環境に優しいマイクロプラズマ合成による黄色発光カーボン量子ドット：がん細胞イメージングと光触媒不活化への応用

概要

近年、診断と治療機能を併せ持つ多機能ナノ粒子がナノメディシンにおいて大きな可能性を示しています。本研究では、o-フェニレンジアミンを用いたマイクロプラズマ法による蛍光カーボンナノドット、すなわちカーボン量子ドット（CQDs）の環境に優しい合成を報告します。作製されたCQDsは380-500 nmに幅広い吸収ピークを示し、550 nmにピークを持つ明るい黄色蛍光を発光しました。CQDsはHeLaがん細胞によって速やかに取り込まれ、青色光励起下で明るい黄色蛍光信号と強力な反応性酸素種（ROS）を効率的に生成し、蛍光がん細胞イメージングと光力学的不活化を同時に実現、相対細胞生存率を40%低下させました。さらに、暗所で400 μg mL⁻¹ CQDsとインキュベート後、約98%の細胞が生存しており、CQDsの優れた生体適合性が明らかになりました。したがって、新規調製CQDsはin vivoバイオイメージングとイメージングガイドがん治療に効果的かつ安全な材料となり得ることが実証されました。

はじめに

がんは世界中で主要な死因の一つです。診断と治療の両機能を持つ多機能ナノ粒子はナノメディシンでの応用が期待されています。同時イメージングガイド療法はがん治療の新しい概念で、治療効率の最適化において大きな可能性を秘めています。腫瘍のサイズと位置、光療法の最適タイムウィンドウ、治療効果に関する有用な情報を提供できます。光力学療法（PDT）は時空間選択性と非侵襲性により多くのがんや疾患治療に用いられてきました。理想的な光感受性物質は一般的に以下の特性を持ちます：(1) 高効率な反応性酸素種（ROS）生成、(2) 良好な生体適合性、(3) 水溶性。しかし、現在のPDT応用は光感受性物質の水溶性不良、不安定性、非最適励起波長によって制限されています。したがって、環境に優しく低コストな方法で、良好な水溶性と生体適合性を持つ光感受性物質代替品を生成することが必要です。

カーボン量子ドット（CQDs）は、シンプルで環境に優しい合成、低毒性、優れた生体適合性、優れた水溶性、光安定性など独自の有益特性により多大な注目を集めています。CQDsは細胞イメージング、バイオセンシング、標的薬物送達、その他生物医学応用への潜在的用途があります。カーボンドット合成にはボトムアップとトップダウンの2つの主要アプローチがあります。トップダウン法には電気化学的酸化、レーザーアブレーション、化学酸化、超音波合成法が含まれます。ボトムアップ法は水熱処理、マイクロ波合成、熱分解で構成されます。しかし、高温、高圧、強酸が必要となるため常に大量のエネルギー消費、複雑なプロセス、環境への避けられない害をもたらします。したがって、時代の要請として新規環境に優しい合成法が出現しています。報告されているように、CQDsは高温条件、大量エネルギー投入、煩雑な手順なしで、マイクロプラズマ-液体法を用いてわずか数分で製造可能です。マイクロプラズマは、先進材料に関わる基礎研究と応用の両方に独自の物理化学環境を提供します。マイクロプラズマが提供する化学的・電子的環境は高度に非平衡でエネルギーを蓄積でき、多数の電子、イオン、フリーラジカル、その他励起・電離・活性物質を生成できます。o-フェニレンジアミンはカーボンナノドット合成の原料ですが、マイクロプラズマ合成では未使用でした。

本研究では、o-フェニレンジアミンを原料としてマイクロプラズマ処理によりCQDsを合成しました。この方法で生成されたCQDsはサイズが均一（直径約3.2 nm）で、約550 nmに発光ピークを示しました。新規合成CQDsが光条件下で大量のROSを生成することを実証。in vitroでは、CQDsがHeLa腫瘍細胞に取り込まれ、420-500 nmの青色波長励起下で黄色光を発光し、低毒性でした。また、460 nm照射下でHeLa腫瘍細胞の不活化を観察。これらの結果は、新規調製CQDsがin vivoバイオイメージング、イメージングガイドまたは標的がん治療の有望材料となり得ることを示唆しています。

