsを培養しました。PBMCsが壁に付着した2–3時間後、上清と浮遊PBMCsを繰り返し除去して付着単球を得ました。

マクロファージ極性化

単球をヒトマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）でマクロファージに分化誘導し、インターロイキン（IL）-4でM2マクロファージに極性化させました。

マクロファージ誘導

単球を20%胎仔牛血清（FBS）-DMEMで培養し、M-CSF（100 μg、Peprotech、NJ、USA）を終濃度100 ng/mLで添加。培地を3日ごとに半量交換し、100 ng/mL M-CSFを補充。7–8日目まで培養し、一部を回収してマクロファージ表面マーカーCD68、CD163、CD206を免疫蛍光法で検出しマクロファージを同定しました。

マクロファージ極性化

分化培地に20 ng/mL IL-4（Peprotech）を添加し、さらに24時間でM2マクロファージに極性化。一部をフローサイトメトリー検出用としました。検体を3チューブに分け：チューブ1はIL-4非刺激の同一バッチ付着マクロファージ、チューブ2、3はIL-4刺激付着マクロファージ。約10,000細胞に希釈し、非特異的免疫グロブリンGでFc受容体をブロック。非特異的アイソタイプ抗体、PE標識CD68抗体、PE標識CD163抗体（共にBiolegend、CA、USA）を添加。30分インキュベーション後、0.5%牛血清アルブミン/PBSで洗浄、遠心分離し、500 μL PBSで細胞懸濁液を作製して検出しました。

逆転写定量PCR

逆転写定量PCR（RT-qPCR）で、回収細胞のmiR-18a、CCL22、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPAR-γ）、TGFBR3 mRNA発現を検出しました。Trizol（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）で総RNA抽出し、miR-18aはMir-X miRNA First Strand Synthesis Kit（Clontech、Mountain View、CA、USA）、CCL22、PPAR-γ、TGFBR3はPrimeScript RT Master Mix Kit（Takara、Dalian、China）で相補RNAに逆転写。U6とグリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）をローディングコントロールとし、SYBR Premix Ex Taq II（Takara）をLightCycler 480 IIシステム（Roche Diagnostics、Indiana、USA）で使用。データ計算は2^(-ΔΔCT)法で評価。PCRプライマーは表1に示しました。

ウェスタンブロット法

回収細胞のTGFBR3、total（t）-Smad1、phosphorylated（p）-Smad1、t-Smad3、p-Smad3タンパク検出にウェスタンブロット法を適用。総タンパク抽出後、ビシンコニン酸キットで濃度決定。SDS-PAGEで電気泳動後、PVDF膜に転写。脱脂粉乳でブロッキング後、一次抗体：TGFBR3（1:2000、R&D Systems、Minneapolis、MN、USA）、t-Smad1（1:1000）、p-Smad1（1:1000、Santa Cruz Biotechnology）、t-Smad3（1:1000）、p-Smad3（1:1000）、GAPDH（1:1000、全てAbcam、Cambridge、MA、UK）でインキュベート、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体（1:500、Jackson ImmunoResearch Laboratories、PA、USA）。TBS-Tで3回洗浄後、ECLで発色。シグナル定量はNIH ImageJで実施、GAPDHで正規化。

細胞培養とスクリーニング

ヒトNPC細胞株CNE2、TW03、C666-1、SUNE-1と正常ヒト上咽頭細胞株NP96（上海生命科学研究院、中国科学院、上海、中国）を、RPMI-1640培地（Gibco、CA、USA）にFBS、ペニシリン100 μg/mL、ストレプトマイシン100 μg/mLを添加して培養、80%コンフルエンスで継代。RT-qPCRでmiR-18a発現を検出。NPC細胞株中で、CNE2とSUNE-1がNP96細胞とのmiR-18a発現差が最大と最小であったため、それぞれmiR-18aダウンレギュレーションとアップレギュレーションアッセイに選択しました。

細胞グループ分けと処理

全NPC細胞株中、NP96細胞とのmiR-18a発現差が最小のSUNE-1細胞を選択。Lipofectamine 2000（Invitrogen）仕様に従い、SUNE-1細胞をmiR-18aミミック、miR-18aミミックNC、si-TGFBR3、si-TGFBR3 NCでトランスフェクト。NP96細胞とのmiR-18a発現差が最大のCNE2細胞を選択し、miR-18aインヒビター、miR-18aインヒビターNC、OE-TGFBR3、OE-TGFBR3 NCでトランスフェクト。Lipofectamine 2000仕様に従い、M2マクロファージをmiR-18aミミック、miR-18aミミックNC、si-TGFBR3、si-TGFBR3 NC、miR-18aインヒビター、miR-18aインヒビターNC、OE-TGFBR3、OE-TGFBR3 NCでトランスフェクト。

