フレキシブルグラフェンバイオセンサーによる卵巣がん細胞の迅速・高感度検出

要旨

卵巣がんの早期発見は、非特異的症状と信頼できるスクリーニングツールの不在により、依然として重要な課題です。本研究では、ポリエチレンテレフタレート（PET）上に製造されたコスト効率に優れたフレキシブルグラフェンバイオセンサーを提示し、循環腫瘍細胞（CTC）を高感度かつ高速で検出します。本センサーは細胞培地と卵巣がん細胞懸濁液を区別し、異なる細胞タイプに対して明確に応答し、数十個/mLという検出限界を維持します。驚くべきことに、5秒以内に測定可能な電気的応答を示し、迅速なポイントオブケア診断のための有望なプラットフォームとなります。

グラフィカルアブストラクト

序論

卵巣がんは第2位の婦人科悪性腫瘍であり、婦人科がん死亡原因の第1位です。現在のスクリーニング戦略——画像診断とCA125抗原検査の組み合わせ——は、生存率が急激に低下する早期病変では感度が限定的です。早期腫瘍はCTCを血流に放出し、十分な感度で検出できれば非侵襲的バイオマーカーとして患者アウトカムを変革し得ます。免疫磁性法やマイクロフルイディック手法がいくつか開発されていますが、臨床採用に必要な高特異性と迅速なターンアラウンドを両立するものはまだありません。

グラフェンは、sp²結合炭素の二次元格子であり、優れた電気伝導度と大きな表面積によりバイオセンシングの汎用プラットフォームとして台頭しています。従来のグラフェンベースデバイスはCEAやPSAなどのタンパク質バイオマーカー定量に成功していますが、卵巣がんCTC向けのフレキシブル・低コストグラフェンバイオセンサーは未開拓でした。本研究では、機械的柔軟性、迅速応答、高感度を兼ね備えたハンドメイドグラフェン/PETセンサーを導入し、これらのギャップを埋めます。

材料と方法

グラフェンフィルムの成長と転写

単層グラフェンを化学気相成長法（CVD）で銅箔上に合成。銅箔を5分間塩酸洗浄、脱イオン水洗浄、窒素乾燥後、CVDチャンバーで水素雰囲気（50 sccm）下1000℃まで昇温し20分保持、その後メタン（50 sccm）を導入しさらに20分でグラフェン層を成長。冷却後、グラフェン/銅基板を切断、PMMAコート、1M FeCl₃で銅をエッチング。PMMA/グラフェンスタックを洗浄、PET上に転写、アセトンでPMMA除去しグラフェン/PETフィルムを得ました。

グラフェンベースバイオセンサーの作製

グラフェンフィルムを1cm×2cmに切断しPET上に転写。中央に2つの銀ペースト電極を配置。電極周囲に数mm長・幅、高さ約1mmのシリコンゲルウェルを形成し、細胞プールを作製。完成センサーをアジレント4155B半導体パラメータアナライザーで検証。

SKOV3卵巣がん細胞の培養

SKOV3細胞（西中国第二附属病院公立研究室由来）をRPMI-1640培地（10%子牛血清補充）、37℃、5% CO₂で培養。

細胞溶液調製と電気測定

細胞懸濁液を培地で所望濃度に希釈。50µLをシリコンウェルに滴下し、アジレント4155Bアナライザーで電流変化を記録。

結果と考察

10×10cmグラフェンフィルム（図1a）は裸銅に比べてわずかな暗化を示し、グラフェン被覆を確認。ラマン分析（図1b）でGピーク1580cm⁻¹、2Dピーク2680cm⁻¹、I_G/I_2D比（<0.5）と無視できるDピーク（図1c）が単層品質と低欠陥密度を確認。

a 裸銅箔（左）とグラフェン被覆銅箔（右）。b グラフェン/銅のラマンスペクトル。c グラフェン/SiO₂/Siのラマンスペクトル。

PET上のフレキシブルセンサー（図2）は、50µLサンプルを細胞プールに添加した際に明確な電気信号を生成。サンプル添加前はベースライン電流が安定、接触とともに電流低下し新たな値で安定。相対応答η = (I₀ – I)/I₀ × 100%は、細胞フリー培地で2.96%、30 cells/mLのCTC溶液で37.04%となり、がん細胞に対する顕著な感度を示しました。

グラフェン/PETバイオセンサーの写真。

時間分解測定（図3）では、30 cells/mL CTC溶液がわずか2.1秒で5%応答に達したのに対し、同濃度の培地では0.15%変化のみ。10秒未満の迅速応答は、ポイントオブケア用途への適合性を確認します。

a 細胞フリー培地の電気応答。b 30 cells/mLがん溶液の応答。

さらに2種の異なるCTC株（SUDHL8とOCILYS）を10,000 cells/mLでテスト。両方とも測定可能な応答を示しましたが、電流-時間プロファイルが有意に異なり、センサーが細胞タイプを識別できることを示唆（図5）。

（a）SUDHL8と（b）OCILYS細胞の時間依存応答。

最後に、SUDHL8細胞で10Kおよび100K cells/mLの濃度依存性を評価。高濃度ではわずかに小さい電流変化——密集細胞の絶縁性を反映——を示しましたが（図6）、明確な応答を維持し、定量的ポテンシャルを示しました。

a 10K vs 100K cells/mLの電流-時間。b 対応する応答曲線。

総括すると、ハンドメイドのフレキシブルグラフェンバイオセンサーが、卵巣がんCTCを高感度かつ迅速に検出し、細胞タイプを識別し、細胞濃度を定量化できる——これらすべてが数秒以内に可能であることをデータが実証しています。

結論

我々はPET上にシンプルでフレキシブルなグラフェンバイオセンサーを作製し、卵巣がんCTCを驚異的な速度と感度で検出しました。サンプル添加前後の電気信号比較により、がん性・非がん性培地を区別し、異なる細胞株を識別し、細胞濃度を定量化します。この低コストプラットフォームは、卵巣がんの早期発見とモニタリングを改善する迅速なポイントオブケア診断の可能性を秘めています。

データと材料の入手可能性

本研究で生成・分析されたすべての関連データは、本論文および補足ファイルに含まれています。

略語

CA:

Carbohydrate antigen（炭水化物抗原）

CTC:

Circulating tumor cell（循環腫瘍細胞）

PET:

Polyethylene terephthalate（ポリエチレンテレフタレート）

FDA:

Food and Drug Administration（米国食品医薬品局）

CVD:

Chemical vapor deposition（化学気相成長）