ダカルバジンとオールトランスレチノイン酸を脂質ナノ粒子で共送達し悪性黒色腫に対する抗腫瘍効果を増強

要旨

悪性黒色腫は死亡率80%を占める高侵襲性皮膚がんであり、転移性黒色腫患者の全体中央生存期間はわずか6-9ヶ月である。単一ナノキャリアへの二剤同時投与による併用療法が、がん撲滅に優雅かつ効果的であることが実証されている。本研究では、悪性黒色腫の第一選択化学療法薬としてFDA承認済みのダカルバジン（DBZ）と、有望な抗がん剤であるオールトランスレチノイン酸（ATRA）を脂質ナノ製剤（RD-LNF）に共包接し、悪性黒色腫の新治療戦略として評価した。両薬剤を脂質ナノ製剤にカプセル化し、時間経過に伴う制御放出を実証した。DBZとATRAの同時送達が濃度依存的に細胞増殖を効果的に抑制することを示した。併用ナノ粒子はB16F10黒色腫細胞のコロニー形成能を有意に低下させた。フローサイトメトリー解析では、RD-LNFがアポトーシス細胞割合を増加させ、細胞周期進行と細胞遊走を有意に阻害した。これら結果は、RD-LNFが高効力で悪性黒色腫治療に有望な可能性を秘めていることを示唆する。

序論

悪性黒色腫はヒト皮膚に優発する侵襲性悪性腫瘍の一つである[1]。黒色腫は全皮膚がんの4%を占めるが、皮膚がん死亡率の80%を占め、途上国および発展途上国で懸念が高まっている[2, 3]。黒色腫は脳、心臓、肺など身体各部へ転移しやすく、最も侵襲的な悪性腫瘍の一つである[4]。早期診断時は外科的切除が潜在的治療選択肢だが、手術が黒色腫からの完全回復を保証するわけではない[5]。また、この悪性腫瘍の放射状増殖期は、化学療法や放射線療法を含む大半の他治療選択肢に耐性となる[6]。具体的には、ペプチド受容体が黒色腫細胞表面で過剰発現しており魅力的な標的となる。ソマトスタチン受容体サブタイプ2（SSTR2）が黒色腫細胞で高発現することが示されている[7]。

ダカルバジン（DBZ）またはジメチル-トリアゼノ-イミダゾールカルボキサミド（DTIC）は、DNAアルキル化剤としてFDA承認された最初かつ第一選択の化学療法薬である[8]。DBZは強力なアルキル化剤で、がん細胞のDNAや核物質にアルキル基を付加し細胞死を誘導する[9]。強力な作用にもかかわらず、DBZは水溶性が低く、血中半減期が短い（41分）ため、黒色腫治療における治療効果が減弱する[10]。また、10-25%の低い奏効率、5%未満の完全寛解率が観察され、単剤療法の限界が明らか[11, 12]。したがって、DBZ治療効力改善の代替戦略開発が急務である。

単一投与での複数治療薬共送達は、単独治療薬より効果的であることが証明されている[13]。単一キャリアシステムでの治療薬共送達は、相乗活性、類似薬物動態特性、高抗がん効力を付与する[14]。オールトランスレチノイン酸（ATRA）は複数のがん治療に用いられる有望な抗がん剤[15]。ATRAはがん細胞核内レチノイン酸受容体に結合し、増殖、分化阻害、最終的な細胞死を誘導することで治療効果を発揮[16]。他化学療法薬と異なり、ATRAは心毒性や骨髄形成不全など副作用を生じない。ATRAは適切な化学療法薬と併用で抗がん効力を増強することが報告[17]。また、親脂性ATRAも水溶性が低く迅速な全身クリアランスを示すため、安定送達システムが必要[17]。

