インテグリンαvβ3を標的とするデュアルモードプローブの合成とinvitro研究

背景

悪性腫瘍の浸潤と遠隔転移が治療失敗の主な原因となっています。悪性腫瘍転移のプロセスには、細胞外マトリックス（ECM）と腫瘍新生血管系の破壊が必要です[1]。したがって、腫瘍血管新生に関連する分子マーカーのin vitro非侵襲的モニタリングは、腫瘍転移の予測と早期診断において特に重要です。インテグリンα _v β ₃ 腫瘍新生血管系の広く研究されている分子マーカーである、は、大きな注目を集めています。このインテグリンは、腫瘍の血管新生中の血管内皮細胞の接着、増殖、および分化と密接に関連しています[2]。

分子イメージングの進歩により、分子レベルでの腫瘍増殖の非侵襲的モニタリングが可能になりました。対象となる標的分子の分子イメージング研究には、2つの基本的な要素が必要です。（1）適切なターゲティングコンポーネントと（2）イメージング技術で検出できる信号コンポーネントです。インテグリンα _v β ₃ は、ECMタンパク質のアルギニン-グリシン-アスパラギン酸（Arg-Gly-Asp、RGD）配列を特異的に認識して結合し、コンフォメーション変化によって活性化されます。したがって、RGD配列は、重要なターゲティングコンポーネントとして腫瘍ターゲティングトレーサーの合成に広く使用されています[3]。磁気共鳴（MR）イメージングは​​、非電離放射線、高い軟組織分解能、および無制限の浸透深度により、腫瘍を監視するための最も強力な分子イメージング診断ツールの1つになっています[4、5]。統計分析によると、MR検査の約50％は、画像の品質を向上させるために造影剤の使用を必要とします[6、7]。近赤外蛍光イメージングは​​光学イメージングの一種であり、最も早く発見された非可視光である近赤外光の波長は700〜900nmの範囲です。近赤外蛍光イメージング技術により、外科医は手術中に腫瘍を視覚化し、描写し、切除することができます[8、9]。ただし、人間の病気のスペクトルの変化に伴い、シングルモード分子イメージングは​​、偽陽性率と偽陰性率が高いため、正確な診断の要件を満たすことができません。したがって、複数のモードの統合に基づく分子イメージング技術は、分子イメージングの開発における新しいトレンドとなるでしょう[10]。

この研究では、腫瘍の組織学的および機能的イメージングに使用できるデュアルモード分子プローブcRGD-Gd-Cy5.5を準備しました（スキーム1）。 Fe ₃ を使用した分子プローブとの比較 O ₄ 信号ユニット[11、12]として、cRGD-Gd-Cy5.5は、（a​​）高い常磁性（Gd ^{3 +} の周りの7つの不対電子）で際立っていました。 ）; （b）担体と結合して、クリニックで広く使用されているマグネビストなどの安定したキレート剤を形成する能力。 （c）高い空間分解能、およびネガティブ造影剤よりも高い画像解像度[13、14]。MR造影剤を蛍光造影剤に結合する担体分子としてリポソームを選択しました。一般的なリン脂質は、分子構造に2つの長い疎水性炭化水素鎖と親水性基を持っています。水または緩衝液に添加すると、適切な量のリン脂質分子が特定の方向に配置され、親水性基が両側の水相に面し、疎水性炭化水素鎖が互いに面してリポソームの二重層を形成します。 RGDを標的とする環状ペプチドとCy5.5蛍光分子は、アミノ基を持つ導入されたポリエチレングリコール（PEG）リン脂質を介してリポソーム表面に結合され、最後にGdイオンがリポソームにカプセル化され、標的化されたマルチモーダル分子プローブの構築が達成されました。構造、組成、サイズ、形状、安定性、およびMR緩和能の点で望ましい特性を備えています。その細胞適合性は、細胞毒性アッセイと細胞形態観察を通じて評価されました。最後に、invitro癌細胞のT1強調MRイメージングおよび蛍光イメージングに対するcRGD-Gd-Cy5.5の可能性を評価しました。

