ESAT-6抗原-抗体複合体による結核の高感度比色検出における赤色スペクトルシフト：金ナノ粒子による新しい戦略

背景

結核（TB）は、結核菌によって引き起こされます。 、人間の主要な死を引き起こす病気の1つであり、最初は肺を攻撃します。結果として、それは腎臓、脊椎、脳などの体の他の部分に広がり、免疫力が低下するとより重症になります。予防措置を講じて人々を救うためには、潜在的な段階で結核を特定して治療することが義務付けられています。この段階では、患者は Mに感染しています。結核;ただし、病原体はアクティブではありません。潜在段階で結核を検出するために使用されてきたさまざまな方法があります。これには、結核皮膚検査やインターフェロンガンマ試験が含まれます。ほとんどの場合、結核の皮膚検査だけでは活動性の結核感染を検出することはできず、胸部X線、喀痰細胞診、喀痰培養などの他の補助検査によって患者を確認する必要があります[1]。しかし、これらのテストはより難しい実験手順を必要とし、完了するのに数ヶ月かかります。したがって、結核を早期に発見するためのより簡単で効率的な方法を開発することが必須です。

金ナノ粒子（GNP）ベースの比色分析は、可視波長でのより高い吸光係数や変更可能な表面プラズモン共鳴など、その独特の物理的および化学的特性により、バイオセンサーの分野で大きな注目を集めています。単分散GNP溶液は、高い吸光係数を示し、可視領域のスペクトルを示します。 GNPの間に適切なスペースがある場合、GNPは赤色の溶液のように見え、2価イオンの利用可能な条件下で凝集すると青色に変わります[2]。適切なイオンの存在下で、GNP間のスペースが埋められ、凝集の段階に到達し、「赤方偏移」と呼ばれる可視波長へのスペクトルシフトを表示します。このスペクトルシフトを利用することにより、HIVやインフルエンザなどの病気を検出するための多くの比色分析が生成されています[3、4]。これらの種類のアッセイは一本鎖オリゴヌクレオチド配列に依存しており、アプタマーは標的を検出するための適切な分子として広く使用されています[5、6]。一本鎖DNAまたはRNA配列は、DNA塩基の金原子と窒素原子の間の配位を介してGNPの表面に結合できます[7、8、9]。オリゴヌクレオチドで修飾されたGNPは、より高い塩の条件下で安定しています。分析物が利用可能になると、オリゴヌクレオチドは金から分離され、二価イオンの存在下で凝集し、青色の溶液を表示します。実証されたGNPアッセイは、より安価で、検出にかかる時間が短く、機能化が容易であり、優れた感度で視覚的な検出を示しています[10、11、12、13、14]。これらの前向きな姿勢により、GNPベースの比色分析は、DNA、RNA、タンパク質、全細胞、および金属イオンを含むより小さな分子の検出に拡張されました。簡略化されたアプタマーGNPベースの比色分析を使用してこれらの分析物を検出するためにいくつかのアプタマーが利用可能であり、赤色のスペクトルシフトを示しています[15、16、17、18、19]。

比色分析はアプタマー、DNA、またはRNAで十分に文書化されていますが、シーケンスが長くなるとパフォーマンスが低下し、プローブとターゲットのインタラクティブ分析が失敗するため、場合によっては悪影響もあります[20、21、22]。これらは、GNP表面と静電的に強い相互作用を引き起こし、最終的にターゲット分子がGNP表面に付着したプローブ分子を放出できなくなる生体分子の電荷が高いためである可能性があります。このハードルを克服するために、ここでは、ESAT-6タンパク質を検出するためのシングルステップ抗体ベースの比色分析を導入しました。 ESAT-6タンパク質は初期の分泌タンパク質であり、結核の重要な抗原として同定されています[23、24、25]。 ESAT-6タンパク質を早期に診断するためには、病気を治療し、蔓延を避けることが必須です。図1a、bは、GNPベースの比色赤色スペクトルシフトアッセイを使用して、抗体によってESAT-6を検出するように設計された戦略を示しています。この検出方法に含まれるステップは次のとおりです。（i）抗ESAT-6ポリクローナル抗体をESAT-6 / CFP-10抗原と事前に混合し、（ii）GNPをこの溶液に添加し、（iii）NaClを添加しました。追加され、（iv）UV分光法による視覚的検出および赤色スペクトルシフト分析が実施された。これらのステップで、GNPと複合タンパク質間の電荷ベースの相互作用を解明するための重要な分析を実行し、比色分析のための抗体-抗原のプレミキシングの適合性を結論付けました。対照実験では、ESAT-6の代わりに培養ろ液タンパク質-10（CFB-10）を使用しました（図1）。

