金ナノ粒子と薬物の相互作用がマウスに急性腎障害を引き起こす：サイズ依存性毒性の研究

概要

ナノ材料は多くの有用な特性を持つ革新的な材料ですが、生体への未知の影響が懸念されています。金ナノ粒子は優れた特性により工業材料として広く使用されていますが、その潜在的な生物学的危険性は不明です。本研究では、直径10、50、100 nmの金ナノ粒子（GnP10、GnP50、GnP100）およびそれらの薬物との相互作用をマウスで検討し、哺乳類における安全性を明らかにしました。シスプラチン、パラクアット、5-アミノサリチル酸はマウスの肝臓と腎臓に副作用を引き起こします。いずれの金ナノ粒子も単独で尾静脈投与した場合、肝毒性や腎毒性は観察されませんでした。一方、GnP10をシスプラチン、パラクアット、または5-アミノサリチル酸と併用投与すると、腎臓に副作用が生じました。これは、粒子径10 nmの金ナノ粒子が薬物との相互作用により腎毒性を持つ可能性を示唆しています。

はじめに

ナノテクノロジーは21世紀においてますます重要な役割を果たしており、ナノ材料がその進歩を支えています。ナノ粒子の製造技術の最近の発展により、革新的なナノ材料が世界中で利用されるようになりました[1, 2]。ナノ材料は直径100 nm以下で、金、銀、シリカ、白金、二酸化チタンナノ粒子、フラーレン、カーボンナノチューブなどが含まれます[3, 4]。これらの材料は電子記憶技術、遺伝子・再生医療、電子デバイスなどに応用され、21世紀の新産業の基盤となっています[5]。しかし、PM2.5のようなナノ粒子は深刻な環境汚染、喘息などの呼吸器疾患、虚血性心疾患を引き起こします[6]。さらに、自動車から排出されるディーゼル粒子は脳や生殖器官に入り込み生物学的影響を及ぼす[7]、石綿のような繊維状微粒子は中皮腫を誘発し、カーボンナノチューブなどの工業用繊維状ナノ材料も人体に悪影響を及ぼす可能性があります[8, 9]。したがって、ナノ粒子の生物学的影響については多くの未知の点が残されています。

金（Au）はイオン化傾向が低く安定性が高いため、古代から装飾用貴金属として使用されてきました。最近開発された金ナノ粒子は、特徴的な光学的特性[10, 11]と優れた光電子特性[12, 13]により、医療・工学用途、有機太陽電池、センサープローブ、導電材料として広く使用されています。また、アクリル樹脂合成の触媒として化学工業で用いられ、白金ナノ粒子よりも優れた低温触媒活性でCOを酸化するため、排ガス浄化触媒としても利用されています。今後さらなる応用が期待されますが、金ナノ粒子の毒性や薬物との相互作用に関する研究はほとんどありません。

ナノテクノロジー分野は、ナノ粒子の安全性、薬理学、薬物動態の研究により拡大しています。シリカナノ粒子は細胞毒性、肝毒性、胎盤障害を引き起こす[14, 15]、カーボンナノチューブは肺中皮腫を誘発する[16]ことが報告されています。しかし、ナノ粒子と薬物の相互作用による薬理学的効果についてはほとんど知られていません。本研究では、直径10、50、100 nmの金粒子（GnP10、GnP50、GnP100）のマウスにおける毒性を調べ、哺乳類での安全性を明らかにしました。また、パラクアット（PQ、よく知られた肝・腎毒素）[17]、シスプラチン（CDDP、広く使用される抗腫瘍薬）[18, 19]、5-アミノサリチル酸（5-ASA、一般的な抗炎症薬）[20]の毒性に対するこれらのナノ粒子の影響を検討しました。

結果と考察

まず、ゼータサイザーで金ナノ粒子の粒子径を測定し、透過型電子顕微鏡で観察しました（図1a, b, c）。GnP10、GnP50、GnP100ナノ粒子の平均径はそれぞれ15.7 ± 7.0、53.3 ± 14.2、97.0 ± 27.1 nmでした（補足図1）。また、電子顕微鏡観察では金ナノ粒子が凝集していましたが、マウス投与時には凝集しませんでした。ICP-MSで金イオン濃度を測定しましたが、イオンは検出されませんでした（データ未掲載）。金ナノ粒子の表面はクエン酸で修飾され水への親和性を高めていましたが、他の機能性は示しませんでした。