インテグリンα _v の高感度検出のための、Gdドープリポソームの合成経路、続いてRGDコンジュゲーションおよびバイオアプリケーション用のCy5.5 β ₃

結果

cRGD-Gd-Cy5.5ナノプローブの特性評価

cRGD-Gd-Cy5.5溶液は淡いピンク色の透明な液体であり、しばらく放置しても明らかな沈殿は見られず、良好な分散を示しています。透過型電子顕微鏡（TEM）により、cRGD-Gd-Cy5.5リポソーム複合体は、図1aに示すように、2％リンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色した後、顆粒の凝集や損傷がなく、均一なサイズの球形であることがわかりました。粒子サイズの分布は一貫しており、50〜80 nmの範囲で、平均粒子サイズは60.08±0.45nmでした。動的光散乱（DLS）を介して測定されたcRGD-Gd-Cy5.5リポソーム複合体の水和粒子サイズは124.2±0.215 nmでした（図1b）。図に示すように、ナノ粒子は水中で狭いサイズ分布を示し、良好な分散を示しました。表面のゼータ電位は39.5±1.65mVであり、正の表面電荷を示しています。これは、表面にアミノ基が存在することと一致しています（図1c）。

CRGD-GD-CY5.5ナノプローブの特性データ。 a cRGD-Gd-Cy5.5の低倍率TEM画像。 b 粒子サイズはサイズ分析によって検出され、プローブの平均サイズは124.2nmでした。 c ゼータ電位は約39.5mVで、見かけの表面は電気陽性です

多機能マイクロプレートアッセイでは、ブランクのリポソームにはUV吸収領域がなく、600nmの励起光で蛍光Cy5.5と結合したリポソームは685nmに明らかな吸収ピークを示し（図1a）、蛍光Cy5.5の発光波長と一致しています。 。蛍光分子は、Cy5.5がうまく結合したことを示しました。小動物蛍光イメージングシステムの結果は、600 nmの励起光の下で、リポソーム結合蛍光Cy5.5は明らかな赤色蛍光を示し、ブランクリポソームには蛍光シグナルがないことを示しました（図2b）。

cRGD-Gd-Cy5.5ナノプローブの蛍光特性。 a 蛍光Cy5.5で標識されたリポソームは、多機能酵素アナライザーによって検出され、600nmの励起光で670nmに可視発光ピークがありました。 b 600 nmの励起光の下では、リポソーム結合蛍光Cy5.5（左）には明らかな発光がありますが、ブランクリポソーム（右）には蛍光イメージングがありません

cRGD-Gd-Cy5.5ナノプローブのMR緩和測定

r1緩和率は、T1MR造影剤のイメージング性能を評価するための重要なパラメータです。したがって、異なるGd濃度でプローブcRGD-Gd-Cy5.5のT1緩和時間を測定しました。図3bに示すように、cRGD-Gd-Cy5.5のr1緩和率は10.515 mM ^-1 でした。 s ^-1 線形フィッティング後、臨床製品Magnevistよりもはるかに高い（4.56 mM ^-1 s ^-1 ）。 cRGD-Gd-Cy5.5の高いr1緩和率は、担体リポソームの特別な空間構造とリポソームの生物学的シグナル増幅効果の結果である可能性があります。 Gd濃度が増加すると、cRGD-Gd-Cy5.5はMR信号強度を増強しました（図3a）。これらの結果は、合成cRGD-Gd-Cy5.5がMRイメージングにおける高い画像コントラストのニーズを満たすことを示しています。

cRGD-Gd-Cy5.5ナノプローブの緩和特性。 a T1 - さまざまな濃度（Gd）でのこれらの粒子の重み付けされた画像（Siemens、Verio、3.0T、MOLLI、シーケンス：TR =5.8 ms、TE =3.66 ms、TI =16–3200 ms）。 b Gd濃度と緩和時間のフィッティング曲線。 cRGD-Gd-Cy5.5のr1値は10.515mM ^-1 でした。 s ^-1

cRGD-Gd-Cy5.5ナノプローブの細胞毒性研究

cRGD-Gd-Cy5.5のinvitro細胞毒性は、未処理グループ（100％）の細胞の生存率と比較して、CCK-8アッセイによって評価されました。すべての細胞は、テストされたGd濃度（50〜400μM）の範囲内で70％を超える細胞生存率を示し（図4）、この分子プローブが良好な細胞適合性を持っていることを示しています。特に、細胞生存率は、400μMGdとの24時間のインキュベーション後でも、70％を超えていました。これは、invitroおよびinvivoで使用される投与量よりも大幅に高い濃度です。

細胞毒性試験。異なる濃度のcRGD-Gd-とインキュベートしたヒト肺腺癌（A549）、鼻咽頭癌細胞株（SUNE-1-5-8F）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、および乳房正常細胞株（MCF10A）の細胞生存率Cy5.5で24時間

