凍結乾燥単相溶液法を使用したグリチルレチン酸リポソームの調製：予備処方、最適化、およびinvitro評価

背景

トリテルペンサポニンの一種であるグリチルレチン酸（GA）は、主に漢方薬のカンゾウの根から抽出されます[1]。研究によると、GAには明らかな抗菌、抗ウイルス、および抗癌効果があり、慢性肝炎および肝臓癌の臨床治療に一般的に使用されています[2、3、4]。バイオ医薬品分類システムによると、GAはタイプIIの薬剤です。 GA分子の極性が低く、疎水性が高く、溶解性が低いため、経口バイオアベイラビリティは比較的低くなります[5]。さらに、GAは高血圧に関連するナトリウム貯留とカリウム喪失を引き起こす可能性があります[6]が、GAの副作用は用量依存的であるようです。したがって、適切な製剤戦略を使用して吸収を高め、GAの有効濃度を維持すると、バイオアベイラビリティと安全性が大幅に向上します。

薬物担体としてのリポソームの優位性は広く認識されています[7、8、9]。それらの機能上の利点は、主に以下の側面を通じて示されます。（1）リポソームは優れた生体適合性と安全性を備えています。 （2）リポソームは、リンパ節への標的化された薬物送達を強化し、抗癌剤が正常な細胞および組織に及ぼす阻害効果または損傷を低減します。 （3）適切なサイズの薬物担体リポソームは、毛細血管透過性が増加する固形腫瘍、感染、および炎症の部位での透過性および保持効果が増強されており、受動的標的化の能力を示しています。 （4）リポソームは、疎水性薬物と水溶性薬物の両方を運ぶことができます。 （5）リポソーム表面を修飾して官能基に結合させることができる。これらの有利な特性の結果として、多くのリポソーム薬が承認されています。

従来のリポソーム調製法によって得られる生成物は、水性リポソーム懸濁液である。しかし、水性リポソーム懸濁液は比較的不安定であり、保存中に漏れ、融合し、リン脂質の加水分解を受ける可能性があり、その結果、長期保存能力が制限されます[10]。現在、これらの問題を解決する効果的な方法は、プロリポソームを調製することです[11]。プロリポソームは、脱水されたリポソーム成分と賦形剤から作られる流動性の良い粉末です。リポソームは、適用前にプロリポソームを水に分散させることによって再構築することができます。噴霧乾燥と凍結乾燥は、プロリポソームの調製に最も一般的な2つの方法です[12]が、用途にはいくつかの制限があります。たとえば、噴霧乾燥は感熱性薬剤には適さず、装置の熱効率が低いために壁の付着などの問題を引き起こす可能性があります。リポソーム二重層の構造的再配列は、噴霧乾燥プロセス中に発生する可能性があります[13]。一般的に使用されている凍結乾燥法は水懸濁システムですが、水は凍結乾燥に時間がかかるため、この方法は非常に費用と時間がかかります。

近年、新しいプロリポソーム調製法（凍結乾燥単相溶液法）が開発されました[14、15]。この方法では、脂質、薬物、および水溶性凍結保護剤をtert-ブチルアルコール（TBA）/水共溶媒系に溶解し、水を加えた後、凍結乾燥してプロリポソームを取得し、均一なリポソーム懸濁液を形成します。この方法にはいくつかの利点があります。（1）TBAを追加すると、氷の昇華速度が大幅に向上し、経済的に有利な迅速かつ完全な凍結乾燥が可能になります。同時に、急速な昇華は、塊が崩壊するのを防ぐのに有益です[16]。 （2）凍結乾燥単相溶液法はワンステッププロセスであり、大規模なリポソーム調製に非常に効果的な方法です。 （3）残留溶媒に関するICHガイドラインには記載されていませんが、TBAは、LD ₅₀ の類似性に基づいて、クラス3の低毒性溶媒のカテゴリに分類される可能性があります。 他のクラス3溶媒の毒性データ[17]。 （4）この方法で滅菌粉末を得ることができます。 （5）水溶性や水安定性の悪い薬剤に適しています[18]。

リポソーム調製のためのTBA /水凍結乾燥システムの使用に関するいくつかの報告があります。しかし、このシステムの研究は不十分であり、多くの疑問が残っています。たとえば、異なる濃度のTBA /水システムの昇華速度の変化、異なる濃度のTBA /水システムによる凍結乾燥後の特定の薬物の固体特性の変化、および凍結乾燥粉末の水和および組み立てプロセスは次のとおりです。まだ不明です。一方、異なる比率と温度のTBA /水共溶媒への特定の疎水性薬物の溶解度は非常に特異的です。上記の情報は、薬物担体リポソームの処方および技術設計にとって重要です。したがって、本研究では、GAをモデル薬剤として使用し、上記のように製剤化前の調査を実施しました。さらに、主要な評価尺度として平均直径と捕捉効率を使用して、Box-Benhnken設計を使用した凍結乾燥単相溶液法によって調製されたGA-リポソームの製剤と処理変数を最適化しました。リポソームのinvitro放出および肝細胞癌細胞によるそれらの取り込みと同様に、リポソームの品質に対する凍結乾燥保護剤の種類の影響を評価した。