ナノ粒子送達システムは、カプセル化治療薬を標的腫瘍組織で放出し、増強透過性保持（EPR）効果により全身循環でのオフターゲット効果を回避することで、治療効力を改善することが示されている[18, 19]。固体脂質ナノ粒子（SLN）は、安定性向上、制御薬物放出、高担持効率、調製・スケールアップ容易など顕著な特徴により、リポソームやミセル等既存キャリアの代替と見なされる[20]。SLNの薬物送達キャリアとしての重要な側面は、GRASステータスの脂質安全性プロファイル、良好な耐容性、生理的脂質であること[21]。薬物の脂質核への安定組み込みは水溶性改善、薬物動態プロファイル改善、全身循環での生理的安定性延長をもたらす[22]。

本研究では、DBZとATRAを脂質ナノ製剤で共送達する併用治療の有望戦略を、黒色腫悪性腫瘍に対して提案する。DBZは脂質コアに、ATRAはナノ粒子構造成分としてロードされることを想定。物理化学的特性、細胞取り込み、インビトロ細胞毒性を検討。さらに、アポトーシスアッセイ、細胞周期解析、コロニー形成、遊走解析で抗がん効果を評価した。

材料と方法

DBZ/ATRA負荷脂質ナノ製剤の調製

薬物負荷脂質ナノ粒子を超音波法で調製。簡潔に述べると、DBZ 10 mgとATRA 10 mgを、卵黄レシチン（PC）50 mgとDSPE-メチル(ポリエチレングリコール)-2000（mPEG₂₀₀₀）2 mgを含むクロロホルム溶液2 mLに溶解。有機溶媒をアルゴンガス暴露で20分乾燥。乾燥薬物+脂質混合物にトリミリスチン（Tm）80 mgを添加し、65℃で1時間インキュベート。この油性混合物に4%ポロキサマー溶液5 mLを添加し、即座に80 Wで6分プローブ超音波処理。結果エマルションを氷で30分冷却。ナノ粒子をAmicon Ultra 0.5遠心フィルター（3 kDaカットオフ；Merck、Germany）で12000×g、20分遠心分離。濾過液中の遊離DBZとATRA量をHPLC法で評価し、担持効率と担持容量を算出。Waters HPLCシステム（Waters 1525バイナリポンプ、Waters 2487 UV検出器、Waters 2475蛍光検出器、1500カラムヒーター、Symmetry C18カラム）を薬物分析に使用。ATRA用移動相はアセトニトリルとトリフルオロ酢酸を90/10 v/v比、流速1 mL/min、348 nm検出。DBZ用はアセトニトリルと0.05 Mリン酸二水素ナトリウムを30/70 v/v比、0.5% TEA含有、pH 3.7、流速1 mL/min。

粒子径と形態解析

併用ナノ粒子の粒子径分布をMalvern Zetasizer Nano ZS90（He-Neレーザー633 nm）で評価。全試料を蒸留水で希釈し、24℃で3回測定。ナノ粒子形態を透過型電子顕微鏡（TEM；JEOL JEM200CX、120 kV）で評価。希釈粒子を2%ホスホタングステン酸で染色、乾燥後TEM観察。

薬物負荷ナノ製剤のインビトロ薬物放出

カプセル化薬物放出を透析法で評価。ATRA 1 mgとDBZ 1 mg相当含む薬物負荷ナノ粒子2 mLを透析膜（Spectra/Por、MWCO 3.5 kDa）に封入。透析チューブを放出バッファー25 mLに入れ、37℃で100 rpm回転。所定時間間隔で72時間まで1 mL試料を採取し、同量新鮮バッファーで置換。DBZとATRA量を上記HPLC法で評価。

細胞培養と細胞取り込み解析

マウス皮膚黒色腫細胞（B16F10）を中国細胞株リソース基盤（北京、中国）から購入。10% FBSと1%抗生物質混合物含有RPMI-1640培地で培養。培地を2日ごとに交換し、90%コンフルエント後に継代。細胞取り込み解析では、B16F10細胞を6ウェルプレートで24時間播種。ナノ粒子にクマリン-6を蛍光トラッカーとして負荷。古培地を除去し、クマリン-6負荷脂質ナノ粒子含有新鮮培地で置換し、1-3時間逆順でインキュベート。細胞を洗浄しセルスクレーパーで掻き取り。1200 rpm、5分遠心分離し、細胞ペレットを冷PBS 1 mLで再懸濁。AccuriTM C6フローサイトメーター（BD社、USA）で評価。