インテグリンαvβ3の蛍光抗体染色およびフローサイトメトリーアッセイ

免疫蛍光の結果は、A549および5-8F細胞におけるインテグリンαvβ3の発現が細胞膜および細胞質に局在していることを示しました。 A549細胞のインテグリンは主に細胞膜に存在し、A549細胞の表面の蛍光強度はSUNE-1-5-8F細胞のそれよりも高かった。 MCF-10A細胞の蛍光強度は非常に弱く、乳腺上皮細胞の表面にインテグリンαvβ3がほとんど発現していないことを示しています（図5a）。フローサイトメトリーの結果を図5cに示します。インテグリンαvβ3の発現レベルは次のようにランク付けされます：A549（89.07％）> SUNE-1-5-8F（63.84％）> MCF-10A（1.56％）、これは癌細胞のαvβ3レベルが正常な乳腺のレベルよりも有意に高かったことを示しています腺細胞。

A549、SUNE-1-5-8F、およびMCF-10A細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）画像。 a インテグリンαvβ3の細胞免疫蛍光画像。 A549およびSUNE-1-5-8F細胞株は細胞膜で発現し、MCF-10A細胞はインテグリンα _v をほとんど発現していません。 β ₃ 。 b 200μgmL ^-1 のcRGD-Gd-Cy5.5とインキュベートしたA549、SUNE-1-5-8F、およびMCF10A細胞 37°Cで1時間の濃度。細胞に結合したプローブの量は、細胞の免疫蛍光の結果と一致しています。 c A549、SUNE-1-5-8F、およびMCF-10A細胞におけるインテグリンαvβ3発現を検出するためのフローサイトメトリーアッセイ

cRGD-Gd-Cy5.5の細胞取り込み

免疫蛍光染色の結果に基づいて、cRGD-Gd-Cy5.5とインキュベートしたA549および5-8F細胞を実験群として使用し、cRGD-Gd-Cy5.5とインキュベートしたMCF-10A細胞を実験群として使用しました。対照群。 cRGD-Gd-Cy5.5とのインキュベーション後、A549細胞と5-8F細胞の両方の膜で赤色蛍光シグナルが観察され、A549細胞のシグナル強度はSUNE-1-5-8F細胞よりも高かった（図。 5b）。この結果は、免疫蛍光染色によって検出されたインテグリンαvβ3の発現と一致しています。対照群のMCF-10A細胞の膜にはほとんど赤色蛍光シグナルは見られませんでした。

インビトロMRイメージングおよび蛍光イメージング

その高いr1緩和率と良好な細胞適合性に基づいて、cRGD-Gd-Cy5.5はinvitroでの癌細胞のMRイメージング用の陽性造影剤として使用されました。図6a、bに示すように、T1強調MR画像の色は徐々に明るくなり、cRGD-Gd-Cy5.5で処理されたA549細胞のMR信号強度がGd濃度が高くなるにつれて増加したことを示しています。 t で示されるように、2つのグループ間のT1緩和時間の差は統計的に有意でした。 2つの独立したサンプルをテストします（ p <0.05）。これらのデータは、合成cRGD-Gd-Cy5.5が癌細胞のin vitroMRイメージングで陽性造影剤として使用される可能性があることを示唆しています。同様に、小動物の蛍光システムは、プローブ濃度が増加するにつれて、対応する蛍光強度の増加を示しました（図6c）。画像信号と特定のデータから、ターゲットグループ（cRGD-Gd-Cy5.5）のイメージング効果は非ターゲットグループ（Gd-Cy5.5）よりも優れていました。

細胞の磁気共鳴と蛍光イメージング。 a 細胞は、Gd濃度（0、0.005、0.01、0.02、0.04、および0.08（mM））に従って2時間A549細胞とインキュベートされました。対照群としてGd-Cy5.5を使用した。 b 対応する磁気共鳴画像のT1緩和時間。 c 小動物のライブイメージングシステムの画像

In VivoMRおよび蛍光イメージング

造影剤の注入前に取得されたMRI画像は、腫瘍と他の末梢器官/組織との間に有意な信号の違いを示さなかった。 CRGD-Gd-Cy5.5の注射後5分で、腫瘍部位の信号強度が強化され始めましたが、注射後6時間以降、安定した高信号が維持されました。テストグループでは、30分以降に腫瘍実質の強化が観察され、2時間後に強化が強化されました（図7a）。しかし、受容体遮断群では、腫瘍の縁に穏やかな強化のみが見られ、強化度は2時間で弱まり、すでに消失していました（図7a）。蛍光画像では、対象グループの蛍光強度は30分以降徐々に上昇しましたが、6時間目でも高いままであり（図7b）、血液循環が延長され、CRGD-Gd-Cy5.5が効率的に濃縮されていることを示しています。腫瘍。受容体遮断群では、試験したどの時点でも特定のプローブ濃度は観察されませんでした。 6時間目に、両側の腎臓で高強度の蛍光が観察されました（図7b）。 CRGD-Gd-Cy5.5の代謝経路は、腎臓系を通過するクリアランスである可能性があると推測されます。