M2マクロファージとNPC細胞の共培養

Transwellチャンバーでの細胞共培養で、M2マクロファージ由来miRNAのNPC細胞への影響を探りました。上部チャンバーにM2マクロファージを入れ、孔径0.4 μmで上部チャンバー細胞のみ通過を阻止し、小分子（小胞、増殖因子、栄養素等）は通過可能としました。下部チャンバーにNPC細胞を播種。SUNE-1とCNE2は通常FBS（Gibco）でインキュベートし、対数増殖期の細胞を実験に用いました。SUNE-1とCNE2細胞を、10% FBS-RPMI-1640培地（Gibco）で、孔径0.4 μmのTranswellインサート培養皿（Coring、Corning、NY、USA）でM2マクロファージと共培養しました。SUNE-1細胞は：M2マクロファージ非共培養、非トランスフェクトM2マクロファージ共培養、miR-18aミミックトランスフェクトM2マクロファージ共培養、miR-18aミミックNCトランスフェクトM2マクロファージ共培養、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養、si-TGFBR3 NCトランスフェクトM2マクロファージ共培養。CNE2細胞は：非共培養、非トランスフェクトM2マクロファージ共培養、miR-18aインヒビタートランスフェクトM2マクロファージ共培養、miR-18aインヒビターNCトランスフェクトM2マクロファージ共培養、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養、OE-TGFBR3 NCトランスフェクトM2マクロファージ共培養。

MTTアッセイ

細胞生存率をMTTアッセイで測定。ミトコンドリア脱水素酵素活性を測定し、MTTをホルマザンに還元させる比色法です。トリプシン処理後、96ウェルプレートに4×10⁴ cells/wellで播種。0、12、24、36、48時間で培地を除去し、MTT溶液（500 μL、0.5 g/L）添加。4時間インキュベート後、上清除去し、ジメチルスルホキシド溶液（200 μL）添加。光学密度（OD、490 nm）をマイクロプレートリーダー（ELX808IU、BioTek、VT、USA）で測定。各群6並列ウェルで実施。

コロニー形成アッセイ

NPC細胞のコロニー形成能をコロニー形成アッセイで測定。細胞集団依存性とクローナル増殖を反映。24時間培養後、0.25%トリプシンで剥離し、35 mmディッシュに300細胞播種、各群3並列ウェル。培地を3日ごとに交換し、1週間培養後、4%パラホルムアルデヒド5 mLで固定。結晶紫染色液で染色後自然乾燥。ディッシュを逆さまにし、グリッド付き透明フィルムを重ね、顕微鏡下でコロニー数（50細胞以上）をカウント。

スクラッチテスト

細胞遊走をスクラッチテストで測定。トリプシン処理後、6ウェルプレートに各群3並列ウェルで播種、90%コンフルエンスまで培養。2% FBS培地でインキュベートし、100 μLチップで垂直スクラッチを作製。0時間と24時間で倒立顕微鏡下で撮影し、遊走距離を測定。

Transwellアッセイ

細胞侵襲と遊走をTranswellアッセイで測定。上部チャンバーをプレ浸透し、Matrigel（Coring）100 μLを血清フリーRPMI 1640培地で1:100に希釈して添加。上部/下部チャンバーにそれぞれ200 μL、600 μL血清フリーRPMI 1640培地添加。下部チャンバーに10% FBS含有RPMI 1640培地600 μL、上部チャンバーに細胞懸濁液（12.5×10⁴ cells/mL）200 μL添加。40時間インキュベート後、結晶紫染色し、綿棒で拭き取り、Matrigelを通過した細胞を顕微鏡下でカウント。