シングルステップのプレコンプレックス抗体ベースの比色分析によるESAT-6検出の概略図。 a 抗ESAT-6抗体のプレコンプレックスESAT-6の戦略。 b 抗ESAT-6抗体プレコンプレックスCFP-10の戦略（コントロール実験）

メソッド

試薬と生体分子

初期分泌型抗原標的（ESAT-6）および10 kDa培養ろ液タンパク質（CFP-10）は、Sino Biological Inc.（北京、中国）から調達しました。 Anti-ESAT-6は、Santa Cruz Biotechnology（USA）から購入しました。直径15nmの金ナノ粒子は、Sigma Aldrich（USA）から入手しました。実験全体で、RO脱イオンシステム（18.3MΩ・cm SASTEC（M）Sdn。Bhd）によって生成された脱イオン水を利用しました。

GNPを集約するための二価イオンの最適化

現在の研究でESAT-6を検出するために、二価イオン（NaCl）を使用してGNPの凝集を視覚化しました。 NaClで適切な条件を最適化するために、さまざまな濃度（最終濃度は50〜800 mM）をGNPの一定容量（20μl）に追加しました[1光学密度（O.D.）]。 15分後、SONYデジタルカメラを使用して色の変化を撮影しました。これらの変化に伴うスペクトルシフトは、ナノフォトメーターによって監視されました。

GNP表面のESAT-6生物付着：特異性の検証

GNP表面でのESAT-6の非特異的（生物付着）結合を検証するために、20μlのGNPにさまざまな濃度（最終濃度は1.5〜100 nM）を追加しました。 30分後、最適な濃度のNaClを各チューブに追加し、上記の実験のように色の変化とスペクトルのシフトを観察しました。同様に、生物付着もCFP-10でテストされました。

GNP表面での必須の抗ESAT-6抗体濃度の最適化

現在の実験を評価するために必要な抗ESAT-6抗体の濃度を最適化するために、さまざまな濃度の抗ESAT-6抗体（最終濃度は30〜500 nM）を20μlのGNPと個別に混合しました。 30分間のインキュベーション後、最適な量のNaClを各チューブに追加し、写真を撮り、15分後にスペクトルの変化を記録しました。

ESAT-6抗体ベースの比色赤スペクトルシフトによる検出

抗体ベースの比色赤方偏移スペクトル変化によるESAT-6の比色検出を開発するために、1μlの1μMESAT-6（最終容量は500 nM）を最初に1μlの最適な抗ESAT-6抗体濃度と混合しました。 。 30分間のインキュベーション後、20μlのGNPを各チューブに加え、30分間待ちました。次に、最適なNaCl濃度を追加し、400〜800nmの波長でスペクトル変化を測定しました。同様に、他の濃度のESAT-6（0〜500 nM）は、同じ最適化された抗ESAT-6抗体濃度で滴定されました。検出限界を確認するために、ESAT-6は、最低のピコモル（1.25 pMから）からナノモル（500 nM）のオーダーまでテストされました。他の分子（抗ESAT-6抗体、GNP、NaCl）の濃度は一定に保たれました。