ヌードマウス鼻咽頭癌皮下異種移植腫瘍モデルのMRおよび蛍光イメージング。 a ヌードマウスに麻酔をかけ、注射前と注射後0.5、2、6時間に3.0 TMRIスキャナーで画像を作成しました。 b ヌードマウスに麻酔をかけ、注射後0.5、2、6時間で蛍光イメージングシステムでイメージングしました

ディスカッション

インテグリンαvβ3は、腫瘍新生血管系の内皮細胞だけでなく、悪性黒色腫、悪性神経膠腫、前立腺癌、肺癌、乳癌細胞などのさまざまな腫瘍細胞の表面にも高度に発現しています[15]。 αvβ3は、通常の上皮細胞および成熟血管内皮細胞では低レベルで発現または発現されていません。上記の特性に基づいて、インテグリンαvβ3は腫瘍転移のinvivoモニタリングの理想的な標的になりました[16]。しかし、インテグリンαvβ3の発現レベルを測定する現在の方法には、非侵襲性、再現性、およびイメージングの適時性の問題があり、まだ解決されていません。上記の客観的な問題を考慮して、この研究では、インテグリンαvβ3発現のリアルタイムの動的モニタリングのためにデュアルモード分子プローブを合成しました。これにより、腫瘍転移の予測とモニタリングの目標が間接的に達成されました。

造影剤は、MRイメージングのメカニズムに応じて、Gd化合物（T1陽性造影剤）と常磁性酸化鉄ナノ粒子（T2陰性造影剤）の2種類に分類できます。他の造影剤と比較して、Gd化合物は臨床診療において比類のない利点を持っています[17]。超常磁性材料であるGdイオンは、T1強調画像で高強度の信号を提供します。 Gdは、さまざまな物質に結合して、高い空間分解能と高い信号対雑音比を備えた安定した複合体を形成することもできます。ただし、各タイプの造影剤には独自の制限があります（つまり、T1造影剤の短い血液循環時間とT2造影剤の磁化率アーチファクト）[18、19、20、21]。従来のGd化合物には、次の制限があります。 （1）従来のGdキレートにはターゲティング効果がありません。 （2）Gdキレート造影剤の信号強度は、同じ濃度の超常磁性酸化鉄粒子（USPIO）の信号強度よりも低くなっています。上記の問題を解決するために、Gdイオンを高分子構造（リポソーム、樹枝状分子、デキストランなど）に結合させてT1緩和効果を高め、次に複合体を腫瘍標的のリガンドに結合させて分子プローブを調製します腫瘍を標的としたイメージングを実現します[23]。この研究では、MR造影剤を蛍光造影剤に結合する担体分子としてリポソームを選択しました。リポソームの特殊な空間構造は生物学的信号増幅効果があり、局所組織中のGdイオンの濃度を効果的に改善し、それによってMR信号強度を高めます。周ら。 [24] RGDをGd化合物に結合する担体としてβ-シクロデキストリン結合多面体オリゴマーシルセスキオキサン（POSS）ナノ粒子を使用し、T1緩和速度が9.50 mM ^-1 S ^-1 。この研究で得られたリポソーム-cRGD-Gd-Cy5複合体は、10.515 mM ^-1 のT1緩和率を持っていることがわかりました。 S ^-1 、現在臨床で使用されているGd剤（マグネビスト）のT1緩和率の2倍以上であり、この複合体も優れたMRイメージング特性を示しました。

私たちのグループが作成したナノプローブは、サイズが均一で、外観が規則的で、分散性が良好です。ゼータ電位は分子プローブの安定性を反映しており、ゼータ電位の正または負の値が高いほど、システムがより安定し、凝集の可能性が低くなります。一般に、ゼータ電位が+ 30mVより高いまたは-30mVより低い分子は、良好な安定性があると見なされます。この研究で得られたプローブ粒子の表面のゼータ電位は+ 39.5±1.65mVであり、これは+ 30mVよりわずかに低い値です。それにもかかわらず、TEMでは凝集は観察されませんでした。