フローサイトメトリー

細胞アポトーシスと細胞周期分布をフローサイトメトリーで測定。細胞周期分布はヨウ化プロピジウム（PI）染色で評価。6ウェルプレートに4×10⁵ cells/wellで播種、70–80%コンフルエンスまで培養。プレ冷却70%エタノールで一晩固定、遠心分離（上清除去）、RNAase（1 g/L、200 μL）とTriton X-100（2 μL）添加、PI染色液で30分染色。フローサイトメーター（BD Bioscience、NJ、USA）で488 nm、各フェーズ（G0/G1、S、G2/M）の蛍光強度差で検出。アポトーシスはAnnexin V-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）とPI二重染色で測定。500 μLバインディングバッファーに再懸濁、Annexin V-FITC染色液5 μLとPI溶液10 μLで染色。30分以内に遮光下でフローサイトメーター（BD Bioscience）で測定。散布図で、左下象限（Q4）生存細胞はFITC⁻/PI⁻、右下象限（Q3）初期アポトーシス細胞はFITC⁺/PI⁻、右上象限（Q2）後期アポトーシス/壊死細胞はFITC⁺/PI⁺。アポトーシス率＝初期アポトーシス率（Q3）＋後期アポトーシス率（Q2）。

ヌードマウスへの腫瘍異種移植

NPCモデルをヌードマウスに確立し腫瘍増殖を観察。0.25%トリプシンで剥離し、対数期のSUNE-1とCNE2細胞を5×10⁷ cells/mLの単細胞懸濁液に調製。細胞懸濁液（0.2 mL）をマイクロインジェクタでマウス右腋窩に注射しモデル作製。モデルマウスをSPF環境で飼育。4日目から腫瘍増殖を観察、4日ごとに体重測定。注射後20日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出、電子天秤で重量測定、撮影。

デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ

miR-18aとTGFBR3 mRNA 3'非翻訳領域（UTR）の結合部位を確認するためデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子システムを採用。生物学的予測サイト（https://www.microrna.org/microrna/home.do）でmiR-18aの標的遺伝子を解析し、TGFBR3 3'UTRにmiR-18aの相補的結合部位存在を発見。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでTGFBR3がmiR-18aにより直接標的化されるか検証。pmirGLO-TGFBR3-wild type（WT）とpmirGLO-TGFBR3-mutant type（MUT）を構築。TGFBR3-WTまたはTGFBR3-MUTとmiR-18aミミックまたはミミックNCをSUNE-1とCNE2細胞にLipofectamine 2000で共トランスフェクト、48時間インキュベート。ルシフェラーゼアッセイキット（Promega、Madison、WI、USA）で解析。

統計解析

SPSS21.0（IBM Corp.、Armonk、NY、USA）で解析。データを平均±標準偏差で表現。2群間差はt検定、多群間差は一元配置分散分析（ANOVA）後、Tukey事後検定。P < 0.05で有意差ありと判定。

結果

M2マクロファージの同定

健常ドナー末梢血から粘着法で濃縮した単球とM-CSF誘導単球を回収。CD68、CD206、CD163の免疫蛍光検出で、M-CSFによるin vitro誘導で典型的分子特性を持つマクロファージへの分化を確認（図1a）。

得られたマクロファージをIL-4で極性化し顕微鏡下で形態観察。IL-4非刺激マクロファージ（M0）は多様で不規則、円形、楕円形、紡錘形。IL-4刺激でM2マクロファージは大型化し、主に円形になり、先行研究で記載されたM2マクロファージ形態的特徴と一致（図1b）。

フローサイトメトリーで20 ng/mL IL-4、24時間刺激付着細胞の表面抗原を検出。CD68が21.16%、CD163が98.69%で発現し、M2マクロファージであることを確認（図1c）。RT-qPCRでM0細胞と比較し、CCL22とPPAR-γ（典型的極性化分子）がM2マクロファージで増加（図1d、e）、M2マクロファージ誘導成功を示唆。

RT-qPCRで、M0マクロファージと比較しM2マクロファージでmiR-18a発現増加（P < 0.05）を確認（図1f）。

NPC細胞でmiR-18a高発現、TGFBR3低発現

バイオインフォマティクスサイト（miRanda）でmiR-18aの潜在標的を予測し、TGFBR3を標的の一つと特定（図2a）。デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイでmiR-18aのTGFBR3 3'UTR標的化を検証。TGFBR3-WTまたはTGFBR3-MUTをpmirGLOベクターにクローニングし、miR-18aミミックまたはNCとSUNE-1、CNE2細胞に共トランスフェクト。miR-18aミミックはTGFBR3 3'UTR-MUTのルシフェラーゼ活性に影響せず、TGFBR3 3'UTR-WTの活性をSUNE-1とCNE2細胞で阻害し、TGFBR3がmiR-18aにより制御される標的遺伝子であることを示唆（図2b）。

miR-18aミミックまたはインヒビタートランスフェクトM2マクロファージでのトランスフェクション効率を、RT-qPCRとウェスタンブロットでmiR-18aとTGFBR3発現測定により確認。明らかに（図2c、d）、miR-18a過剰発現でM2マクロファージのmiR-18a発現上昇、TGFBR3発現低下。逆にmiR-18a阻害でmiR-18a発現低下、TGFBR3発現上昇。si-TGFBR3トランスフェクトではmiR-18a発現変化なし、TGFBR3発現低下。OE-TGFBR3トランスフェクトではmiR-18a発現変化なし、TGFBR3発現上昇。