メソッド/実験

資料

グリチルレチン酸（純度> 98％）は、Dalian Meil​​un Biology Technology Co.、Ltd。（Dalian、China）から入手しました。大豆ホスファチジルコリン（Lipoid S100）は、Lipoid GmbH（ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）から購入しました。コレステロールはJ＆K Scientific Ltd.（北京、中国）から購入しました。 GAの参照化合物は、National Institutes for Food and Drug Control（北京、中国）から購入しました。 FITC-PEG-DSPE（分子量2000）は、Shanghai Ponsure Biotech、Inc。（Shanghai、China）から購入しました。 tert-ブチルアルコール（> 98％）およびその他すべての試薬は、特に明記されていない限り、Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd。（北京、中国）から購入しました。脱イオン水は、Milli-Q浄水システム（Millipore、米国マサチューセッツ州ベッドフォード）によって調製されました。

TBA /水共溶媒システムにおけるGA、SPC、およびコレステロールの溶解度研究

異なるTBA体積分率のGAの飽和TBA水溶液（30 ml）は、25°C、30°C、35°C、40°C、および45°Cで対応するビヒクル内の過剰な薬物を攪拌することによって調製されました。 72時間。遠心分離（3000 rpmで15分）後、上清を0.45μmミクロポーラスフィルターに通しました。 GAの飽和溶解度は、適切に希釈した後、HPLCで測定しました。各TBA /水共溶媒で3回繰り返しました。 HPLC分析は、UV検出器に接続されたクォータナリポンプ、オートサンプラー、およびカラムコンパートメントを備えたLabAlliance（モデルシリーズIII）HPLCシステム（Lab Alliance、天津、中国）で実行されました。分離はC18カラム（4.6mm×250mm;5μm; Dikma Technologies、北京、中国）で行いました。メタノールと水（90:10 V / V ）を1.0 ml / minの流速で移動相として使用しました。分析物は、250nmのUV検出器によって検出されました。

TBA /水共溶媒系における大豆ホスファチジルコリン（SPC）（またはコレステロール）の溶解度は、タービジメトリー法を使用して推定されました[19、20]。簡単に説明すると、10 mgのSPC（またはコレステロール）を25°C、30°C、35°C、40°C、および45°CでTBAに溶解し、透明な溶液を得ました。実験期間中、温度は維持された。濁度が最初に発生するまで、25°CのSPC（またはコレステロール）のTBA溶液に、同じ温度の精製水を少しずつ加え、臨界水量の値を記録しました。濁度は、T6モデルUV-Vis分光光度計（Purkinje General Instrument Co.、Ltd。、北京）でブランク溶液（精製水）に対する655 nm（> 0.04）の吸収値を検出することで特定できます。

凍結乾燥単相溶液法を使用したリポソームの調製

GA、SPC、コレステロールを45°CでTBAに溶解し、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロースなどの水溶性凍結保護剤を45°Cの水に溶解しました。次に、これら2つの溶液を適切な比率で混合して、3番目の透明な等方性単相溶液（総量60 ml）を得ました。単相溶液を0.22μmの細孔でろ過滅菌した後、2.0mlの充填量で10mlの凍結乾燥バイアルに充填しました。 − 40°Cで12時間予備凍結した後、凍結乾燥機（SJIA-10N、Ningbo Shuangjia Science Technology）内で、チャンバー圧力1〜20 Pa、保存温度-50°Cで24時間凍結乾燥を行いました。 Development Co.、Ltd.、China）。

リポソームの粒子サイズとカプセル化効率の測定

リポソーム懸濁液は、5mgのプロリポソーム粉末を5mlの精製水に加え、その後、完全に水和するために15分間隔で1分間2回ボルテックス攪拌することによって調製しました。リポソームのサイズ分析は、レーザー粒子サイズアナライザー（Nano ZS90 Malvern Instruments、英国）を使用して特徴づけられました。

リポソームへのGAのカプセル化効率は、限外濾過-遠心分離技術によって決定された。簡単に説明すると、1mlのリポソーム分散液（5mlの精製水に500μgのプロリポソーム）を10 mlのメスフラスコにピペットで入れ、次に5mlの精製水と2mlのアセトンを加え、精製水で10mlに希釈します。この懸濁液0.5mlを、分子量を50 kDaにカットオフした遠心フィルター（Amicon Ultra-0.5、Millipore、Cdduounty Cork、アイルランド）の上部チャンバーに移し、10,000 rpmで30分間、15°Cで遠心分離しました。超遠心分離機（CP70MX、日立工業株式会社、日本）。次に、20μlの限外ろ過液を250 nmのUV吸収波長でHPLCシステムに注入し、GAの含有量を遊離薬物の含有量と呼びました。カプセル化効率（EE）は、次の式に従って計算されました