Gd剤は、現在の臨床診療で最も広く使用されているMR造影剤であり、そのバイオセーフティは無視できません。 Guo etal。 [25]は、樹枝状ヒアルロン酸と結合したGd複合体が、MR造影剤として非常に安全で効果的な微粒子であり、人体に高感度で残留物が少ないことを発見しました。構築された分子プローブのインビトロ細胞毒性の研究を通して、この分子プローブは、腫瘍細胞ならびに非腫瘍細胞（上皮細胞および血管内皮細胞）に対して低い細胞毒性および高い生物学的安全性を有することが実証された。リポソームは優れた生体適合性を備えており、生体毒性が低いことは、Gdイオンをカプセル化したリポソームの利点である可能性があります。

以前の研究[26,27,28]に基づいて、私たちのグループは、SUNE-1-5-8F鼻咽頭癌細胞を革新的に追加して、インテグリンαvβ3を高発現するA549肺腺癌細胞株を実験グループで使用するために選択しました。 invitro細胞標的実験のライン;インテグリンαvβ3の発現がほとんどない乳腺上皮細胞を陰性対照群として含めた。分子プローブは、A549肺腺癌細胞およびSUNE-1-5-8F鼻咽頭癌細胞の細胞膜によく結合しましたが、MCF-10A細胞には結合しませんでした。これは、プローブが優れた分子標的能力を持っていることを示しています。免疫蛍光アッセイの結果によって確認された。 MRイメージングの結果は、MRにおけるリポソームcRGD-Gd-Cy5.5分子プローブのターゲティング特性をさらに確認し、腫瘍細胞における非ターゲティング造影剤（Gd-Cy5.5）よりも高い強度のシグナルを示しました。インビボ実験により、プローブが血清中で安定した状態を維持し、少なくとも6時間は腫瘍部位を持続的に標的化できることが確認されています。インビトロ研究の結果は、ヌードマウスの鼻咽頭癌の転移モデルにおける分子プローブのその後のインビボ研究を確実にします。

結論

要約すると、インテグリンαvβ3を標的とするデュアルモードプローブcRGD-Gd-Cy5.5の調製方法は実行可能であり、このプローブは望ましい安定性とバイオセーフティ、および高いT1緩和率を備えています。プローブは、高インテグリンαvβ3発現を伴う細胞に対して強力なターゲティング効果を示しました。これは、MR /蛍光分子イメージングを介した解剖学的レベルおよび分子代謝レベルでの腫瘍転移の非侵襲的で効率的かつリアルタイムの動的モニタリングの確固たる基盤を築きました。インビボ。

メソッド

cRGD-Gd-Cy5.5の合成

20 mLのクロロホルムに、70 mgのレシチン、20 mgのコレステロール、および210 mgのDSPE-PEG2000-NHを添加し、混合物を超音波洗浄器に入れて物質を完全に溶解しました（粒状物質）。次に、溶液を洋ナシ型のフラスコに入れ、60°Cのウォーターバスで回転蒸発させて、ハニカム状のフィルム（液体の残留物がない）が形成されるようにしました。 Gd三塩化物六水和物（10 mg）を正確に秤量し、pH 8.5の炭酸緩衝液に溶解して透明な溶液を得た後、上記のハニカム状フィルムと混合して50°Cで1時間水和させました。このステップに続いて、超音波液体プロセッサー（VCX 750、Sonics、USA）の超音波プローブによる分散と精製が行われました。最後に、混合物を収集して0.22μmフィルターに通し、10 kD限外ろ過チューブで限外ろ過して、遊離のGd三塩化物を除去し、Gd三塩化物を含むリポソームを得て、4°Cで保存しました。

次に、RGD環状ペプチドを蛍光Cy5.5分子に結合させました。 RGD環状ペプチド（5 mg）をpH5.0の希塩酸緩衝液1mL、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）1mgおよび N <0.5mgに溶解しました。 / i> -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を添加し、一定温度の発振器で室温で30分間活性化しました。次に、活性化されたRGD環状ペプチド分子を100μgのCy5.5蛍光分子およびリポソームと混合し、精密pH試験紙を使用してpHを8.4と測定しました。次に、混合物をシェーカー内で室温で4時間インキュベートしました。このステップに続いて、10kD限外ろ過チューブを使用して未反応のRGD環状ペプチドと蛍光Cy5.5分子を除去しました。