ポリマーミセルによるウルソール酸デリバリー：溶解性向上と実証済み抗シワ効果

概要

ウルソール酸は化粧品において副成分としてのみ使用されてきました。本研究の目的は、ウルソール酸を有効成分としてヒトのシワ緩和に及ぼす効果を示し、難溶性ウルソール酸を化粧品の主成分として使用可能にするポリマーミセル処方を開発することです。ウルソール酸の溶解性を溶解助剤、界面活性剤、ポリマーで評価しました。ウルソール酸含有ポリマーミセルの粒子径と形状を電気泳動光散乱分光光度計と走査電子クライオ顕微鏡で評価しました。包接効率と経皮透過性をHPLCで測定しました。40°Cで3ヶ月保存したポリマーミセルの安定性を外観観察、粒子径測定、ウルソール酸含量測定で評価しました。最終製品アンプル形態のポリマーミセルを23名の女性被験者の目周りに8週間塗布しました。5つの皮膚パラメータを光学プロフィロメトリーで4週間ごとに8週間評価しました。さらに、専門家による皮膚の官能評価とヒト皮膚刺激性試験を実施しました。Capryol 90®とポロキサマーを用いて粒子径100 nm未満のウルソール酸ポリマーミセルを調製しました。ポリマーミセル中のウルソール酸の経皮透過率は、ウルソール酸を2種類の界面活性剤で分散させた他の溶液より高かったです。粒子径、色、ウルソール酸含量に有意な変化はなく、40°Cで3ヶ月保存しても相分離は起こりませんでした。8週間塗布後、皮膚刺激は生じず、光学プロフィロメトリーで評価した5パラメータすべてと官能評価スコアが有意に改善しました。本研究で調製したウルソール酸ポリマーミセルは安定であり、主有効成分としてヒトのシワ緩和に効果的であることを示しました。これらの知見に基づき、ウルソール酸ポリマーミセルが化粧品応用で広く使用できると期待されます。

はじめに

皮膚老化にはたるみ、薄化、シワが含まれます。感染、喫煙、紫外線、外傷、ホルモンバランスの乱れ、ストレス、およびエラスターゼやコラゲナーゼなどの加水分解酵素を含むプロオキシダントによって加速されます[1]。上記原因で生成される活性酸素種やフリーラジカルは隣接細胞を傷つけ、皮膚弾力性低下と薄化を招きます[2, 3]。特に紫外線は活性酸素種生成を誘発し、膜脂質、細胞タンパク質、DNAを損傷し、表情ジワ、そばかす、肝斑の発生を加速させます[1-4]。ウルソール酸は複数の植物種から抽出される天然由来の有効成分で、主要な医薬・化粧品成分として使用されています。リンゴやナシなどの果実にも含まれます[5]。ヒドロキシペンタサイクリックテルペンの一種で、オリーブ（Olea europaea）葉から初めて単離され、東アジアのスウェルチア（Eugenia jambos）やキバナオウギ（Gentiana lutea）など植物に広く分布します。プロコラーゲン（コラーゲン合成に重要）、セラミド、フィラグリンの合成促進、およびコラーゲンなどタンパク質を分解するMMP-1酵素の活性阻害により、抗老化機能を発揮します[5, 6]。これらの知見から、ウルソール酸はコラーゲン生成促進とコラーゲン分解防止の二重抗老化効果を持つと考えられます[7]。その結果、ウルソール酸は化粧品用の非常に有望な抗老化成分です。しかし、水への難溶性により、主成分としての使用は制限されており、乳化処方で少量が副成分としてのみ使用されてきました[8]。皮膚吸収に関連する物理化学的性質には融点、分子量、分配係数、親水性があります。融点は300°C以上で、高結晶性材料であることを示します。高結晶性材料は溶解により多くのエネルギーを必要とし、溶解性制限によりバイオアベイラビリティが低く、吸収が悪くなります[9]。また、高度に親水性または疎水性の化合物、高分子量化合物は皮膚透過しにくいことが知られています[10, 11]。このような分子の皮膚透過性改善に最もよく用いられる方法は、前駆体合成やコロイド薬物キャリアの使用です。この点で、リポソーム、エマルション、ポリマーミセルが活発に研究されています[12]。

