エモジン担持ステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖ナノミセル：設計、特性評価、抗腫瘍活性

概要

本研究の目的は、エモジン担持ステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖（CSO-SA/EMO）を調製・特性評価し、そのin vitro抗腫瘍活性を評価することである。本研究では、ステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖を担体として用い、その物理化学的特性を様々な方法で決定した。細胞取り込み挙動をFITC標識ステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖で検討。CSO-SA/EMOを超音波処理と透析で調製。粒子サイズ、表面電位、包接効率、薬物放出挙動をin vitroで研究。CSO-SA/EMOの胃癌細胞への影響をMTTアッセイとフローサイトメトリーで調査。結果、CSO-SA/EMOの粒子サイズはステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖より大きく、電位は小さかった。MGC803とBGC823細胞への12時間ミセル取り込みは十分で、ミセルはマウス病変部位に豊富に蓄積し、良好な受動的EPR標的化を達成。MTTと細胞周期停止アッセイで、CSO-SA/EMOが遊離エモジンと比較してMGC803とBGC823細胞への抗腫瘍活性を有意に増強することを示した。腫瘍体積、ヘマトキシリン・エオシン染色、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）アッセイで、CSO-SA/EMOがin vivoで腫瘍組織に有意な抗腫瘍効果を持つことを証明。結論として、超音波-透析法はCSO-SA/EMO調製のシンプルで効果的な方法を提供。ミセルシステムによるエモジン送達がその抗腫瘍効果を効果的に改善した。

はじめに

エモジン（EMO）は、大黄、虎杖、何首烏などの伝統的漢方薬から主に抽出される天然アントラキノン誘導体である。伝統中国医学（TCM）は、低毒性、少ない副作用、低コストのため臨床研究で広く用いられている[1]。

研究により、EMOは免疫抑制、抗咳嗽、抗高血圧、抗炎症、抗菌、抗癌活性など広範な薬理活性を持つことが示されている。EMOは癌細胞の増殖を抑制することが見つかっており[2,3,4]、関連遺伝子を制御して腫瘍細胞アポトーシス、腫瘍形成、細胞増殖、浸潤、転移を調節する[5,6,7,8,9]。EMOはヒト結腸腺癌細胞、肝癌細胞、リンパ性白血病細胞[10]、ヒト舌癌SCC-4[11]など多様な癌細胞を抑制できる。EMOは胃癌、乳癌、前立腺癌の腫瘍細胞増殖を抑制できる[7, 12]。しかし、EMOは正常ヒト歯肉線維芽細胞[13]、ヒト気管支上皮細胞[14]、ヒト乳腺細胞[15]などの正常細胞には細胞毒性を示さない。これらはEMOが正常細胞と比較して腫瘍細胞に対して選択的細胞毒性を示すことを示している。

キトサンは天然多糖類で、キチンの脱アセチル化形態である。この天然高分子は優れた水溶性、生物機能性、血液適合性、微生物分解性を持ち、様々な生物医学応用で知られている。我々は高分子量キトサン（450kDa）を酸性条件下でキトサナーゼを用いて分解し、低分子量キトサンオリゴ糖（CSO、18kDa）を得た。CSOは細胞膜を強く透過でき[16]、ステアリン酸（SA）は糖蛋白経路で核内に入れる。カルボジイミド（EDC）をカップリング試薬として用い、CSOをSAで疎水性修飾し、両親媒性ステアリン酸-グラフト-キトサンオリゴ糖（CSO-SA）を合成した。

EMOは広範な生物活性を持つが、そのアントラキノン構造は水に難溶性である。治療薬は血流で輸送されるため、溶解度は吸収と分布に直接影響する。CSO-SAグラフトは水溶液中で自己集合し、内部が疎水性、外部が親水性のナノミセルを形成。超音波プローブでナノミセルを凝集状態から分散させた。EMOとCSOは共に疎水性であるため、EMOはミセル中心にカプセル化された。