ここで W _無料 は遊離薬物の量であり、 W _合計 総薬剤量です。

TBA /水混合物の昇華速度の決定

異なるTBA体積分率（10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、および90％）の1ミリリットルのTBA /水混合物を、10mlの凍結乾燥バイアルに入れました。 、 それぞれ。 TBA /水混合物を-40°Cで12時間予備凍結した後、凍結乾燥機（SJIA-10N、Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co.、Ltd。、中国）によって-50°Cで凍結乾燥しました。 TBA /水混合物が凍結乾燥バイアルから完全に消失した時間を記録し、昇華速度を体積（μl）を時間（分）で割って計算しました。

TBA /水混合物の飽和蒸気圧の測定

実験装置の詳細と操作手順は他の場所で説明されています[21、22]。システムTBA /水の蒸気圧（10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、および90％）は、静的な方法で測定されました。この装置は、TBA /水混合物で満たされた作動エブリオメーター、純水で満たされた参照エブリオメーター、バッファー容器、2つのコンデンサー、2つの温度測定、および圧力制御システムで構成されていました。システムの平衡圧力は、アントワン式[23]で表される温度と圧力の関係に関して、参照エブリオメーターの純水の沸点によって決定されました。

GAの溶解度の決定

遊離GAの水への溶解度は、サーモスタット制御の水浴（DF-101S、河南省水器株式会社、中国）平衡が達成されるまで（48時間）25°Cで。サンプルを0.45μmメンブレンフィルターでろ過し、メタノールで適切に希釈し、HPLCで分析しました[24]。実験は3回行った。

事前凍結されたTBA /水混合物の表面形態観察

5ミリリットルの水/ tert-ブタノール混合物を90mmのペトリ皿に注ぎ、コールドトラップ（-40°C）で凍結しました。凍結サンプルは、XSP-4C光学顕微鏡（Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd.、Shanghai、China）を使用して観察されました。

透過型電子顕微鏡

リポソームの外観は、Hitachi HT7700透過型電子顕微鏡（TEM）（Hitachi、Japan）によって加速電圧100kVで観察されました。リポソーム懸濁液は、5mgのプロリポソーム粉末を5mlの精製水に室温で加え、10秒間ボルテックスで混合した後、30秒間静置することで得られました。マイクロピペットで液滴を抜き取り、カーボンコーティングされた銅グリッド上に配置しました。グリッドを濾紙でブロッティングすることにより、過剰の懸濁液を除去した。 1％リンタングステン酸溶液を使用したネガティブ染色（ w / w 、pH 7.1）は堆積物に直接作成されました。余分なものはろ紙で取り除き、分析前に沈殿物を乾燥させました。

フーリエ変換赤外分光法

サンプルのフーリエ変換赤外分光法（FTIR）スペクトルは、Nicolet 6700 FTIR分光光度計（Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、米国）で取得しました。すべてのサンプルと臭化カリウムを瑪瑙乳鉢で混合し、薄いディスクに圧縮しました。スキャン範囲は4000〜400 cm ^-1 でした 解像度は4cm ^-1 。

示差走査熱量測定

示差走査熱量測定（DSC）測定は、HSC-1 DSC走査熱量計（Hengjiu Instrument、Ltd。、北京、中国）で実施しました。 15 mgのサンプルをアルミニウム製の鍋に入れ、サンプルパンプレスで密封しました。プローブは、窒素雰囲気下で10°C /分の速度で25から350°Cに加熱されました。

X線回折

サンプルの構造特性は、Cu-Kα放射線を使用したD8フォーカスX線回折計（Bruker、ドイツ）を使用して取得しました。測定は、40kVおよび40mAの電圧で実行されました。サンプルは5°から60°までスキャンされ、スキャンされた速度は5°/分でした。

GAプロリポソームの安定性

GAプロリポソーム粉末をガラス瓶に移し、窒素を充填し、密封し、室温で光を避けて保管した。安定性テストは、再構成されたリポソームの捕捉効率と粒子サイズを指標として使用して、6か月間実施されました。