結果と考察

CQDsのキャラクタリゼーション

本研究の黄色発光CQDsは、o-フェニレンジアミンを炭素前駆体としてマイクロプラズマ法により容易かつ環境に優しい方法で調製されました。マイクロプラズマ処理法がカーボンナノドット合成に用いられたとの報告はありますが、関連研究は稀です。図1AにCQD粒子の透過型電子顕微鏡（TEM）像を示します。マイクロプラズマで生成された粒子は円形または楕円形で、平均直径3.2 nmでした。高分解能像（図1Aインセット）から、CQDsの格子間隔は0.21 nmで、グラファイトの(1,1,0)面に帰属されます。ラマンスペクトルでは、1342 cm⁻¹付近のDモード（無秩序誘導モード）と1507 cm⁻¹付近のGモードが、それぞれ炭素のsp³とsp²混成化の結果として観察されました（図1E）。Dモード強度とGモード強度の比はサンプル内グラファイト微結晶サイズに依存し、無秩序度が高いほどID/IG比が高く、グラファイト微結晶が小さくなります。さらに、CQD粉末のDモードとGモードは、比較的高いID/IG比（0.77）を持つ小さなグラファイトフレークとしても見なせます。

FTIRとXPSは炭素ベース材料の化学組成と構造を特性評価する強力なツールです。CQDsのFTIRデータは400-4000 cm⁻¹範囲で記録されました（図1F）。FTIRスペクトルから、CQDsは主にアミン（3052、3324 cm⁻¹）、OH（3200 cm⁻¹）、C=O（1595 cm⁻¹）、C-N/C-O（1200 cm⁻¹）、C=C（1500 cm⁻¹）、CH（748 cm⁻¹）官能基または化学結合を含むことが明らかになりました。XPSで決定されたCQDsの表面成分はFTIR結果と整合しました。全スペクトル（図2A）は3つの典型的ピークを示しました：C 1s（285 eV）、N 1s（400 eV）、O 1s（531 eV）。

図2B-Dより、C 1s解析でsp²/sp³炭素（C-C/C=C、284.8 eV）、窒素含有炭素（C-O/C-N、285.9 eV）、カルボニル炭素（C=O、287.7 eV）の存在が明らかになりました。N 1sバンドは399.3、400.3、401.7 eVの3ピークに脱畳み込みされ、それぞれピロール型N、グラファイト型N、アミノ型Nに対応。O 1sバンドはC-O（531.6 eV）とC=O（533.1 eV）のピークを含みます。重要なことに、これら官能基の存在がCQDsに良好な溶解性を付与します。さらに、蛍光分光とUV-Vis吸収を用いてCQDsの光学特性を調査しました。CQDsの蛍光発光スペクトルを図1Cに示します。調製CQDsは励起波長依存性蛍光発光挙動を示し、400-500 nm励起で最大発光ピークが473から519 nmへ赤方シフトし、蛍光強度が急激に減少しました。図1Dに示すCQDsのUV-visスペクトルは、400-490 nm波長範囲に強い吸収ピークを特徴とし、280 nmと420 nmに2つの特徴的吸収ピークを示し、それぞれπ-π*（芳香族C=C）とn-π*（カルボキシルおよび/またはC-N）遷移に帰属されます。したがって、これらのCQDs光学特性は同時生物イメージングと光力学的不活化の実現可能性を提供します。

CQDsのバイオイメージングと細胞毒性

CQDsのバイオイメージングと細胞ラベリング能力を評価するため、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いてHeLa細胞でin vitro細胞イメージングを調査しました。HeLa細胞を200 μg mL⁻¹ CQDsで6時間インキュベート後、CLSM検出用に調製。その結果、HeLa細胞全体に明るい黄色蛍光が均一に分布して観察されました（図3A）。より重要なのは、200 μg mL⁻¹という低CQDs濃度でHeLa細胞を黄色蛍光でラベル可能であり、CQDsの細胞イメージングへの可能性をさらに特定しました。報告されているように、カーボンナノ粒子は常にブルーライト領域でのみ強い発光を示し、長波長発光は通常弱いです。UV励起下では生体組織が頻繁に青色自己蛍光を示し、光損傷を受けやすく、短波長発光を持つカーボンナノ粒子の生物イメージング分析応用を深刻に妨げています。したがって、長波長発光を持つカーボンナノ粒子の開発が広く関心を集めています。本研究では、調製CQDsが400-450 nm光励起下で明るい黄色蛍光を示しました。励起黄色蛍光により、CQDsが深部腫瘍検出に使用可能になる可能性があります。しかし、ヒトがんイメージングへの実用応用にはまだ長い道のりがあります。