CSO-SAには分子量、構造、疎水性を要求するいくつかのモデル薬物が適用されている。既存研究にはクルクミン[17]、ドキソルビシン[18]、ラミブジンステアレート[19]、オキサリプラチン[20]があり、抗腫瘍効果を有意に改善できる。我々はCSO-SA/EMOの最適担持条件を探求。CSO-SA/EMOはより高い溶解度と利用効率を持つ新しい剤形を創出。CSO-SA/EMOはモデル薬物や担体の選択、ミセルの臨床応用へのアイデアを提供できる。

実験材料と方法

実験材料

BALB/C+/nu雄ヌードマウスを浙江大学実験動物センターから入手。低分化胃癌細胞株MGC803とBGC823をATCC細胞バンクから購入。RPMI-1640培地とFBSを杭州ホリーリーフバイオテクノロジーから入手。EMO、MTT、FITC、Hoechst 33342、DiR、トリニトロベンゼンスルホン酸、ピレンをSigma Aldrichから供給。浙江大学からCSO-SAを提供。その他試薬はARグレードを購入。

CSO-SAのCMCと¹H NMRスペクトルの決定

本報告では、ピレンを蛍光プローブとして用い、蛍光分光光度法でCSO-SAの臨界ミセル濃度（CMC）を決定。様々な濃度のCSO-SA溶液をピレンアセトン溶液に添加後、アセトンを一晩蒸発。CSO-SA異濃度溶液中のピレンの発光スペクトルとピーク値を蛍光分光光度法で分析。スペクトルの第1ピーク（I₁=374nm）と第3ピーク（I₃=385nm）を記録。対数濃度（Log C）を横軸、I₁/I₃を縦軸としてプロットし、高分子ミセルのCMCを計算。

CSOとCSO-SAを10mg/ml濃度でD₂Oに溶解。¹H NMRスペクトルを記録し、CSOとCSO-SAの特性ピークを比較・分析。

アミノ基置換度の検出

アミノ基置換度（SD%）をトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）法で検出。

CSOとCSO-SAの異濃度溶液を調製後、4% NaHCO₃と0.1% TNBSを順次添加。37℃水浴で2時間インキュベート後、2mol/L塩酸を添加。30分間超音波処理後、344nmで紫外可視分光光度法で吸光度測定。標準曲線を描き、CSO-SAサンプルのSD%を計算。

CSO-SA粒子サイズと電位

1.0mg/ml CSO-SA溶液を調製し、超音波細胞破砕プローブでミセルを完全分散。粒子サイズと表面電位を粒子サイズ・表面電位アナライザーで決定。

CSO-SAの細胞取り込み

FITCとCSO-SA溶液を混合、一晩攪拌、透析バッグに移す。非反応性FITCと絶対エタノールを脱イオン水で24時間透析除去。最終的に濃度1.0mg/mLのFITC標識CSO-SA（FITC-CSO-SA）溶液を得た。

MGC803とBGC823細胞を標的細胞としてCSO-SAの細胞取り込みを検討。細胞増殖速度に基づき、24ウェルプレートに播種し一晩培養し完全付着まで待機。設定時間点で80μLのFITC-CSO-SA溶液を添加。10μLのHoechst 33342（1mg/mL）で15分間インキュベートし細胞核を染色。レーザー走査型共焦点顕微鏡でFITC-CSO-SAによるCSO-SA取り込みを検出。

CSO-SAのin vivo分布

CSO-SAのin vivo分布をDiR蛍光染料染色で決定。CSO-SA/DiR溶液を透析で調製。

6週齢雄ヌードマウスを実験モデルとして使用。ヌードマウスに1×10⁸/mL MGC803細胞を皮下接種。腫瘍細胞体積約200mm³でCSO-SA/DiRを尾静脈投与。設定時間点でマウスを麻酔。小動物生体イメージャー（波長範囲580-700nm、露光時間1000ms）でCSO-SA/DiRの経時的in vivo分布を記録。