最大用量4 mg/kgを尾静脈からマウスに投与し、肝毒性と腎毒性を検討しました。金ナノ粒子単独投与では肝毒性も腎毒性も観察されませんでした（図2）。GnP10、50、100単独投与群のALT、AST値（図2a, b）、BUN、Cr値は対照群と同等でした。金ナノ粒子の単回投与は肝臓、腎臓、心臓、肺、脾臓の障害を誘発せず（補足図2）、マウスに単独投与した場合は無毒性であることが示されました。

シリカナノ粒子、ナノクレイ、ポリスチレンナノ粒子を薬物や化学物質と併用投与すると肝障害と腎障害が誘発されることが報告されています[14, 21, 22]。そこで、金ナノ粒子を肝・腎毒素であるPQや、有害な肝・腎毒性作用を持つCDDP、5-ASAと併用投与しました。図2は金ナノ粒子とCDDPの相互作用結果です。GnP10またはGnP50とCDDPの併用でALTが上昇し肝障害が生じ（図2a）、GnP10とCDDPの併用でBUNとCrが上昇し腎障害が生じました（図2c, d）。次に、広く使用される抗炎症薬で肝・腎障害を起こす5-ASAとの相互作用を調べました。GnP10またはGnP50とCDDPの併用でALTが上昇し肝障害が生じ（図3a）、5-ASAとの併用ではBUNとCrが上昇し腎障害が生じました（図3c, d）。さらに、広く使用される農薬で肝・腎障害を起こすPQとの相互作用を調べました。GnP10とPQの併用でBUNとCrが上昇し腎障害が生じました（図4c, d）が、肝障害は生じませんでした（図4a, b）。本研究でテストされた最小粒子であるGnP10をCDDP、5-ASA、PQと併用すると、最も高いALT、BUN、Cr値を示しました。10倍大きいGnP100粒子は、これらの薬物と併用しても肝障害や腎障害を引き起こしませんでした。これらの結果は、直径100 nm未満のGnPをCDDP、5-ASA、PQと併用投与すると毒性を示すことを示しています。

GnP10をCDDP、5-ASA、PQと併用投与後の腎組織をヘマトキシリン・エオシン染色で観察すると（図5）、尿細管障害が認められ、急性腎障害の誘発が示唆されました。次に、血清中のIL-6とTNF-αを測定し、GnP10誘発性急性腎障害の原因を探りました。図6は、GnP10をCDDP、5-ASA、PQと併用投与後3時間での血清IL-6レベルを示します。GnP10単独群ではIL-6は検出されませんでしたが、CDDP、5-ASA、PQとの併用でIL-6上昇が観察されました。TNF-αはどの群でも検出されませんでした（データ未掲載）。これらの結果は、IL-6がGnP10とCDDP、5-ASA、PQによる急性腎障害に関与することを示唆しています。

金ナノ粒子と薬物の併用投与が副作用（肝・腎障害）に及ぼす影響を調べました。最小粒子径のGnP10は、CDDP、5-ASA、PQと併用すると腎障害と肝障害を誘発しました。また、GnP10をアセトアミノフェン、ストレプトマイシン、テトラサイクリンと併用投与しても肝・腎障害は観察されませんでした（データ未掲載）。以前、シリカナノ粒子が粒子径依存的に肝障害を誘発すること[23]、ポリスチレンナノ粒子が薬物と併用時に粒子径依存的に肝障害を誘発する可能性があること[24]を報告しています。Xiaらは、より小さな金ナノ粒子ほどin vitroで遺伝毒性が高いことを報告しています[25]。これらを総合すると、金ナノ粒子は粒子径が小さくなるほど薬物との相互作用により高毒性になることがわかります。

GnP10をシスプラチン、5-ASA、PQと併用投与するとIL-6レベルが上昇しました（図6）。GnP10単独投与（図6）やCDDP、PQ、5-ASA単独投与（データ未掲載）ではIL-6上昇は見られませんでした。IL-6は肝障害[26]や急性腎障害[27, 28]の誘発に関与することが報告されています。GnP10がIL-6を誘導し、それが肝・腎障害を引き起こすと考えられますが、詳細なメカニズムは不明です。Bauzaらは、IL-6が肝細胞の転写因子を誘導し肝障害を引き起こすことを報告しています[29]。IL-6誘導性肝・腎障害における細胞特異的転写因子の関与を理解するには、金ナノ粒子の細胞毒性メカニズムに関するさらなる実験が必要です。