発光特性に加え、CQDsを潜在的バイオラベリング試薬として開発するには高い生体適合性と低毒性が常に要求されます。生物医学応用では、材料は推奨用量で高い生体適合性を持つ必要があります。細胞毒性を調べるため、HeLa細胞を0-400 μg mL⁻¹の最終濃度範囲でCQDs処理し24時間培養。図3Bに示すように、MTT（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイで95%以上の細胞が生存し、CQDsが実質的に無毒であることが明らかになりました。

これらのデータは、励起黄色蛍光を持つ新規生成CQDsが低細胞毒性と高生体適合性を持ち、生物イメージングへの有望な展望を促進することを示唆しています。

光力学療法の有効性

がん細胞不活化

図3Cに示すように、CQDs単独または青色光単独で処理したHeLa細胞では生存率に差がありませんでした。CQDsと青色光の同時処理により、光曝露時間に依存してHeLa細胞生存率が顕著に低下。460 nm照射15分後、CQDsは顕著な抗腫瘍活性を示し、200 μg mL⁻¹濃度でHeLa細胞生存率が約40%低下。励起CQDsの効果をさらに検出するため、MTTアッセイを実施し、励起CQDsのHeLa細胞に対する半最大阻害濃度（IC50）を評価。結果として、青色光10分照射後の励起CQDsのIC50は約427.5 μg mL⁻¹（95% CI 366.7-498.7 μg mL⁻¹）、15分照射後は約255.1 μg mL⁻¹（95% CI 220.9-249.8 μg mL⁻¹）でした。

これらの結果は、励起CQDsがPhotofrinなどの一部臨床抗がん剤と同様に腫瘍細胞を効果的に殺傷できることを示し、CQDsのイメージングガイド抗腫瘍療法における有望な価値を示唆しています。

CQDsのROS生成

PDTでは、適切な照射条件下でエンドサイトーシスされた光感受性物質により生成される細胞毒性ROSによってがん細胞が殺傷されます。ROSはPDTにおいてアポトーシスやネクロシスにより標的細胞を不活化し、副作用が少ないです。図4A検査から、ROS試薬が赤色蛍光を発し、ROS生成を示唆。さらに、ROSの赤色信号はCQDs蛍光とよく重なり、ROS生成が腫瘍細胞によるCQDs取り込みと密接に関連していることを意味します。図4Bに示すように、対照とレーザー非照射群と比較して、460 nmレーザー15分照射下の実験群で明確なROS生成が観察されました。結果は、CQDsが460 nmレーザー照射下で細胞内ROS生成を有意に促進し、PDTへの応用に大きな可能性を持つことを示しています。原理的には、CQDsは基底状態（図4CのS0）から励起状態（図4CのSn）に励起され、このプロセス効率は光源強度と消光係数で決まります。溶媒緩和後、CQDsは第1一重項励起状態の最低振動準位に留まります。励起後の急速な振動緩和により、第1一重項励起状態（図4CのS1）から放出される光子エネルギーは励起光子エネルギーより低く、波長増加をもたらします。蛍光イメージングはCQDsのS0→Sn→S1遷移を利用します。CQDsはHeLa腫瘍細胞に取り込まれ、適切な波長光源で照明されると蛍光を発し、細胞をラベリング可能にします。S1は蛍光によるS0状態への復帰、または系間交差による非蛍光三重項励起状態（図4CのT1）への遷移が可能です。T1の蛍光基は電子移動反応で特に活性で、スーパーオキシドラジカルを生成し、その後蛍光基分解をもたらします。T1から分子酸素へのエネルギー移動は、基底状態分子酸素より強力な励起一重項酸素酸化剤を生成。スーパーオキシドラジカル、一重項酸素、その他OHやH₂O₂などのROSが近くの生物分子と反応し光毒性を発揮し、細胞死を導きます。CQDsがHeLa細胞に取り込まれた後、照明により一重項状態から系間交差を経て三重項状態へ移行し、エネルギー移動プロセスでROSを生成、最終的に細胞死を導きます。適切な波長源下で、CQDsは2種類のエネルギー移動を起こします。蛍光を放出してHeLa腫瘍細胞をマーキングし、HeLa細胞をROSで殺傷。実験データは暗所での新規作製CQDsの良好な生体適合性と光条件下での腫瘍殺傷効率を明らかにしました。したがって、CQDsは腫瘍細胞と組織の光感受性物質として使用可能です。