インビトロ薬物放出

リポソームからのGAの放出は、37±0.5°Cで透析法を使用して観察されました。 PBS（pH 7.4）または通常の生理食塩水でリポソームを再構成して0.5 mg / mlのGAを作成した後、各リポソーム分散液（5 ml）のアリコートを透析バッグ（分子量カットオフ8000〜14,000 Da）に入れました。しっかりと密封されています。次に、チューブを150 mlの放出培地、PBS（pH 7.4）、または0.1％（ v を含む通常の生理食塩水）に浸しました。 / v ）シンク状態を維持するためのTween 80 [25、26]。マグネチックスターラーを使用して300rpmで放出媒体を攪拌しながら、放出媒体からサンプル（1.5 ml）を所定の時間間隔で12時間採取し、同量の新鮮な媒体を再充填しました。 GAの濃度は、メタノールで適切に希釈した後、HPLCで測定しました。

インビトロ細胞取り込み

蛍光リポソームは凍結乾燥単相溶液法により調製した。簡単に説明すると、30 mg GA、254 mg SPC、75.5 mgコレステロール、および21.2mgFITC-PEG-DSPEの混合物をTBAに溶解しました。さらに、1016mgのトレハロースを水に溶解しました。次に、これら2つの溶液を混合して、透明な単相溶液（総量30 ml）を得ました。単相溶液を0.22μmの細孔でろ過して滅菌した後、充填量2.0mlの10ml凍結乾燥バイアルに充填し、24時間凍結乾燥し、水を加えて使用するまでリポソームを再構成しました。

HepG2細胞（Wanleibio、Co.、Ltd.、Shenyang、China）は、10％FBS（ウシ胎児血清）を含むDMEMで培養しました。 6ウェルプレートで90％のコンフルエンスが達成されるまで細胞をプレーティングし、5.0％CO ₂ を使用して37.0°Cの加湿インキュベーターで細胞を培養しました。 。 24時間のインキュベーション後、200μlのFITC-GA-リポソーム懸濁液を1 mlのHepG2細胞懸濁液に添加しました（1×10 ⁴ ウェルあたりの細胞数）。 0.5時間、1時間、2時間、および4時間のインキュベーション後、細胞をpH 7.4 PBSで3回洗浄し、細胞外蛍光を0.4％（ w / v ）トリパンブルー溶液。細胞を1％で溶解しました（ w / v ）トリトンX100。 RF5301蛍光分光光度計（島津製作所、東京、日本）を使用して、495nmの励起および520nmの発光での細胞溶解物の蛍光強度を測定しました。相対蛍光値は、細胞溶解緩衝液で測定されたリン脂質濃度対FITC蛍光強度の標準曲線に基づいてリン脂質濃度に変換されました。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイキット（Pierce、ロックフォード、イリノイ州、米国）を使用して決定しました。取り込みは、細胞タンパク質1ミリグラムあたりのリン脂質の量として表されました[27]。

結果と考察

事前処方調査

溶解度の調査

リポソームは凍結乾燥単相溶液法を使用して調製されるため、溶解度研究を実施して、凍結乾燥前に薬物および担体材料がTBA /水溶液に溶解できることを確認しました。

図1は、体積分率が異なるTBA /水共溶媒システムにおけるGAの飽和溶解度の変化を示しています。 25°Cから45°Cの範囲内で、GAの飽和溶解度はTBAの体積分率が10から60％に増加するにつれて連続的に増加し、GAの飽和溶解度はTBAの体積分率が> 40％のときに> 0.5 mg / mlでした。一方、GAの飽和溶解度は、同じ体積分率で維持された場合、TBA /水溶液の温度の上昇とともに増加しました。 TBAの体積分率が30％に達すると、さまざまな温度での溶解度の違いがますます明らかになりました。 TBA /水共溶媒システムにおける大豆リン脂質とコレステロールの溶解度は、積み上げ列グラフに示されています（図2）。図2a、bは、リン脂質とコレステロールの単位（1 mg）がそれぞれ異なる温度で飽和溶解度に達するのに必要なTBA /水混合物の量を表しています。灰色の領域は水の量を表し、黒い領域はTBAの量を表します。温度が25°Cから45°Cに徐々に上昇するにつれて、TBA /水共溶媒の総量と1 mgのリン脂質を溶解するために必要なTBAの体積分率（カラムのラベル）は徐々に減少しました（図2a）。温度が35°Cを超えると、必要なTBAの量が大幅に減少し、0.15ml未満になりました。同様に、温度が25°Cから45°Cに徐々に上昇するにつれて、1 mgのコレステロールを溶解するために必要なTBAの量が減少しましたが、TBAの量の割合は徐々に減少する傾向を示しました。上記の結果は、温度とTBAの体積分率が、リン脂質、コレステロール、GAの溶解度に大きく影響することを示しています。