結果と考察

ここでは、赤方偏移としてのスペクトル変化を示す抗体ベースの比色分析を行って、ESAT-6を検出しました。図1aは、シングルステップ抗体ベースの比色分析の概略図を示しています。 ESAT-6の存在下では、GNP溶液の色の変化は、高濃度の二価イオンであるNaClの下でGNPの安定性を失うと、赤色のスペクトルシフトを伴う青色であると予想されますが、ESAT-6の非存在下では、 GNPは、抗ESAT-6抗体がGNP表面に付着しているため安定しており、高濃度のNaClでも元の赤色を維持します。この戦略は、抗ESAT-6抗体に対する非特異的CFP-10を使用することで確認され、赤色のGNP溶液を表示するはずです（図1b）。 CFB-10は結核を引き起こす主要なタンパク質でもあるため、ここでは対照タンパク質として使用しました[26]。一般に、この種のGNPベースのアッセイでは、13〜15 nmサイズのGNPがより高い感度に到達するのに適しています[27]。GNPサイズを大きくすると、適切な検出限界を達成するのに適していません。これは、GNPのサイズが大きくなると、GNP表面に結合するためにより多くの抗体が必要になるためです。より多くの抗体が表面に結合すると、偽陰性の結果につながります。ここでは、15 nmのGNPを使用することを望み、ピコモル以下のレベルで最大の感度を達成しました。

制御されたGNP集約のための二価イオン最適化

この検出の最適化では、GNPの凝集にNaClを使用しました。図2に示すように、必要なNaCl濃度をスクリーニングすると、さまざまな濃度のNaClがGNPに追加され、溶液の色が青色になり始め、100mMのNaClとの凝集を示しました。また、スペクトルから、凝集したGNP（100〜800 mMのNaCl濃度）でのみ、波長〜600 nmで赤方偏移が発生するのに対し、分散したGNP（0〜50のNaCl濃度）であることが明確にわかりました。 mM）は、スペクトルを約500nmに維持します。ただし、50mMのNaClではわずかなピークスペクトル変化があります。これらの結果から、GNPの凝集には少なくとも100 mMのNaClが必要であると結論付けられましたが、感度を高めるために、さらなる実験に高濃度（800 mM）のNaClを使用しました。以前は、GNPの凝集について同様の範囲のNaClがGopinath etalによって示されていました。 [10]。

二価イオンの最適化。 0〜800 mMのNaClを一定のGNP（1 O.D.）と混合しました。 15分後、400〜800nmの波長でスキャンします。写真は、図の挿入図のようにデジタルカメラで撮影されました。スペクトルと色の変化は、GNPと100 mMNaClの凝集によって示されます。ピークはそれぞれの色付きの球で示されました

GNPの分散のためのESAT-6抗体の最適化

次に、NaClを最適化した後、実験を行うための抗ESAT-6抗体の適切な濃度を決定しました。感度は抗体濃度に大きく依存するため、GNP分散を誘導するには適切な濃度の抗ESAT-6抗体が必要です。背後にある概念は、最小の抗体濃度が必要な場合、ターゲットの追加時に簡単に複合化でき、GNPに結合する遊離分子がないのに対し、複数の抗体が利用可能な場合、低濃度のESAT-6では、少量の抗体のみが複合体を形成します。次に、残りの抗体がGNP表面に結合し、GNPの安定性を誘導します。これにより、感度が低下します。抗体のIgGは高分子量（〜150 kDa）であるため、静電相互作用またはGNP表面の表面末端アニオン基間のイオン/水素結合によって遊離抗体がGNP表面に容易に結合します[28]。分子量が大きいため、抗体の数は少なくなります。ここでは、低濃度でも分子量が多い6kDaの分子量ESAT-6とバランスが取れています。図3aに示すように、最初に最低濃度の抗ESAT-6抗体（30 nM）から追加し、最大濃度（500 nM）までGNPに追加しました。 GNPを含む30nMの抗ESAT-6抗体は、GNP表面に十分な抗体がないため、800 mMのNaClでも凝集の移行期にあることが示されましたが、60nMの抗ESAT-6抗体からは十分な数の抗ESAT-6抗体がGNP表面に結合しているため、溶液は赤色を保っています。最大濃度（500 nM）がテストされるまで、GNPの色は安定性の高い赤色に保たれていました。適切な濃度を60nMの抗体に決定した後、抗ESAT-6抗体とGNPコンジュゲートの安定性を確認するために、NaCl濃度を上げようとしました。図3bに示すように、調製した抗体GNPコンジュゲート（60 nM抗体とGNP）は、1 MNaClを添加しても非常に安定しています。図3cのスペクトルも、視覚的検出と同じ結果を示しています。調製された抗ESAT-6抗体GNPコンジュゲートは、高濃度のNaClでも〜520でピークを保持し、同時に、GNPのみが800 mM NaClで凝集し、ピークは〜500nmで最大になります。