最近、金ナノ粒子は薬物送達システム(DDS)用機能性生体材料として注目され、がん治療への応用研究が活発です。例えば、AnselmoらはPEG修飾シリカ-金ナノ粒子が光を吸収して局所温度を上昇させ、固形腫瘍を熱的に溶解することを報告しています[31]。これは金ナノ粒子ががん治療に有望な材料であることを示しています。しかし、抗がん剤シスプラチンと金ナノ粒子の相互作用が腎障害を誘発することが判明しました（図2）。したがって、金ナノ粒子をがん治療に用いる際は、薬物との併用時の安全性を検討する必要があります。

結論

まとめると、GnP10はCDDP、PQ、5-ASAとの併用で腎障害を引き起こしました。GnP50は5-ASAとの併用でのみ腎障害を引き起こし、GnP100は腎障害を引き起こしませんでした。金ナノ粒子が腎障害を引き起こし、この効果が化学物質や薬物との相互作用により相乗的に増強されることを実証しました。診断や治療用に提案されるナノ粒子の毒性プロファイルを完全に解明するには、これらのデータに基づくさらなる研究が必要です。

材料と方法

材料

クエン酸配位子でキャップされた直径10、50、100 nmの金粒子懸濁液をNANOCOMPOSIX, INC.（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手しました。粒子径分布はゼータサイザー（シスメックス株式会社、神戸）とTEM JEOL JEM-1011透過型電子顕微鏡で解析しました。平均径はそれぞれ15.7 ± 7.0、53.3 ± 14.2、87.0 ± 27.1 nmでした（図1、補足図1）。水性懸濁液（1 mg/mL）を超音波処理で十分に分散させ、水で希釈して使用しました。ICP-MSで金ナノ粒子懸濁液中のイオン化金の有無を調べましたが、イオン化金は検出されませんでした。各実験で同量の懸濁液をマウスに投与しました。粒子の幾何学的サイズはTEMで評価しました。パラクアット（シグマアルドリッチ、米国ミズーリ州セントルイス）、シスプラチン、5-アミノサリチル酸（和光純薬工業、大阪）を生理食塩水に溶解し、-20℃で保存しました。すべての試薬は研究用グレードです。

動物

8週齢のBALB/c系雄マウスを船橋ファーム株式会社（千葉県）から購入しました。動物は管理された環境（温度23 ± 1.5℃、明暗12時間サイクル）で、標準飼料と水を自由摂取させました。実験開始前に1週間の順化期間を設けました。実験プロトコルは、帝京平成大学大学院薬学研究科の倫理指針（日本実験動物学会の動物実験ガイドラインに基づく）に準拠しています。

生化学的分析

血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、血中尿素窒素（BUN）、クレアチニン（Cr）を市販キット（和光純薬工業）を用いて製造元のプロトコルに従って測定しました。簡単に説明すると、採取した血清（10 mL）に色素A試薬（ウレアーゼ含有）1 mLを加え、37℃で15分間インキュベートしました。さらに色素B試薬1 mLを加え、37℃で10分間インキュベートしました。吸光度を570 nmで測定しました。インターロイキン(IL)-6とTNF-αは酵素免疫測定法(ELISA)キット（BioSource International、米国カリフォルニア州）で測定しました。すべての分析は製造元の指示に厳密に従って実施しました。

組織学的分析

投与後24時間で動物を安楽死させ、肝臓を摘出し、4%パラホルムアルデヒドで固定しました。処理・切片化後、薄い組織切片をヘマトキシリン・エオシンで染色し、組織学的に観察しました。

統計解析

統計解析はStatcelアドインフォーム、第3版Excelソフトウェア（EMS出版株式会社、埼玉県）を用いて行いました。すべてのデータは平均 ± 標準誤差(SEM)で示しています。対照群と実験群の有意差はDunnett検定で判定し、P < 0.05を有意としました。