ポリマーミセルは水溶液中でコア-シェル構造を形成する自己組織化ナノスケール凝集体です。ジブロックまたはトリブロック共重合体で作られることが多く、疎水性内部コアと親水性外部シェルを形成します[13, 14]。ポリマーミセルは、ブロック共重合体中の単量体の種類と比率によって特性が変わり、比較的低い臨界ミセル濃度を持つため、界面活性剤ミセルより物理的に安定と考えられています[15, 16]。

本研究では、ウルソール酸ポリマーミセルを調製し、その粒子径・形状、包接効率、経皮透過率を評価しました。この形態でのウルソール酸の物理的安定性を3ヶ月評価し、実際の化粧品処方でのヒト抗シワ効果も調査しました。

材料と方法

材料

ウルソール酸、ツイーン80、ツイーン20、ツイーン60はTCI（東京、日本）から購入。PEG 400、プルロニックF127、プルロニックF68はBASF（ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）から入手。プロピレングリコール、PEG 300、PEG 200は純正化学（東京、日本）から入手。TRANSCUTOL P、LABRASOL、LAUROGLYCOL FCC、LABRAFAC、Capryol® 90、Capryol™ PGMCはガテフォッセ（リヨン、フランス）から購入。EDTA-2Na（大jung化学金属、始興、韓国）、アラントイン（シグマアルドリッチ、セントルイス、米国）、ジプロピレングリコール（大jung化学金属、始興、韓国）、プロパンジオール（デュポンテート&ライルバイオプロダクツ、ラウドン、米国）、カルボマー（ルブリゾール、オハイオ、米国）、PEG/PPG/ポリブチレングリコール-8/5/3グリセリン（NOF、東京、日本）、ヒアルロン酸ナトリウム（TCI、東京、日本）、β-グルカン（SKバイオランド、天安、韓国）、フェノキシエタノール（大jung化学金属、始興、韓国）、カプリリルグリコール（J TWO K BIO、清州、韓国）、エチルヘキシルグリセリン（J TWO K BIO、清州、韓国）をウルソール酸含有化粧品調製に使用。HPLCグレードアセトニトリルはバーディック&ジャクソン（マスクゴン、米国）から入手。三重蒸留水を使用し、その他溶媒・試薬はEPおよびGRグレード。Crlori:SKH1-hr無毛雌マウスをオリエントバイオ（城南、韓国）から購入。

HPLC分析

ウルソール酸を島津LC-30シリーズHPLC（島津製作所、京都、日本）で分析。クロマシル100 C18 250 mm × 4.6 mm、5 μm分析カラム（テクノクロマ、バルセロナ、スペイン）を室温で使用。移動相はアセトニトリルと水（85:15、v/v）、流速1 mL/min、注入量10 μL。ウルソール酸をUV λ = 210 nmで分析。すべての測定を室温で実施[17]。

溶解性と処方最適化試験

定量したウルソール酸を溶解助剤に加え、60°Cで48時間攪拌し、超音波洗浄機で5分間超音波処理しました。懸濁液をユニバーサル320R遠心分離機（ヘティッヒ、トゥットリンゲン、ドイツ）で2000 rpmで遠心分離し、上清液を回収。0.45 μm PVDFメンブレンフィルター（ワットマン、ケント、英国）でろ過しました。ウルソール酸と溶解助剤の初期重量合計から残留固形分の重量を差し引いて、対応する溶解助剤中のウルソール酸溶解度を推定しました（表1）。

処方最適化試験をポロキサマー188、ポロキサマー407、ツイーン60、ツイーン80で実施しました。両親媒性ポリマーと界面活性剤の様々な比率を表2にまとめたとおり試しました。ウルソール酸とCapryol® 90をそれぞれ秤量し、60°C以上で加熱攪拌して透明溶液を得ました。表2のポリマー/界面活性剤を透明溶液に加え、60°C以上で透明になるまで攪拌。蒸留水に分散させました（図1）。得られた溶液を約48時間放置し、目視検査で最適処方を選択しました。表2の各処方の目視検査結果（沈殿、相分離、透明性、ゲル化の観察）を表3にまとめました。

ウルソール酸ポリマーミセルの調製

ウルソール酸ポリマーミセル（PMO）を、図1に示す方法で表2の処方GとHを用いて調製しました。PMO-GとPMO-Hを後続実験に用い、PMO-Hを臨床試験用化粧品に使用しました。