CNE2、TW03、C666-1、SUNE-1、NP96細胞株のmiR-18aとTGFBR3発現をRT-qPCRとウェスタンブロットで測定。NPC細胞ではNP96細胞と比較し、miR-18a発現上昇、TGFBR3発現低下（図2e）。CNE2とSUNE-1がNP96からのmiR-18a発現差で最大と最小を示したため、以降のmiRNAダウン/アップレギュレーションアッセイに選択。

miR-18aとTGFBR3のNPC細胞への影響を調べるため、SUNE-1をmiR-18aミミックまたはsi-TGFBR3、CNE2をmiR-18aインヒビターまたはOE-TGFBR3でトランスフェクト。RT-qPCRとウェスタンブロットで、miR-18aミミックはSUNE-1でmiR-18a上昇、TGFBR3低下。si-TGFBR3はmiR-18aに影響せずTGFBR3低下。miR-18aインヒビターはCNE2でmiR-18a低下、TGFBR3上昇。OE-TGFBR3はmiR-18aに影響せずTGFBR3上昇（図2f、g）。

M2マクロファージ由来miR-18aのNPC細胞への影響を探るため、miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージをTranswellチャンバーでSUNE-1またはCNE2細胞と共培養。RT-qPCRとウェスタンブロットでSUNE-1またはCNE2細胞のmiR-18aとTGFBR3発現測定。SUNE-1細胞は非トランスフェクトまたはmiR-18aミミックトランスフェクトM2マクロファージと共培養でmiR-18a上昇、TGFBR3低下。si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養ではmiR-18a変化なし、TGFBR3低下（図2h）。CNE2細胞は非トランスフェクトM2マクロファージ共培養でmiR-18a上昇、TGFBR3低下。しかし、miR-18aインヒビタートランスフェクトM2マクロファージ共培養ではmiR-18a低下、TGFBR3上昇。OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養ではmiR-18a変化なし、TGFBR3上昇（図2i）。

M2マクロファージ由来miR-18aがNPC細胞生存率とコロニー形成能を促進

MTTアッセイとコロニー形成アッセイで、miR-18aとTGFBR3のSUNE-1とCNE2細胞の生存率とコロニー形成能への影響を調査。SUNE-1にmiR-18aミミック、si-TGFBR3、CNE2にmiR-18aインヒビター、OE-TGFBR3をトランスフェクト。SUNE-1ではmiR-18a上昇またはTGFBR3低下で細胞生存率上昇、コロニー数増加（図3a、e）。CNE2ではmiR-18a阻害またはTGFBR3過剰発現で細胞生存率低下、コロニー数減少（図3b、f）。

M2マクロファージ由来miR-18aのNPC細胞生存率とコロニー形成能への影響を調べるため、miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージをTranswellチャンバーでSUNE-1またはCNE2細胞と共培養。MTTとコロニー形成アッセイで、SUNE-1は非トランスフェクト、miR-18aミミックトランスフェクト、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で細胞生存率強化、コロニー数増加（図3c、g）。CNE2は非トランスフェクトM2マクロファージ共培養で細胞生存率強化、コロニー数増加。しかし、miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養では細胞生存率低下、コロニー数減少（図3d、h）。

M2マクロファージ由来miR-18aがNPC細胞侵襲と遊走能を促進

miR-18aとTGFBR3がNPC細胞遊走と侵襲に及ぼす影響を理解するため、スクラッチテストとTranswellアッセイを実施。SUNE-1をmiR-18aミミックまたはsi-TGFBR3トランスフェクトで、遊走距離と侵襲細胞数増加（図4a、5a）。CNE2をmiR-18aインヒビターまたはOE-TGFBR3トランスフェクトで、遊走距離と侵襲細胞数減少（図4b、5b）。