インビトロ細胞毒性アッセイ

フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNFのB16F10細胞への細胞毒性をMTTアッセイで評価。細胞（1 × 10⁴/well）を96ウェルプレートで24時間播種。まずフリーATRAとDBZを異なる濃度で処理し、黒色腫細胞への抗がん効果を検証。次に、フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNFを固定濃度25 μg/mLと50 μg/mLで処理。24時間インキュベート後、培地を慎重に除去しPBSで2回洗浄。最後に100 μLの5 mg/mL MTT溶液を添加し4時間インキュベート。培地を慎重に除去し、100 μLイソプロパノールを添加し振とう条件下で15分インキュベート。溶解ホルマザン結晶をマイクロプレートリーダーで570 nm測定。非処理細胞をコントロールとし、コントロール細胞生存率ベースで計算。

アポトーシスアッセイ - フローサイトメトリー

フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNFのB16F10細胞へのアポトーシス効果を、PEアネキシンVと7AADベースアポトーシスキット染色で評価。細胞を12ウェルプレート、2 × 10⁵ cells/well密度で播種し24時間培養。フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNF製剤を25 μg/mL相当で処理、未処理細胞をコントロール。24時間曝露後、メーカープロトコルで染色。AccuriTM C6フローサイトメーターでPEと7AAD発現を測定、最小10,000イベント取得。PE陽性7AAD陰性を初期アポトーシス、PE陽性7AAD陽性を後期アポトーシスとした。

細胞周期解析 - フローサイトメトリー

細胞を12ウェルプレート、2 × 10⁵ cells/well密度で播種し24時間培養。フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNF製剤を25 μg/mL相当で処理、未処理細胞をコントロール。24時間後、トリプシン化で細胞を回収・洗浄し、70%エタノールで4℃、2時間固定。リボヌクレアーゼ処理でRNA汚染除去。プロピジウムヨウ化物（PI）で37℃、30分染色。PI染色細胞蛍光をAccuriTM C6フローサイトメーターで測定。細胞周期をsubG1、G1、S、G2/M期に分類。

コロニー形成アッセイ

細胞を12ウェルプレート、2 × 10⁵ cells/well密度で播種し24時間培養。フリーATRA、DBZ、D-LNF、RD-LNF製剤を25 μg/mL相当で処理。処理細胞をトリプシン化、洗浄、セルカウンターで計数。6ウェルプレートに1500 cells/well密度で播種。37℃環境下で12日間培養しコロニー可視化まで継続。PBS洗浄後、メタノール:酢酸:水（1:1:8）で10分固定、0.1%クリスタルバイオレットで45分染色。光学顕微鏡で観察。

細胞遊走アッセイ

8 μmポアサイズの12ウェルトランスウェルチャンバーを使用。上チャンバーに無血清培地200 μLで5 × 10⁴ cells/well播種、下チャンバーに10% FBS含有培地500 μL添加。24時間後、下側膜表面に移動した細胞を固定、0.5%クリスタルバイオレットで染色。ランダム選択5視野で光学顕微鏡下計数、平均値を記録し解析。

統計解析

データを平均±SDで表示、別途記載ない限り3回繰り返し実施。2群比較に対応なしt検定、多群比較に一元配置分散分析（ANOVA）とTukey多重比較検定。GraphPad Prismソフトウェア使用、p < 0.05を有意差とした。