染色試験

処方GまたはHを水に分散させた際のポリマーミセル化を、透明性による目視観察で確認しました。PMO形成（PMO-GまたはPMO-H）は染色試験でも確認しました。メチレンブルーを、水とCapryol® 90の混合物、水、Capryol® 90、PMO-G、PMO-Hに加え、溶液の色を目視観察・撮影しました。

粒子径測定

ELS（電気泳動光散乱）法は、明確な電場中で粒子がランダムなブラウン運動と定向性電気泳動運動の両方を示すとき、時間関数としての粒子からの散乱強度変動を測定します。ELS法で粒子電気泳動移動度を測定し[18]、電気泳動光散乱分光光度計（ELS-Z、フォタル、大塚電子、日本）でPMO-GとPMO-Hの粒子径を評価しました。

走査電子クライオ顕微鏡（Cryo-SEM）分析

クライオ走査電子顕微鏡または走査電子クライオ顕微鏡（Cryo-SEM）は、コロイドポリマー懸濁液や分散液の微細構造やナノ構造の状態を、急速凍結と破砕による固定化後にイメージングする強力な技術です。破砕は-196°C（液体窒素の通常沸点、バルクおよび完全融合粒子のガラス転移温度よりはるかに低い）で行われ、検査されます。Cryo-SEM像は、氷を通過して伝播する破砕に対する粒子の多様な応答を明らかにします[19]。走査電子クライオ顕微鏡（Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM試料調製システム）でPMOの形状を観察しました。

包接効率

ウルソール酸ポリマーミセルの包接効率を評価しました。PMOを2000 rpmで15分遠心分離し、上清液を回収してHPLCで分析。包接効率を、PMO調製時に最初に添加したウルソール酸量（mg）に対するポリマーミセル内ウルソール酸量（mg）の割合として計算しました。

$$ \mathrm{包接効率}\ \left(\%\right)=\frac{\mathrm{ポリマーミセル内ウルソール酸量}\ \left(\mathrm{mg}\right)}{\mathrm{最初に添加したウルソール酸量}\ \left(\mathrm{mg}\right)}\times 100 $$

PMO-Hの安定性

PMO-Hの物理的安定性を、40°Cで3ヶ月保存して評価しました。色変化、相分離、沈殿の有無、濁度変化を目視評価。定期的に採取したPMO-H試料をHPLCで分析し残存ウルソール酸量を決定し、ELS-ZでPMO-H粒子径を測定。結果を図9に示します。

in vitro 経皮透過試験

フランツ拡散セルを用いたin vitro経皮透過試験で、ウルソール酸の経皮透過性向上を調査。PMO-G、PMO-H、ウルソール酸とツイーン80の混合物を蒸留水に分散させたもの、ウルソール酸とプロピレングリコールの混合物を蒸留水に分散させたもので実施。6週齢雌無毛マウスの皮膚を必要なサイズに切り出し使用。垂直フランツセルを用い、角層を上向きにして2室間に皮膚を固定。選択処方330 μLを皮膚上に塗布し、フランツセルをパラフィルムで覆いました。受容槽をPBS溶液（pH 7.4）とエタノールの9:1（v/v）で満たし、各採取時刻で新鮮なPBS溶液で補充。2、4、6、8、10、20、24時間でサンプルを採取しHPLCで分析。24時間後、皮膚上に残った余分な処方をキムワイプ（キンバリークラーク、NSW、オーストラリア）で除去。透過試験に用いた皮膚をPBSで洗浄し、皮膚内残留ウルソール酸をHPLCで測定。すべての透過実験を3反復で実施。

統計解析

実験を3回独立に繰り返し、結果を平均±SDで報告。独立t検定で統計解析を検証し、p < 0.05を統計的有意としました。

PMO-Hによるアンプル調製

臨床試験用にPMO-Hを試験製品として使用。PMO-H、精製水、EDTA-2Na、アラントイン、ジプロピレングリコール、プロパンジオール、カルボマー、PEG/PPG/ポリブチレングリコール-8/5/3グリセリンを加え、磁気攪拌機で10-15分攪拌し、さらに水酸化カリウムを加えて5-10分攪拌。成分が均質に混合したらヒアルロン酸ナトリウムとβ-グルカンを加えさらに2-5分攪拌、最後にフェノキシエタノール、プロパンジオール、カプリリルグリコール、エチルヘキシルグリセリンを加え2-5分攪拌。最終処方をアンプルに充填し試験製品としました。アンプルの気泡を真空乾燥オーブンで除去して試験使用。対照は試験製品と同法で調製し、ウルソール酸のみ除外しました。