ESAT-6抗体の最適化と安定性。 800 mM NaClを使用して、さまざまな濃度の抗ESAT-6抗体をテストしました。 a 抗ESAT-6抗体（0〜500 nM）によるGNPの凝集または分散。矢印は、最適な抗体濃度の遷移領域を示しています。 b さまざまなNaCl濃度（0.012〜1000 mM）の抗体複合GNPの60nMの安定性。 c さまざまな複合体のスペクトル。ピークはそれぞれの色付きの球で示されました

比色赤色スペクトルシフトによる事前に複合化された抗体を使用したESAT-6の検出と、ESAT-6の生物付着の検証

60 nMの抗体は優れた安定性を示すため、最初に、60nMの抗ESAT-6抗体と複合体を形成したESAT-6の検出を試みました。 ESAT-6は、6 kDaのサイズの低分子量タンパク質であり、比色分析に基づくアッセイに適しています。検出実験を行う前に、GNP表面でのESAT-6の生物付着をチェックしました。 ESAT-6がGNPと結合する可能性があるため、誤検知または誤検知につながる可能性があります。図4に示すように、100 nMまでの濃度のESAT-6では、GNPは800 mMのNaClで安定していませんでした。これは、ESAT-6がGNP表面に静電的に結合しないことを示しています。この非汚染は、ESAT-6のアミノ酸組成がこのアッセイで重要な役割を果たしていることも示唆しています。この確認後、60nMの抗ESAT-6抗体と事前に複合体を形成したESAT-6を検出しました。さまざまな濃度のESAT-6を一定濃度（60 nM）の抗体と複合体化させてから、GNPに添加しました。最後に、800 mMのNaClを追加して、赤色のスペクトルシフトを伴う凝集を評価しました。図5a（挿入図）に示すように、0.5nMから500nMへのESAT-6の検出により、コントロール（60 nM抗体のみ）と比較して、遷移に伴う明確な色の変化が確認されました。溶液の色は、0.5 nMでも赤から青に変化し、15 nMでさらに濃くなりました。これは、ESAT-6で完全に飽和したことが原因である可能性があります。 0.5 nMでも、GNPと結合する抗体は残っていないようです。図5aのグラフ表示を参照すると、15〜500nMのESAT-6は完全に飽和していることを示しています。図5bから、対照実験（ESAT-6タンパク質なし）のスペクトルが約500 nmで良好なプロファイルを示すのに対し、0.5および500 nMのESAT-6では、スペクトルが赤方偏移していることが明確に証明されています。これらの結果から、0.5 nMからESAT-6タンパク質を検出でき、明らかな青色の外観により、さらに低濃度にまで低下できると結論付けられました。

GNP表面のESAT-6ファウリングをテストします。さまざまな濃度のESAT-6をGNPと混合し、30分後に800mMのNaClを添加しました。概略図も示されています。青色の外観は集合体を示しています

高濃度でのESAT-6検出。 a ESAT-6を検出するためのグラフィック表現。さまざまな濃度のESAT-6を60nMの抗体と混合し、30分間のインキュベーション後にGNPを添加しました。次に、800 mMのNaClを添加して、色の変化を誘発しました。 0.5 nMのESAT-6が検出され、色がはっきりと変化しました（赤から青）。写真は、図の挿入図のようにデジタルカメラで撮影されました。 b 400〜800nmの波長でスペクトルが変化します。ピークはそれぞれの色付きの球で示されました

測色赤スペクトルシフトによるESAT-6の検出限界

60 nMの抗ESAT-6抗体は、ESAT-6の検出に明らかな改善を示したため、検出限界を見つけるために、ESAT-6を使用して、最も低いピコモル（1.25pMから5000pM）まで微調整しました。 ）。図6aに示すように、ESAT-6の1.25 pMから、ESAT-6と抗体の間の複合体形成により、青色が始まります。 2.5 pMから、青色に変化した溶液の色が濃くなり、さらに濃度を上げると色の変化が維持されます。対照実験（ESAT-6なし）では、溶液の色が赤く見え、現在の実験の特異性を裏付けています（図6a）。この結果は、図6bに示すスペクトルによっても確認されました。コントロールソリューションでは、スペクトルに変化はありませんが、ESAT-6タンパク質の1.25から5 nMまで、スペクトルは600nmに向かって赤方偏移しました。 5 nMのESAT-6では、ピークの最大値で完全なスペクトルシフトが観察されました。これらの実験結果に基づいて、ESAT-6の検出限界は、抗体ESAT-6複製前複合体を使用した場合の最低ピコモル（1.25 pM）付近であると結論付けることができます。