HPLCによるEMO濃度検出

EMO濃度をHPLCで決定。EMOをEclipse XDB-C18充填カラム（4.6×250mm、5μm）、保護カラム（4.6×10mm、5μm）に適用。カラム温度30℃、流量1.0ml/min、検出波長254nm、注入量20μL。移動相はメタノール/0.1%リン酸（85:15、v/v）。EMO濃度を横軸、ピーク面積を縦軸としてプロット。EMO標準曲線を描き最適直線範囲を決定。全HPLC注入サンプルを0.45μm有機フィルターで濾過しカラムを保護。

CSO-SA/EMOの調製

本研究では、超音波プローブでEMOをカプセル化。初期処方比10%（EMO:CSO-SA、w/w）を出発点として使用。EMO溶液を氷冷下でミセル溶液に滴下添加。超音波プローブを20サイクル（400W、作業2秒、停止3秒）適用。

薬物担持ミセルを透析バッグ（MWCO、3.5kDa）に移し、脱イオン水で24時間透析して溶媒からエタノールを除去。透析液を遠心分離して遊離EMOを除去し、純粋なCSO-SA/EMOを得た。

CSO-SA/EMOの特性（粒子径、電位、TEM、EE%）

CSO-SA/EMOの粒子サイズと表面電位を粒子サイズ・表面電位アナライザーで測定。

0.1mg/ml CSO-SA/EMO溶液をカーボン膜被覆銅線に滴下、2%ホスホタングステン酸で染色し乾燥。透過電子顕微鏡でCSO-SA/EMOの形態と粒子サイズを観察。

CSO-SA/EMOの包接効率（EE%）と薬物担持量（DL%）を有機溶媒抽出とHPLCで検出。CSO-SA/EMOミセル溶液200μLに1.8mlメタノールを添加しミセルを分散・薬物抽出。EMO濃度をC_EMOとして測定。別途400μL CSO-SA/EMOミセル溶液を超遠心チューブに入れ遠心分離（12,000rpm、5分）し上清を得る。EE%とDL%を以下の式で計算：

EE% = (10×C_EMO - C) × V / M_EMO × 100%

DL% = (10×C_EMO - C) × V / [(10×C_EMO - C) × V + M_CSO-SA] × 100%

ここでC_EMOはミセル内EMO濃度、Cは超遠心後の薬物担持ミセルのEMO濃度、Vは透析対象薬物担持ミセル体積、M_EMOは薬物担持時投与EMO量、M_CSO-SAはCSO-SA質量。

In vitro薬物放出評価

CSO-SA/EMOからの薬物放出を、放出培地としてPBS（pH 7.2）を用いて調査。薬物担持ミセル溶液1mlを両端密封した3.5kDa透析バッグに入れ、適切な放出培地を含むチューブに配置。透析バッグを37℃水平恒温振とう機に配置。設定時間点でサンプル採取し、同量の新鮮な放出培地で置換。サンプル中のEMO含量をHPLCで決定し、EMO累積放出量を計算。

CSO-SA/EMOの細胞毒性

MTTアッセイでCSO-SA/EMO、CSO-SA、EMO処理胃癌細胞の生存率を検出。細胞を約10⁵/ml濃度で96ウェルプレートに播種。CSO-SA/EMO、CSO-SA、EMOを異なる濃度で添加。異なる期間インキュベート後、20μL MTT作業液添加。4時間インキュベート後、200μL DMSO添加し、570nmでの溶液光学密度（OD）をマイクロプレートリーダーで測定。

CSO-SA/EMOの細胞周期への影響

2細胞株を10⁵/mL密度で6ウェルプレートに播種。12時間培養後、CSO-SA、CSO-SA/EMO、EMOを添加し24時間インキュベート。細胞を消化、回収、洗浄。各細胞サンプルに500μL PI染色液添加、細胞ペレットをゆっくり再懸濁、37℃暗所で30分インキュベート。励起波長488nmでフローサイトメーターで赤色蛍光検出。FlowJoソフトウェアでDNA含量解析。