ヒト適用試験

ヒト皮膚刺激性試験

PMO-H含有化粧品アンプルの皮膚パッチテストを、22-56歳の男女25名（ヒト皮膚刺激性試験への参加に同意）で実施。各試験物質を上腕に滴下しパッチで固定。パッチを24時間貼付し、剥離後30分、24時間、48時間で2名の専門家が国際接触皮膚炎研究グループ（ICDRG）基準に従い刺激度を観察しました。

シワ改善臨床試験

最終製品アンプル形態のウルソール酸含有ポリマーミセルを、30-65歳の女性被験者23名（目周りにシワがあり、参加同意、選択基準適合、除外基準非該当）の目周りに8週間塗布。二重盲検法を研究者と被験者の両方で実施。試験は8週間実施し、評価を4週間ごとに実施。二重盲検法とランダム割付を使用。試験製品と対照を同一被験者の左右どちらかにランダムに別々に塗布。5パラメータを光学プロフィロメトリー（Skin Visiometer SV 700、Courage + Khazaka electronic GmbH、ケルン、ドイツ）で4週間ごとに8週間評価——平均粗さ（R3）を主要評価項目、皮膚粗さ（R1）、最大粗さ（R2）、平滑度深さ（R4）、算術平均粗さ（R5）の4パラメータを副次評価項目としました。同一被験者の同一領域での5パラメータの経時的増減を測定し、試験製品と対照処理間で5パラメータの増減平均値を算出・比較。さらに専門家による皮膚の官能観察を実施。Janus 1 Mark II（PIE、水原、韓国）で目尻シワを撮影。官能評価スコアの判定基準を図S1に示し、官能結果を図13に提示。パラメータを対応のあるt検定で95%信頼度で比較・解析[20-25]。

結果と考察

溶解助剤、界面活性剤、ポリマーの決定

生体適合性溶解助剤、特に界面活性剤とポリマーにおけるウルソール酸溶解度を表1に示します。ウルソール酸は低親水性-疎水性バランス（HLB）の疎水性オイルに溶けやすい傾向があります。Capryol® 90は一般的なオイルよりわずかに高いHLB値を持ちます[26]。しかし、ウルソール酸はCapryol® 90に比較的高い溶解性を示します。また、Capryol® 90はミセルの内部コアとして容易に安定化できます[27]。Capryol® 90選定後、ウルソール酸ミセルのシェル部分用に複数種類の界面活性剤やポロキサマーをスクリーニングしました[27-30]。表2のウルソール酸ミセル組成は、蒸留水で希釈直後に透明だったものです。しかし、一部組成は不安定で、24時間以内に沈殿、相分離、ゲル化しました。沈殿、相分離、透明液体、ゲル状態の代表画像を図2に示します。各処方の最終状態を表3にまとめました。組成GとHは24時間後も透明なまま維持されました。組成Iは透明でしたが液体ではなくゲルでした。組成A-Dは24時間後に不透明になり沈殿しました。これらの結果から、組成GとHを更なる開発に選択しました。

ウルソール酸ポリマーミセルの特性

ウルソール酸ポリマーミセルの構造を染色試験で調べました。図3に、Capryol® 90と蒸留水の混合物、Capryol® 90、蒸留水、組成Gのポリマーミセル（PMO-G）、組成Hのポリマーミセル（PMO-H）にメチレンブルーを添加後の画像を示します。Capryol® 90と蒸留水の混合物では明確な相分離が生じました。Capryol® 90ではメチレンブルーの沈殿が観察されました。蒸留水はメチレンブルー添加後濃青色になりました。PMO-GとPMO-Hも青くなり、ポリマーミセルが油相内部コアと水相外部シェルで構成されることを示しました。すなわち、組成GとHの両親媒性ポリマーであるポロキサマー407が外部シェルとして働き、ウルソール酸を含むCapryol® 90内部コアをカプセル化してポリマーミセルを成功裏に形成します[31]。