体積分率が異なるTBA /水共溶媒へのGAの飽和溶解度（平均±SD、 n =3）

SPCの溶解度（ a ）およびコレステロール（ b ）体積分率が異なるTBA /水共溶媒中

体積分率の異なるTBA /水共溶媒システムの昇華率の比較

昇華速度は、凍結乾燥粉末の生産効率に直接影響します。より速い昇華速度はより経済的であり、材料の崩壊を防ぐことができます[16]。この研究では、さまざまな濃度のTBA /水システムの昇華率を調べました。図3に示すように、混合溶媒の昇華率は、TBAの体積分率が10％から90％に増加するにつれて徐々に増加しました。さらに、体積分率が60％を超えると、昇華速度は10μl/分を超えました。

体積分率が異なるTBA /水共溶媒の昇華率（平均±SD、 n =3）

体積分率の異なるTBAの昇華速度の違いの理由を特定するために、まず凍結サンプルの表面形態を調べました。図4には、体積分率が40％から80％のTBA /水溶液の光学顕微鏡画像が含まれています（体積分率が30％未満のTBAは、光学顕微鏡で急速に溶融するため、検査できませんでした）。体積パーセントが40％のTBAと比較して、体積が50％を超えるTBAは、明確で散在する針状の構造を持っています。 TBAの体積分率が高くなると、針状結晶の直径が小さくなり、比表面積が大きくなり、昇華率が高くなると推測されます。

光学顕微鏡（倍率×100）による異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒の表面形態。 a 40％。 b 50％。 c 60％。 d 70％。 e 80％

さらに、25°Cでさまざまな体積分率を使用して、TBA /水共溶媒システムの飽和蒸気圧も測定しました。図5は、TBAの体積分率が異なるTBA /水共溶媒システムの飽和蒸気圧の変化の棒グラフです。図に示すように、混合溶媒の飽和蒸気圧は、TBAの体積分率が増加するにつれて徐々に増加する傾向があります。アントワン式（式2）のように、温度は飽和蒸気圧と正の相関関係があるため、凍結乾燥温度（− 50°C）での共溶媒系の飽和蒸気圧は、体積パーセントとして増加すると推測できます。 TBAの割合が増加し、これが昇華率が徐々に増加する理由の1つである可能性があります。

ここで p は蒸気圧、 T は温度、 A および B コンポーネント固有の定数です。

体積分率が異なるTBA /水共溶媒の飽和蒸気圧（平均±SD、 n =3）

体積分率の異なるTBA /水共溶媒システムにおけるGAの物理的および化学的特性に対する凍結乾燥の影響

TBA /水共溶媒系におけるGAの物理化学的性質に対する凍結乾燥の影響を調査するために、以下の実験を行った。 10ミリグラムのGAを、さまざまなTBA体積パーセント（40％、50％、60％、70％、および80％）の8 ml TBA /水共溶媒に溶解しました。単相溶液を0.22μmの細孔でろ過滅菌した後、2.0mlの充填量で10mlの凍結乾燥バイアルに充填しました。凍結乾燥は、凍結乾燥機により、-50°Cで24時間実施しました。

異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒システムにGAを溶解した後の凍結乾燥粉末のDSCスペクトルを図6aに示します。原薬のDSC曲線は、GAの融点である301°Cに明らかな吸熱ピークを示しています。異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒システムでの凍結乾燥により、GA融解ピークが前方にシフトしました。融解ピークシフトの大きさは、TBAの体積分率が低下するにつれて増加しました。

DSC（ a ）、XRD（ b ）、およびFTIR（ c ）体積分率の異なるTBA /水共溶媒での凍結乾燥後のGAの。 （a）GA、（b）40％TBA、（ c ）50％TBA、（d）60％TBA、（e）70％TBA、および（f）80％TBA

以前の研究では、TBAの濃度が、結晶相、アモルファス相、または準安定相の複雑な混合物の形成に深く影響する可能性があることがすでに示されています[28]。場合によっては、TBAを使用すると結晶化度が低下する可能性があり、別の場合はその逆です[29]。

異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒システムにGAを溶解した後の凍結乾燥粉末のX線回折（XRD）スペクトルを図6bに示します。原薬のXRDスペクトルは、5°から20°の間にいくつかの明確な結晶回折ピークを示しています。異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒システムでの凍結乾燥により、サンプルのXRDスペクトルの5°から20°で回折ピークが消失しました。これは、元の薬物結晶がアモルファスになったことを示しています。

異なるTBA体積分率のTBA /水共溶媒システムにGAを溶解した後の凍結乾燥粉末のFTIRスペクトルを図6cに示します。原薬のFTIRスペクトルの形状は、4000〜400 cm ^-1 内のTBA体積分率が異なるTBA /水共溶媒システムの凍結乾燥粉末の形状と一致しています。 範囲。新しい官能基に特徴的なピークは出現しませんでした。これは、GAの化学構造が、体積分率の異なるTBAでの凍結乾燥後も同じままであることを示しています。