M2マクロファージ由来miR-18aの侵襲と遊走能への影響を、miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージとSUNE-1またはCNE2共培養で解析。SUNE-1は非トランスフェクト、miR-18aミミックトランスフェクト、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で遊走距離と侵襲細胞数増加（図4c、5c）。CNE2は非トランスフェクトM2マクロファージ共培養で遊走距離と侵襲細胞数増加。miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養では遊走距離と侵襲細胞数減少（図4d、5d）。

M2マクロファージ由来miR-18aがNPC細胞のG0/G1期停留を減らしアポトーシスを抑制

フローサイトメトリーで細胞周期分布とアポトーシスを測定し、miR-18aとTGFBR3のNPC細胞への影響を層別化。miR-18aミミックまたはsi-TGFBR3トランスフェクトで、SUNE-1のG0/G1期細胞減少、S期とG2/M期細胞増加、アポトーシス率低下（図6a、7a）。miR-18aインヒビターまたはOE-TGFBR3トランスフェクトで、CNE2のG0/G1期細胞増加、S期とG2/M期細胞減少、アポトーシス率上昇（図6b、7b）。

M2マクロファージ由来miR-18aのNPC細胞周期分布とアポトーシスメカニズムを解明するため、miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージをTranswellチャンバーでSUNE-1またはCNE2と共培養。非トランスフェクト、miR-18aミミックトランスフェクト、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で、SUNE-1のG0/G1期細胞減少、S期とG2/M期細胞増加、アポトーシス率低下（図6c、7c）。非トランスフェクトM2マクロファージ共培養でCNE2のG0/G1期減少、S期とG2/M期増加、アポトーシス率低下。逆に、miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で、CNE2のG0/G1期増加、S期とG2/M期減少、アポトーシス率上昇（図6d、7d）。

M2マクロファージ由来miR-18aがNPC細胞でp-Smad1/t-Smad1を減少、p-Smad3/t-Smad3を増加

ウェスタンブロットでNPC細胞のTGFシグナル経路関連タンパクを検出し、miR-18aとTGFBR3のTGFシグナル経路への影響をさらに説明。miR-18aミミックまたはsi-TGFBR3トランスフェクトで、SUNE-1のp-Smad1/t-Smad1減少、p-Smad3/t-Smad3増加（図8a）。miR-18aインヒビターまたはOE-TGFBR3トランスフェクトで、CNE2のp-Smad3/t-Smad3減少、p-Smad1/t-Smad1増加（図8b）。

M2マクロファージ由来miR-18aのNPC細胞TGFシグナル経路への影響を、miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージとTranswellチャンバーで共培養したSUNE-1とCNE2のウェスタンブロットで測定。非トランスフェクト、miR-18aミミックトランスフェクト、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で、SUNE-1のp-Smad1/t-Smad1減少、p-Smad3/t-Smad3増加（図8c）。非トランスフェクトM2マクロファージ共培養でCNE2のp-Smad1/t-Smad1減少傾向、p-Smad3/t-Smad3増加傾向。逆に、miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養で、CNE2のp-Smad1/t-Smad1増加、p-Smad3/t-Smad3減少（図8d）。

M2マクロファージ由来miR-18aがNPCを持つヌードマウスで腫瘍増殖を誘導

ヌードマウスへの腫瘍異種移植で、miR-18aとTGFBR3のNPC腫瘍増殖への影響をさらに解明。miR-18aミミックトランスフェクトまたはsi-TGFBR3トランスフェクトSUNE-1細胞注射マウスで、腫瘍体積拡大、腫瘍重量増加（図9a）。miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトCNE2細胞注射マウスで、腫瘍体積と重量減少（図9b）。

miR-18aミミック/インヒビター、si-TGFBR3、OE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ注射マウスで腫瘍増殖観察し、M2マクロファージ由来miR-18aのNPCメカニズムを解明。非トランスフェクト、miR-18aミミックトランスフェクト、si-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養後SUNE-1注射マウスで、腫瘍体積拡大、重量増加（図9c）。CNE2をM2マクロファージ共培養後注射マウスで腫瘍体積と重量増加傾向。miR-18aインヒビタートランスフェクトまたはOE-TGFBR3トランスフェクトM2マクロファージ共培養後CNE2注射マウスで、腫瘍体積と重量減少傾向（図9d）。