抗体ベースの比色分析によるESAT-6の検出限界。 a ESAT-6を検出するためのグラフィック表現。さまざまな濃度のESAT-6を60nMの抗体と混合し、30分間のインキュベーション後にGNPを添加しました。次に、800 mMのNaClを添加して、色の変化を誘発しました。 ESAT-6タンパク質は1.25pMから5000pMまで滴定されました。写真は、図の挿入図のようにデジタルカメラで撮影されました。 b 400〜800nmの波長でスペクトルが変化します。ピークはそれぞれの色付きの球で示されました

特異性を備えた微調整

60 nMの抗ESAT-6抗体でESAT-6を検出できたので、次に、75nMと少し高濃度の抗ESAT-6抗体で同じ検出を試みました。得られた結果を図7aに示します。 850 pMESAT-6で75nMのプレコンプレックス抗体を使用すると、わずかな色の変化が発生することがわかっています。 ESAT-6の濃度を100nMに上げると、青色への色の変化の進行を観察できました。これらの実験では、75nMのプレコンプレックス抗体を使用した場合の検出限界はナノモル範囲であることがわかりました。最後に、ESAT-6結合の特異性を確認するために、 Mの抗ESAT-6およびCFP-10タンパク質の複製前複合体を使用して同様のアッセイをテストしました。結核 。結果は、ESAT-6のみが特異性を持ち、CFP-10が適切なコントロールになり得ることを明確に示しています（図7b）。全体として、上記の結果から、比色分析の感度を向上させるには、抗体濃度の最適化が必須であることがわかりました。

75nMの抗ESAT-6抗体によるESAT-6の検出。 a 色の変化の表現。さまざまな濃度のESAT-6を75nMの抗体と混合し、30分間のインキュベーション後にGNPを添加しました。次に、800 mMのNaClを添加して、色の変化を誘発しました。 0.85 nMのESAT-6が検出され、色がはっきりと変化しました（赤から青）。写真はデジタルカメラで撮影しました。 b 400〜800nmの波長でスペクトルが変化します。ピークは、それぞれの色付きの球で示されました。特異性アッセイはCFP-10を使用して実施され、ネガティブコントロールであることが示されました

結論

結核（TB）は、人間にとって生命を脅かす主要な病気であり、結核を早期に特定することで、結核の蔓延を防ぎ、治療することが示されています。この研究では、結核の主要なタンパク質の1つである初期分泌抗原標的（ESAT-6）を選択します。金ナノ粒子を使用したシングルステップの抗体ベースの比色赤色スペクトルシフトアッセイを導入したところ、検出限界は1.25pMであることがわかりました。このアッセイの特異性は、コントロールタンパク質（CFP-10）を使用して解明されたものであり、GNPを添加しても色の変化は見られません。一方、ESAT-6だけではGNPに拘束されません。この証拠により、事前に複合化されたESAT-6および抗ESAT-6抗体の存在が、比色赤色スペクトルシフトアッセイの信頼性で実証されました。この戦略は、単一のステップとして同様の種類の分析物を検出するためのシンプルで迅速です。さらに、このアッセイは、ポイントオブケア検出に適した適切な抗体と複合体を形成した小分子で拡張することができます。この方法論は、より小さなサイズのタンパク質やペプチドで確実に機能します。より大きなサイズのタンパク質では、アミノ酸の電荷に応じて、変動がある可能性があります。

略語

CFP-10：

10kDa培養ろ液タンパク質

DNA：

デオキシリボース核酸

ESAT-6：

6kDaの初期分泌抗原標的

GNP：

金ナノ粒子

NaCl：

塩化ナトリウム

O.D：

1つの光学密度

RNA：

リボース核酸

TB：

結核

UV：

紫外線