結晶形から無定形への変化は、薬物の溶解度を変化させ、それによって水和再構成中のプロリポソームのカプセル化に影響を与える可能性があります。この研究では、25°Cで凍結乾燥したGA粉末の水溶性を測定しました。凍結乾燥したGAの水への飽和溶解度は、TBAの体積分率が40％から80％に増加するにつれて、64.10から19.27μg/ mlに徐々に減少することがわかりました。ただし、それでも原薬の水への溶解度（6.36μg/ ml）よりも大幅に高く、凍結乾燥中の結晶構造からアモルファス構造への変化が原薬の溶解度に影響を与えることを示しています（図7）。

体積分率が異なるTBA /水共溶媒へのGA凍結乾燥の水溶解度（平均±SD、 n =3）

単一因子実験

リポソームの品質に影響を与える可能性のある多くの要因があります。リン脂質/薬物比が薬物のカプセル化品質に影響を与えることはよく知られています[30]。適度な量のコレステロールは、脂質膜の秩序だった配置と安定性を高めることができます。しかし、リポソーム中のコレステロール含有量が高いと、膜の柔軟性が低下し、それによって脂質二重層への薬物の浸透が妨げられる可能性があります[31]。この研究では、リポソームの品質に影響を与える3つの要因を選択し、単一要因の調査を実行して、共溶媒中のSPCの量、コレステロールの量、TBAの体積分率などの後続の最適化テストの適切な値を決定しました。リポソームの品質は、カプセル化効率と平均直径の観点から評価されました。各実験は、他のすべてのパラメータを一定値、GA 60 mg、凍結前温度-40°C、凍結前時間12時間に設定して、3回実行しました。この研究では、スコアリングシステムを介して結果を比較し、カプセル化率と平均直径の両方に等しい重みを与えました。スコアリングは次のように行われました。

ここで、EEはカプセル化効率、MEEはグループの最大カプセル化効率、MDは平均直径、MMDはグループの最大平均直径です。

実験計画と結果を表1に示します。表からわかるように、この実験でテストした範囲内で、SPCの量が480 mg（薬剤とSPCの比率が1：1）の場合に個別に最高スコアを取得できます。 8、 w / w ）、コレステロールの量は120 mgです（コレステロールとSPCの比率は1：4、 w / w ）、共溶媒中のTBAの体積分率は50％です。したがって、これらのパラメーターは、応答曲面最適化設計の中心レベルとしてそれぞれ選択されました。

ボックスベンケン設計によるパラメータの最適化

さまざまな要因間の相互作用をさらに研究するために、Box-Benhnken設計によってパラメーターの最適化が実行されました。単一因子実験の結果に基づいて、SPCの量（ X ）を含むパラメーター間の相互作用を調査および最適化しました。 ₁ ）、コレステロールの量（ X ₂ ）、TBAの体積分率（ X ₃ ）Box-Benhnkenデザイン（BBD）による。カプセル化効率（ Y ₁ ）および平均直径（ Y ₂ ）が回答として選ばれました。 2つの応答を同時に最適化するために、望ましさ関数を使用して最適化プロセスが実行されました。 Y ₁ および Y ₂ 同じ重み（重要性）を持っています。 Y ₁ Y の間、最大化する必要がありました ₂ 最小化する必要がありました。望ましい範囲は0から1（最小から最大）です。実験計画と結果を表2に示します。最も重要な効果と相互作用を見つけるために、分散分析（ANOVA）は、統計ソフトウェアであるDesign Expertトライアルバージョン8.03（Stat-Ease、Inc。、ミネアポリス、米国）によって計算されました。 2つの応答のカプセル化効率と平均直径を最適化するための適切な統計モデルとして、2つの2次モデルが選択されました。カプセル化効率を応答として関連付けるANOVAの結果を表3に示しました。これは、モデルが F で調査されたすべての要因に対して有意であることを示しています。 12.81の値（ P <0.05）。この場合、 X ₁ 、 X ₂ 、 X ₁ X ₂ 、 X ₁ X ₁ 、 X ₂ X ₂ 重要なモデル用語でした（ P <0.05）、要因の影響を示しています（ X ₁ および X ₂ ）カプセル化の効率は単純に線形ではありませんでした。交互作用項は特に有意であり、因子間の良好な交互作用を示しています。それどころか、応答としての平均直径に関連するANOVAの結果（表3）は、モデルが F で調査されたすべての要因に対して有意ではなかったことを示しました。 1.9の値（ P > 0.05）。この場合、 X ₃ 重要なモデル用語でした（ P <0.05）、TBAの体積分率が平均直径に大きな影響を与える一方で、SPCの量（ X ₁ ）およびコレステロールの量（ X ₂ ）大きな影響はありません（ P > 0.05）。さらに、3つの変数の間に有意な相互作用はありませんでした。