さらに、CQDsがいかに腫瘍を正確に標的とし、より効果的に腫瘍細胞を殺傷できるかは未解決問題です。表面官能親水性基（カルボキシル、カルボニル、エポキシ、ヒドロキシルなど）の既存の豊富さにより、カーボンドットは特定抗体と共役可能で、腫瘍を精密に標的化できますが、これには腫瘍特異的バイオマーカーが必要です。同時に、カーボンドットは高い表面積対体積比により薬物・遺伝子送達ツールとしても機能可能です。優れた生体適合性、腫瘍細胞による内在化に適した小サイズ、豊富な表面官能基、バイオイメージングポテンシャルを考慮すると、カーボンドット（CQDs含む）は腫瘍治療の有望なセラノスティクス候補になると信じられています。しかし、カーボンドットのナノメディシンとバイオイメージング応用には依然として課題と未解決問題が多数存在します。今後、カーボンドット関連ナノメディシンのベンチからベッドサイドへの翻訳を促進するため、更なる努力が必要です。

結論

要約すると、プラズマ法によりo-フェニレンジアミンを用いて光ルミネセンスCQDsを合成しました。青色レーザー励起で、直径約3.2 nmのCQDsが黄色蛍光を発光。ラマン、UV-vis、FTIR、XPS結果から、より多くの炭素原子がsp²混成に関与し、新しい有機基を形成することが示されました。プラズマ法で合成されたCQDsは細胞イメージング実験で効果的なプローブであることが証明され、CQDsから放出される黄色蛍光はHeLa細胞を明確にマーキングできます。さらに、合成CQDsは良好な溶解性、無毒性、高生体適合性を示し、バイオイメージング能力を加速させます。また、励起CQDsはROS生成によりHeLa細胞を効果的に殺傷でき、in vitroでのCQDsの満足できる光力学的細胞毒性を明確に示し、PDT応用を支持しています。

実験方法

カーボン量子ドットの合成

マイクロプラズマ処理システムは追加ファイル1：図S1にまとめられています。内径180 μmの中空ステンレスパイプを高圧直流電源（天津東文高圧電源有限公司、天津、中国）に接続し、溶液表面から2 mm上方に保持。Pt電極（DJS-1、上海INESA科学機器有限公司、上海、中国）を電源カソードに接続し溶液に浸漬。o-フェニレンジアミン（上海、中国）400 mgを脱イオン水40 mLに溶解し、20 mLをペトリ皿に入れ磁気攪拌機で攪拌。マイクロプラズマ処理中、アルゴン（Ar）ガスを60 sccmでパイプに流し、直流電流を17 mAに維持。10分間プラズマ処理後、褐色黒色生成物を透析膜（分子量カットオフ500 Da）で脱イオン水2 Lに対して12時間透析し、その後0.22 μm超濾過膜で濾過。最終的に凍結乾燥により純粋なCQDsを得ました。

CQDsの構造、組成、光学特性の評価

CQDsのサイズと形態はTEM（JEM-2100Fシステム、JEOL、東京、日本）で評価。蛍光分光はPerkin Elmer LS 55発光分光計（Waltham, MA, USA）で実施。UV/Vis吸収スペクトルはVarian Cary 50 UV-Vis分光光度計（Palo Alto, CA, USA）で測定。FTIRスペクトルはNicolet 6700分光計（Thermo Scientific、Waltham, MA, USA）で取得。ラマン分光は800 UVマイクロラマン分光計（Invia-reflex、UK）で実施。XPS実験はAxis Ultra DLDシステム（島津/クラトス分析株式会社、京都、日本）で実施。