粒子径、粒径分布、形状はミセル処方の物理的安定性予測の良い指標となります。PMO-Gの平均粒子径は80.4 nm、PMO-Hは57 nmでした（図4）。PMO-A、G、Hのヒストグラムを図5に示し、相状態による粒径分布の影響を比較しました。表3のとおり、PMO-Aは沈殿により不透明、PMO-GとHは透明です。PMO-Aの粒子径は100 nm超、PMO-AはPMO-GとHより広い粒径分布を示します（図5）。PMO-HはPMO-Gより狭い粒径分布を示し、化粧品に適した流動性を示します。

PMO-GとPMO-Hの包接効率は99-100%で、ほぼ100%のウルソール酸がPMO内部コアにカプセル化されていました（図6）。

PMO-GとPMO-Hの形状を走査電子クライオ顕微鏡（Cryo-SEM）で調べました。Cryo-SEMでPMO-GとPMO-H両方が球状ポリマーミセルであることが示されました。しかし、PMO-Hポリマーミセルの方がPMO-Gよりサイズと形状の面でより均一でした（図7）。

PMOのin vitro経皮透過試験

6週齢雌無毛マウスの皮膚を用い、皮膚内残留ウルソール酸総量と経時的な経皮透過ウルソール酸総量を測定しました。PMO-G、PMO-H、蒸留水に分散したウルソール酸とツイーン80の混合物（OTw）、蒸留水に分散したウルソール酸とプロピレングリコールの混合物（OPG）の4処方を、ウルソール酸の経皮透過効率で比較しました。24時間後の経皮透過総量は、PMO-Hで29.49 ± 4.00%、PMO-Gで21.39 ± 5.91%、OTwで13.66 ± 0.81%、OPGで5.90 ± 2.47%でした。図7に示すように、PMO-GとPMO-H両方でウルソール酸の初回検出が8時間で可能だったのに対し、OTwでは10時間、OPGでは20時間でした。皮膚内残留率は、PMO-Hで56.22 ± 13.50%、PMO-Gで36.74 ± 0.72%、OTwで27.44 ± 7.02%、OPGで26.28 ± 5.42%でした。PMO-Hが経皮透過量と皮膚内残留量の両方で最大でした（図8）。これらの結果は、PMOがミセルを形成しない処方より速く、より多く透過できることを示します。

液状ウルソール酸ポリマーミセルの安定性

特性評価とin vitro透過試験に基づき、PMO-Hを最終アンプル調製用に選択。アンプル調製前、PMO-Hの安定性を評価。安定性試験でPMO-Hをバイアルに入れ、40°C/75% RHの加速安定性条件で3ヶ月保存。沈殿、相分離、色変化、透明性を目視評価。その後HPLCでウルソール酸割合を測定し、粒子径変化も確認。経時的に安定性をチェック。PMO-Hは加速条件下で3ヶ月間、沈殿や相分離なく透明性を維持し、色も変化しませんでした。HPLC測定ウルソール酸割合と粒子径経時変化を図9に示します。ウルソール酸割合は98%以上を維持し、粒子径は49.6 ± 5 nmで3ヶ月間ほぼ一定でした。これらの結果は、PMO-Hが加速安定性条件下で3ヶ月間物理的・化学的に安定であることを示します。

臨床試験

ヒト刺激性試験

臨床試験前、22-56歳の健康な男女ボランティア25名でヒト刺激性試験を実施。試験製品を被験者上腕に24時間パッチ貼付し、剥離後30分、24時間、48時間で皮膚刺激指数を測定。PMO-H含有化粧品アンプル処方で、剥離後1時間および48時間で刺激は観察されませんでした。

臨床試験

目周りにシワのある30-65歳女性23名で臨床試験を実施（3名脱落除き20名完遂）。試験製品（PMO-Hアンプル）と対照を左右どちらかに別々に塗布し8週間継続。皮膚変化を5パラメータで評価——主要評価項目：平均粗さ（R3）、副次評価項目：皮膚粗さ（R1）、最大粗さ（R2）、平滑度深さ（R4）、算術平均粗さ（R5）。官能評価スコアをさらなる副次評価項目としました。結果を表4にまとめます。