2つの応答と望ましさの値に対する独立変数の影響をより適切に視覚化するために、複数の非線形回帰モデルの3次元プロファイルを図8に示します。図8a〜fは、 X ₁ 、 X ₂ 、および X ₃ それぞれ、カプセル化効率と応答としての平均直径の下で。三次元プロファイルは、パラメーターの3つのペアがカプセル化効率と再構成されたリポソームの平均直径にどのように影響するかを示しました。カプセル化の効率を上げるために、3つの表面はすべて上凸であり（図8a–c）、実験領域の中心に最大点があり、3つの変数間に良好な相互作用があることを示しています。平均直径については、図8dの形状は平面に似ており、 X ₁ および X ₂ 平均直径への影響は少ないです。図8e、fの表面の等高線は両方とも傾斜を示しました。 TBAの体積分率を上げると、平均直径が減少しました。これは、係数 X を示しています。 ₃ 平均直径に明らかな影響を及ぼしましたが、 X 間に明らかな相互作用はありませんでした ₃ と他の2つの要因。

X Xの効果の3次元プロット（ a ）、X X（ b ）およびX X（ c ）カプセル化効率と、平均直径に対するX X（d）、X X（e）、およびX X（f）の影響について

二次モデルに基づいて、ソフトウェアによって計算されたリポソーム調製の最適条件は、次のとおりでした：508 mgのリン脂質量、151 mgのコレステロール量、および55％のTBAの体積分率。これらの条件下で、カプセル化効率と平均直径は、それぞれ68.55％と220nmであることがわかりました。

リオプロテクタントの種類と投与量の選択

凍結中の成長中の氷晶と親水性物質（脂質膜の親水性部分を含む）との間の液体の水の競合は、リン脂質基への氷晶の付着につながります。これにより、脂質膜が損傷する可能性があります。再水和後の脂質膜融合は、粒子サイズの増加とカプセル化された薬物の漏出を引き起こします。凍結防止剤は、凍結融解プロセス中のリポソームの損傷を減らすことができます[32]。この研究では、さまざまなタイプ（ラクトース、スクロース、トレハロース、マンニトール）と投与量（凍結防止剤とSPCの比率は1：2、1：1、2：1、4：1、および6：1 w / w ）再構成されたリポソームのスコアに対する凍結保護剤の。他のすべての変数を一定に保ちながら、単一因子実験を実行しました：GA量60 mg、SPC量508 mg、コレステロール量151 mg、共溶媒中のTBAの体積分率55％、凍結前温度- 40°C、12時間の事前凍結時間。実験結果を図9に示します。カプセル化効率は、最初に増加し、次に凍結防止剤/ SPCの重量比を1：2から1：6に減らすことによって減少します。ここで、ラクトース、スクロース、およびマンニトールはそれぞれ凍結防止剤として使用されます。ただし、トレハロース基のカプセル化効率は、凍結保護剤/ SPCの重量比が減少するにつれて絶えず増加します（図9a）。平均直径（図9b）に関しては、1：2から1：6の範囲で、ラクトース、スクロース、およびマンニトールグループの平均直径が218nmを超えることがわかりました。それでも、凍結保護剤/ SPCの重量比が4：1を超える場合、トレハロース基の平均直径を190nm未満に減らすことができます。明らかに、トレハロースの保護効果は、テストされた他の凍結保護剤よりも優れています。トレハロースは、おそらく脂質の極性頭部基との水素結合の形成、および水の四面体水素結合ネットワークの破壊のために、膜に対して優れた保護能力を持っています[33]。スコア（図9c）によると、トレハロース/ SPCの重量比が4：1および6：1のときに最高のスコア（0.24）が得られました。最後に、コストと薬物負荷の増加の観点から、実験を追跡するためにトレハロースと4：1（トレハロース/ SPC重量比）を選択します。

カプセル化効率に対する凍結防止剤とSPCの質量比の影響（ a ）、平均直径（ b ）とスコア（ c ）再構成されたリポソームの（平均±SD、 n =3）

上記のBox-Benhnken設計と凍結防止剤スクリーニング実験により、実験条件が決定されました：GA量60 mg、SPC量508 mg、コレステロール量151 mg、共溶媒中のTBAの体積分率55％、重量トレハロースとSPCの比率は4：1でした。これらの条件下では、カプセル化効率と平均直径はそれぞれ74.87％と191nmでした。

透過型電子顕微鏡

この研究では、リポソーム懸濁液のTEMを同じ時点（同じ水和時間）で取得しました。サンプルのさまざまな状態を観察しました。これは、リポソームの自己組織化挙動を説明する可能性があります。図10aは、水和の初期状態を示しています。大量のGA（黒い点）が分散したリン脂質（半透明の物質）に包まれており、リン脂質断片の自発的な凝集が起こっていることがわかります。図10bは、完全に組み立てられたリポソーム（平均直径約200 nm）の形態を示しています。これは、リン脂質二重層構造（薄い灰色の部分）を備えたほぼ球形でした。さらに、薬物粒子（濃い灰色の点）が脂質二重層に閉じ込められました。