細胞培養と細胞毒性アッセイ

HeLa細胞（ATCC、Manassas, VA, USA）を10% FBSと1% ペニシリン-ストレプトマイシン含有Dulbecco改変Eagle培地（DMEM）で、5% CO₂湿潤雰囲気下37°Cで培養。CQDs細胞毒性試験では、細胞をカウントし、完全培地200 μLを含む96ウェルプレートにウェルあたり6000細胞の密度で播種。24時間培養後、CQDsを0、25、50、100、200、400 μg mL⁻¹濃度でさらに24時間インキュベートし、MTTアッセイで細胞生存率を検出してCQDs細胞毒性を評価。簡潔に、これら溶液を100 μL MTT試験溶液（0.5 mg mL⁻¹）で置換し、暗所で4時間インキュベート。上清を除去し、結晶をジメチルスルホキシド（DMSO）で溶解。最終的に各ウェル吸光度を490 nmで測定。光学密度を、CQDsなし対照サンプルを100%生存と仮定して細胞生存率に関連付けました。

MTTアッセイは励起CQDsのHeLa細胞に対するIC50評価にも使用。簡潔に、96ウェルプレートのHeLa細胞をCQDs（0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800、1600、3200、6400 μg mL⁻¹）でインキュベーター内24時間培養、460 nm光で10分または15分別々に処理、さらに24時間培養。各ウェル細胞生存率をMTTアッセイで検出し、データをIC50評価に使用。

細胞イメージング

2×10⁴ mL⁻¹濃度の細胞を共焦点ディッシュ（直径15 mm）に播種、24時間培養、PBSで2回洗浄し死細胞がないことを確認。CQD溶液（200 μg mL⁻¹、pH 7）を添加し6時間インキュベート。その後、PBSで3回洗浄し未結合CQDsを除去、4%パラホルムアルデヒドで固定。その後、CLSM（LSM510、Zeiss、ドイツ）で400-450 nm励起波長範囲で観察。

光力学療法とROS測定

抗腫瘍効果を調査するため、HeLa細胞を200 μg mL⁻¹ CQDsで37°C暗所24時間インキュベートし、460 nm（30 mW cm⁻²）光で5、10、15分処理。24時間インキュベーション後、標準MTTアッセイで相対細胞生存率を決定。細胞内ROS生成はFluorometric Intracellular Ros Assay Kit（sigma、USA）を用いた分光光度法で化学的に検出。細胞を共焦点ディッシュ（直径15 mm）に一晩播種し細胞付着させ。その後、200 μg mL⁻¹ CQDsで4時間インキュベート。続いて、ウェルあたり100 μLマスターリアクションミックスを添加。1時間インキュベート後、4%パラホルムアルデヒドで10分固定、CLSMで細胞蛍光像を観察。ROS生成検出では、細胞を200 μL培地を含む96ウェルプレートで培養。24時間インキュベーション後、培地を0、100、200 μg mL⁻¹濃度の100 μL CQDs溶液で置換し、さらに4時間インキュベート。その後、PBSで3回洗浄、15分照射または非照射、ウェルあたり100 μLマスターリアクションミックスで1時間インキュベート。最終的に、蛍光リーダー（520 nm励起、605 nm発光）で蛍光強度を検出。

統計解析

本研究の実験は3回繰り返し、統計解析はSPSS19.0で実施。2群間差はMann-Whitney U検定で比較。励起CQDsのHeLa細胞に対するIC50は非線形回帰で評価。P＜0.05を統計的有意としました。

データと材料の入手可能性

本研究のすべてのデータと材料は、合理的な要請に基づき責任著者から入手可能です。

略語

PDT:

光力学療法

ROS:

反応性酸素種

CQDs:

カーボン量子ドット

TEM:

透過型電子顕微鏡

CLSM:

共焦点レーザー走査顕微鏡

DMEM:

Dulbecco改変Eagle培地

MTT:

3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド

DMSO:

ジメチルスルホキシド

IC50:

半最大阻害濃度