主要評価項目R3は、試験製品使用4週間で0.673%減少し、8週間で統計的に有意に7.835%減少しました（p = 0.006）。対照塗布では、4週間で5.127%増加し、8週間で統計的に有意に9.971%増加しました（p = 0.010）。試験製品塗布領域と対照塗布領域のR3値差は8週間で統計的に有意（p = 0.000）でしたが、4週間では有意ではなく、被験者間変動が原因と考えられます（図10）。

副次評価項目R1の解析では、試験製品使用4週間で4.629%減少し、8週間で統計的に有意に9.973%減少しました（p = 0.017）。対照では4週間で8.037%増加、8週間で4.799%増加。試験製品と対照のR1値差は4週間では有意でなかったが8週間で有意（p = 0.024）。副次評価項目R2は試験製品で4週間1.048%減少、8週間5.803%減少。対照で4週間7.261%増加、8週間9.536%増加。R2値差は8週間で統計的有意（p = 0.016）だが4週間では有意でない。副次評価項目R4は試験製品で4週間8.594%有意減少（p = 0.039）、8週間9.747%減少。対照で4週間10.764%増加、8週間3.491%増加。興味深いことに、R4値差は4週間で統計的有意（p = 0.008）だが8週間では有意でない。副次評価項目R5は試験製品で4週間6.333%減少、8週間8.556%減少。R5値差は4週間でも8週間でも統計的有意でなかった。

さらなる副次評価項目である専門家によるシワ官能評価の解析では、官能評価スコアが試験製品使用4週間で2.917%減少し、8週間で統計的に有意に8.333%減少しました（p = 0.034）。対照では4週間で1.667%増加、8週間で4.167%増加。試験製品と対照の官能評価スコア差は8週間で統計的有意（p = 0.046）だが4週間では有意でない。

要約すると、目周りシワ領域の解析で、試験製品と対照の主要評価項目R3値差が8週間で統計的に有意でした。副次評価項目では、すべての値が試験製品使用で減少し、対照使用で増加しました。R4値差が4週間で統計的有意、R1とR2値差が8週間で統計的有意でした（図11）。専門家による官能評価では、すべての平均官能評価スコアが試験製品処理で4週間と8週間後に対照比で減少しました（表5）。試験製品と対照の官能評価スコア差は8週間で統計的有意（図12）。全体として、すべての評価項目によると、PMO-Hを主成分とする化粧品処方は8週間使用でシワ改善に寄与することがわかりました（図13）。

結論

界面活性剤は化粧品で難溶性物質の溶解性向上に常用される賦形剤です。注意点は製品中の配合量です。沈殿なく難溶性物質を溶解する十分量を添加する必要がありますが、安全性の観点から最小限にすべきです。ミセル処方がこの問題の解決策となり得ます。本研究で開発したウルソール酸ポリマーミセルは、最小限の界面活性剤量でウルソール酸溶解性を改善し、経皮透過性を向上させます。Capryol 90とポロキサマーを用いて安定なウルソール酸ポリマーミセルを開発しました。本研究で開発したウルソール酸ポリマーミセルは安定で、40°C、3ヶ月後も沈殿、相分離、劣化を示しませんでした。臨床試験で、主有効成分としてポリマーミセル処方中のウルソール酸がヒトシワ緩和に効果的であることが示されました。これらの知見に基づき、水に難溶性で天然形態では主成分として皮膚シワ緩和に使用できないウルソール酸が、適用可能なポリマーミセルに処方できることが結論付けられます。さらに、本研究で開発したウルソール酸ポリマーミセルがヒトシワ緩和に非常に有用で、化粧品応用に広く適用可能になることが期待されます。

データおよび材料の入手可能性

該当なし

略語

PMO:

ウルソール酸ポリマーミセル

PEG:

ポリエチレングリコール

TRANSCUTOL P:

高純度ジエチレングリコールモノエチルエーテル

LABRASOL:

PEG-8カプリル/カプリン酸グリセリド

LAUROGLYCOL FCC:

プロピレングリコールモノラウリン酸エステル（タイプI、モノエステル>45%）

LABRAFAC:

カプリル/カプリン酸トリグリセリド

Capryol® 90:

プロピレングリコールモノカプリル酸エステル（タイプII、モノエステル>90%）

Capryol™ PGMC:

プロピレングリコールモノカプリル酸エステル（タイプI、モノエステル>55%）

EDTA:

エチレンジアミン四酢酸

ELS:

電気泳動光散乱