再構成されたリポソームの透過型電子顕微鏡写真（ a ）プロリポソームの水和の初期状態、（ b ）完全に組み立てられたリポソーム

GAプロリポソームの安定性

6か月後、プロリポソーム粉末は良好な可動性と変化のない外観を示します。リポソーム懸濁液は、精製水と接触すると自動的に形成されます。再構成されたリポソームの捕捉効率と粒子サイズは72.82％と198nmでした。 6か月前に再構成されたリポソームのデータと有意差はありません。したがって、GAプロリポソームは25°Cで6か月以上安定していると見なすことができます。

インビトロ薬物放出研究

カプセル化されたリポソームからのインビトロ薬物放出の評価は、透析法によって行われた。 PBS（pH 7.4）および生理食塩水中の37°CでのGA負荷リポソームからのGAのin vitro放出プロファイルを図11に示します。両方のグループの放出プロファイルは、1以内で速い放出（より大きな勾配）を示しました。 h、1時間後に曲線の傾きが小さくなり、放出速度が遅くなり始めます。生理食塩水群の薬物放出曲線形状は、PBS群と類似しています。 GAをロードしたリポソームからのGAのinvitro放出は、12時間で65.25±4.82％およびPBSと生理食塩水から69.46±4.32％でした。有意差なし（ P =0.088、ペアの t テスト、SPSSソフトウェア17.0）は、研究期間全体にわたって異なる放出媒体でのGAの放出について発見されました。これは、再構成されたリポソームが2種類の放出媒体で両方の徐放性能を持っていることを示しました。

PBSおよびb生理食塩水中のGAをロードしたリポソームからのGAのinvitro溶解プロファイル（平均±SD、 n =3）

インビトロ細胞取り込み

図12aは、Hep G2細胞によるGA-リポソームの取り込みプロセスが、実験濃度下で時間依存性であることを示しています。 30分間のインキュベーション後、Hep G2細胞による薬物負荷リポソーム（単位質量タンパク質）の取り込み量は1480ngでした。 30〜240分の範囲で、薬物をロードしたリポソーム（単位質量タンパク質）の取り込み量が1480〜2030ngに徐々に増加しました。図12b–eは、薬物をロードしたリポソームの摂取後30、60、120、および240分でのHep G2細胞の蛍光顕微鏡画像を示しており、蛍光強度も時間の経過とともに徐々に増加することが観察されています。この結果は、単相溶液法で調製された再構成リポソームが肝細胞癌細胞に効果的に取り込まれることを示しています。

HepG2細胞によるGA負荷リポソームのinvitro細胞取り込み。 a 取り込み量とインキュベーション時間の関係。 b – e 30、60、120、240分での蛍光顕微鏡画像

結論

本研究では、前製剤の調査、製剤設計、および凍結乾燥単相溶液法によるGA負荷リポソームのinvitro特性評価が行われました。事前処方研究を実施した後、温度が40°Cを超えると、GA、コレステロール、およびSPCのTBA /水共溶媒への溶解度が大幅に増加することがわかりました。共溶媒の昇華速度は、TBAの体積分率の増加とともに徐々に増加しました。これは、おそらく凍結共溶媒の表面形態と飽和蒸気圧に関係しています。 TBA /水共溶媒システムを使用した凍結乾燥後、GAはアモルファス構造になりました。さらに、水溶性が増加しました。これは、水和した再構築中のプロリポソームのカプセル化に影響を与える可能性があります。 Box-Benhnkenの設計による最適化と凍結防止剤のスクリーニングの後、凍結乾燥単相溶液プロセスの最適条件（508 mg SPC、151 mgコレステロール、55％TBAの体積分率、4：1トレハロース/ SPC重量比）が達成されました。最適な条件下で、再構成されたリポソームの十分なカプセル化効率（74.87％）と平均直径（191 nm）が得られました。再構成されたリポソームは、TEM分析によって確認されたように、最初の集合および最終的な球形をもたらした。生成されたGAをロードしたリポソームのinvitro放出プロファイルを2つの培地で調べたところ、どちらも12時間の持続放出を示しました。細胞取り込み研究は、HepG2細胞による再構成リポソームの取り込みプロセスが時間依存的であることを示しました。

略語

BBD：

Box-Benhnkenデザイン

DSC：

示差走査熱量測定

EE：

カプセル化の効率

FTIR：

フーリエ変換赤外分光法

GA：

グリチルレチン酸

MD：

平均直径

SPC：

大豆ホスファチジルコリン

TBA：

tert-ブチルアルコール

TEM：

透過型電子顕微鏡

XRD：

X線回折