考察

NPCは幅広い因子によって脅かされる多遺伝子疾患です。miRNAは標的遺伝子制御を通じて、細胞プロセスと経路の指標としてNPC発症に関与することが示唆されています。具体的に、miR-18aはmiRNA生合成障害によりNPC進行を促進します。本研究は、M2マクロファージ由来miR-18aとTGFBR3のNPCにおける複合的相互作用を解明し、miR-18aがTGFBR3抑制を介してNPC進行を刺激することを結論づけました（図10）。

本研究冒頭で、マクロファージをIL-4刺激でM2マクロファージに分化させ、miR-18a発現が豊富になることを確認しました。マクロファージ極性化時にmiRNA発現が変化することが知られています。また、M2極性化は細胞周期と代謝プロセス関連遺伝子を豊富にし、M2表現型は新生組織での腫瘍増殖と血管新生に有利です。M2マクロファージ豊富なmiR-18aに基づき、一連の実験を成功裏に実施しました。

まず、NPC細胞でmiR-18a高発現、TGFBR3低発現を発見。先行研究で、miR-18aがNPC組織で過剰発現し、リンパ節転移と臨床ステージと関連することが結論づけられています。また、miR-17-92クラスターメンバー（miR-18a含む）がNPC組織で過剰発現することも記録されています。さらに、上昇したmiR-18aがNPC組織で腫瘍ノード転移ステージと腫瘍サイズと関連することも報告されています。実験的には、舌扁平上皮癌でTGFBR3ダウンレギュレーション、明細胞腎細胞癌でTGFBR3低下と不良予後の関連など、本研究結果と一部整合的です。

miR-18aとTGFBR3のNPC細胞進行における役割を探るため、一連のアッセイを実施。結果は、miR-18a上昇またはTGFBR3低下がNPC細胞進行を促進し、miR-18a抑制またはTGFBR3上昇が逆効果を示すことを示しました。広く、miR-18a抑制が卵巣癌、大腸炎関連大腸癌、肝細胞癌など悪性腫瘍で細胞進行を阻害することが証明されています。狭義には、上昇したmiR-18aがDICER1媒介でNPC細胞進行を促進する研究があります。また、NPCで過剰発現したmiR-18aが転移と関連し、miR-18a抑制がNPC患者予後改善に部分的に寄与することにも注目されています。最近、miR-18aダウンレギュレーションがNPC増殖、侵襲、遊走を抑制できることが調査されています。さらに、TGFBR3発現低下が喉頭扁平上皮癌（LSCC）侵襲と関連し、miR-223/TGFBR3軸制御がLSCC進行抑制に参加することも記録されています。TGFBR3上昇はNPC細胞生存率制限、アポトーシス誘導、プロアポトーシスシグナル経路活性化が記録されています。先行研究で、TGFBR3上昇がアポトーシス促進とG2/M期停留で、唾液腺腺様嚢胞癌の細胞生存率と遊走を阻害することが示されています。興味深いことに、TGFBR3誘導が肝内胆管癌進行を破綻させることが記載されています。

低発現miR-18aと過剰発現TGFBR3のNPC細胞in vitroでの保護的役割にもかかわらず、ヌードマウスへの腫瘍異種移植をin vivoで実施しさらに検証。結果は、miR-18aノックダウンまたはTGFBR3上昇がヌードマウス腫瘍増殖を抑制することを説明。先行研究で、miR-18a注射ヌードマウスで腫瘍増殖増強、逆にmiR-18aアンタゴミア注射ヌードマウスでNPC腫瘍増殖抑制が示されています。TGFBR3低下による腫瘍増殖では、TGFBR3低発現が明細胞腎細胞癌で腫瘍形成を誘発することが示唆されています。逆に、TGFBR3上昇は長鎖非コーディングRNA ADAMTS9アンチセンスRNA2上昇とmiR-223-3p抑制の存在下で肺癌腫瘍増殖を阻害することが認識されています。本研究ではTGFBR3がmiR-18aの標的遺伝子であることも予測・検証しましたが、更なる検証研究が必要です。

結論

総括すると、本研究はM2マクロファージ由来miR-18aがTGFBR3発現を抑制し、TGF-βシグナル経路を介してNPC進行を悪化させる具体的メカニズムを詳細に説明し、その結果はmiR-18aノックダウンまたはTGFBR3上昇によって阻害されます。本研究はNPCの治療標的を更新しました。しかし、大規模コホート研究による更なる深い探求が依然として必要です。

データおよび資料の入手可能性

該当なし。