結果と考察

DBZ/ATRA負荷脂質ナノ製剤の調製とキャラクタリゼーション

黒色腫治療は依然として主要課題であり、化学療法、放射線療法、外科的切除など標準治療は固形腫瘍にのみ有効で予後不良。FDA承認薬パクリタキセル等も患者生存と治癒への全体的インパクト改善に失敗。ダカルバジン（DBZ）はFDA承認第一選択化学療法薬だが、物理化学的特性不良により10-25%の低奏効率。これら課題対応のため、ATRAとDBZを脂質ナノ製剤（RD-LNF）で併用する新規治療戦略を開発（図1）。二つの治療成分併用が黒色腫悪性腫瘍で抗腫瘍効力増強をもたらすと仮定。ATRAは抗がん特性を示しつつ全身環境で副作用を生じない点に留意[23]。DBZは疎水性のため、疎水性薬物を脂質コアに安定組み込み、ATRAをナノ粒子構造成分としてロードする脂質ナノ製剤を設計。治療成分担持脂質ナノ粒子が体内深部腫瘍へ送達を支援。DBZとATRA担持効率はそれぞれ91.2 ± 1.25%、95.8 ± 1.14%。RD-LNF中DBZとATRA担持容量はそれぞれ7.07 ± 0.65% w/w、7.48 ± 1.05% w/w。D-LNF粒子径121.5 ± 1.65 nm、ポリ分散指数（PDI）0.134、ゼータ電位−23.5 ± 0.85 mV。RD-LNF粒子径138.2 ± 1.28 nm、PDI 0.159、ゼータ電位−25.4 ± 0.58 mV。全体粒子径増大は主にATRA構造的ロード由来だが、最終RD-LNFサイズ150 nm未満でEPR効果により悪性黒色腫腫瘍へ優先蓄積可能。親水性PEG存在が粒子凝集防止、網内系（RES）取り込み低減、体内全身性能改善。−25 mV付近表面電荷が優れた保存安定性付与。TEMで粒子形態観察（図2）。D-LNFとRD-LNFとも完全球形で銅グリッド上均一分布。D-LNFとRD-LNFサイズ差はDLS観察と一致。粒子デブリ、微小粒子、凝集欠如が調製プロセス成功示唆。

D-LNFとRD-LNFの安定性解析とインビトロ薬物放出

RD-LNFはpH 7.4（PBS）と血清（10% FBS）両条件で優れた安定性示す（図3a）。全研究期間で粒子径に有意増大なし、ナノ粒子安定性示唆。タイムリーな薬物放出能が薬物負荷ナノ粒子システム効果決定。DBZとATRAのD-LNFとRD-LNFからの放出キネティクスをリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）で実施。図3b示す通り、両ナノ粒子システムからバースト放出や相分離放出観察されず、ナノ粒子表面でなくコアへの安定ロード示唆。D-LNFとRD-LNFからのDBZ放出に有意差なし、ATRA存在が薬物放出パターンを遅延・変化させないこと示唆。RD-LNFからのDBZ放出にわずかな遅延は、脂質構造内ATRAによる経路長増大起因の可能性。興味深いことに、RD-LNFキャリアシステムでATRA放出がDBZより有意に遅延。有意差は24時間後から72時間まで出現、主にATRA極端な疎水性と構造成分であること起因。全体として、バースト放出なしと治療成分の制御放出が黒色腫治療に有益。

インビトロ細胞取り込み

ナノ粒子の高いまたは増強された細胞取り込みががん細胞治療効力決定。B16F10がん細胞でのRD-LNF細胞取り込み実施、クマリン-6を蛍光トラッカー使用。図4示す通り、ナノ粒子インキュベート1時間後顕著な内部化観察、3時間まで一貫して取り込み増加。脂質ナノ製剤顕著取り込みは脂質ベースキャリアシステムの高細胞取り込みと一致。受動拡散とエンドサイトーシスベース機構が高取り込み原因と推測。エンドサイトーシス後ナノ粒子はライソソーム到達し、カプセル化薬物が遊離し薬理作用発現。

インビトロ細胞毒性アッセイ

各製剤処理後B16F10細胞でMTTアッセイ実施、個別治療薬抗がん効果評価（図5a）。まずフリーDBZとATRA個別細胞毒性評価。DBZは黒色腫細胞で濃度依存的細胞毒性示す一方、ATRAはB16F10細胞で有意に高い細胞毒性示す。100 μg/mLでDBZ約45%細胞生存率対ATRA約22%、ATRA優れた治療効力示唆。DBZとATRA共送達ががん進行阻害可能性証明のため、DBZ+ATRA負荷脂質ナノ製剤（RD-LNF）を黒色腫細胞処理。単一薬物DBZ負荷脂質ナノ製剤（D-LNF）を参照群とし、ATRA相乗効力強調（図5b）。予想通り、固定濃度25 μg/mLでATRAはDBZよりわずかに低い細胞生存率、ナノ粒子ベースD-LNFはDBZ抗がん効果改善せず依然非効果的。予想通り、RD-LNFが有意に低い細胞生存率と高い抗がん効果示し、二成分の黒色腫細胞死への明らかな相乗治療効果示唆。RD-LNFが他全処理群より有意に高い抗がん効果示す。ナノキャリアシステムからのDBZ緩徐持続放出とATRA緩徐放出が相乗治療効果寄与と推測。本研究ではDBZが主化学療法薬、ATRAは脂質ナノ粒子構造成分として採用、別途R-LNF群未設置。裸ATRAとDBZのがん細胞抗がん効果検討。また、ATRA抗がん効果の既発表報告多数、ATRAをカプセル化治療薬抗がん効力を相乗的に改善する構造成分として使用。

コロニー形成アッセイ

黒色腫細胞腫瘍形成可能性評価のためコロニー形成アッセイ実施。フリーDBZとATRAはコロニー形成阻害に限定的役割、同様にD-LNFもコロニー形成制御無効（図6）。予想通り、DBZ+ATRA併用が個別フリー薬剤や単一薬物負荷ナノ粒子と比較し、コロニー形成阻害で有意な増強結果。コロニー形成アッセイがRD-LNF優れた抗がん効力を再確認。

インビトロアポトーシスアッセイと細胞周期解析

D-LNFとRD-LNF処理後B16F10細胞アポトーシス誘導を、アネキシンV-FITC/PI混合染色後フローサイトメトリーで解析（図7a）。ATRAとDBZは10-12%アポトーシスのみ誘導、大半細胞無傷。D-LNF処理後初期アポトーシス細胞わずか増加、キャリア効果示唆。重要なことに、RD-LNFが後期アポトーシスと初期アポトーシス両方でより多くの割合でアポトーシス細胞誘導、併用ナノ粒子優れた抗がん効力示唆。RD-LNFで後期アポトーシス細胞21.5%増加、初期アポトーシス細胞18.3%増加、生存細胞割合95%から52%へ減少、DBZ+ATRA併用ががん細胞アポトーシス寄与しB16F10黒色腫細胞増殖抑制可能示唆。アポトーシス効果は細胞周期解析でさらに確認。DBZとATRAはsub-G0集団わずか増加、D-LNFは個別フリー薬より相対的に高いsub-G0集団（図7b）。注目すべきは、RD-LNF処理黒色腫細胞で顕著なsub-G0集団増加観察、がん細胞顕著アポトーシス示唆。DBZがp21、カスパーゼ-3、切断PARP発現レベル上昇させp53安定化通じて細胞アポトーシス促進、p53誘導が細胞周期進行阻害すること知られる[24, 25]。DBZ+ATRA併用がアポトーシス機構増強しがん細胞細胞周期進行停止、抗がん効力発揮期待。

併用ナノ粒子の細胞遊走への影響

トランスウェル膜通じて細胞遊走解析、クリスタルバイオレット染色で遊走細胞観察（図8）。24時間後、コントロール細胞ほぼ完全ながん細胞遊走達成。ATRAはDBZ処理細胞より相対的に遊走阻害。D-LNFも遊走への顕著な阻害効果示す。しかし、最も顕著な遊走阻害効果はRD-LNF処理B16F10黒色腫細胞で観察。非処理コントロール細胞比で多様な遊走減少観察。これら結果は、RD-LNFが異常悪性細胞増殖潜在的に減少させ、遊走効率的に抑制すること明確に示す。