In vivoおよび組織学的解析によるCSO-SA/EMOの抗腫瘍効果評価

動物実験を浙江大学動物ケア・使用委員会ガイドラインに従い実施。MGC803細胞（1×10⁶）を5-6週齢雄ヌードマウス右前側腹に皮下接種。腫瘍直径約5mmまで増殖許容。その時点でマウスを対照群、EMO注射群、CSO-SA/EMO注射群に無作為分割、各群3匹。全マウスに関連試薬を尾静脈から1日1回、2週間静脈注射。電子ノギスで腫瘍の長径（a）と短径（b）を測定。腫瘍体積をV=a×b²/2で計算。各マウス体重記録後、腫瘍回収し組織学的解析。ヘマトキシリン・エオシン（HE）染色で腫瘍組織の腫瘍抑制率決定。末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング（TUNEL）を、メーカー指示に従いin situ細胞死検出キットで回腸末端組織の細胞アポトーシス検出に実施。

結果と考察

CSO-SAのCMCと¹H NMRスペクトル

両親媒性高分子は親水性媒質でミセルに自己集合。CMCが低いほどミセル形成が大きく、静脈投与後のミセル構造維持に有利。CSO-SAがミセル形成すると、ピレン蛍光プローブがミセル疎水核に容易に入り、帯電ピレンの蛍光強度が増加し、発光スペクトル強度が増加。この時点でI₃がI₁より著しく速く増加し、I₁/I₃蛍光強度比が急激に減少。I₁/I₃プロットとLog C値で有意な分岐点が観察可能（図1）。変曲点計算でCMCは179.02μg/mL。CMCが小さいほどミセル形成能力が強く、希釈耐性が強く、静脈投与後のミセル構造保護が改善される。

CSO-SAの蛍光強度比（I₁/I₃）対濃度対数の変化

EDCを架橋カップリング剤として用い、SAのカルボキシル基と反応して活性中間体-OO-アシルイソウレア誘導体を形成。これはCSOの第一級アミノ基と反応しアミド結合を形成。CSO-SA構造を核磁気共鳴プロトンスペクトルに基づき決定・確認。¹H NMR（400MHz、D₂O）δ 1.06（m、CH₂）、1.02（m、CH₃）はそれぞれSAのメチレンプロトンとメチルプロトンに対応。

アミノ基置換度

CSO-SAのSD%は、キトサン上のステアリン酸置換アミノ基の割合。TNBSがキトサンの遊離アミノ基と反応し、344nmでUV吸収を持つトリニトロベンゼン誘導体を形成。キトサンのトリニトロベンゼン誘導体標準曲線を344nm UV吸収で決定。CSO-SAのSD%を9.3±8%と計算。これはCSOとSAがグラフト比に基づき成功裏に連結されたことを確認。

CSO-SA、CSO-SA/EMO粒子サイズと電位

表1に示すように、CSO-SAのZ-averageは139.3±2.2nm。PDIは0.179±0.03で比較的均一な分散を示す。CSO-SAと比較して、CSO-SA/EMOのZ-averageとPDIは増加。EMO担持後、CSO-SA/EMOの表面正電荷はCSO-SAより高かった。

細胞取り込み

FITCはCSO-SAの物理化学的特性に影響しない。フルオレセインFITCをCSO-SAにグラフトしてFITC-CSO-SAを得た。Hoechst 33342で細胞染色後、共焦点レーザー走査顕微鏡でFITC-CSO-SA細胞取り込みを観察。MGC803取り込みが時間経過とともに徐々に増加し、FITC蛍光が徐々に増加することを発見。BGC823のミセル取り込みはMGC803と類似の時間依存的様相。FITC-CSO-SAは優れた細胞透過能を持ち、胃癌細胞細胞質に均等分布（図2）。

MGC803（a）とBGC823（b）細胞でのCSO-SAミセルのin vitro時間依存的取り込み：1、4、8、12時間（青：Hoechst 33342、緑：FITC、スケールバー=50μm）

CSO-SAのin vivo分布

近赤外（NIR）イメージング技術は生体物質と組織への透過性で有利。ヌードマウス尾静脈にCSO-SA/DiR注射後、小動物生体イメージャーで異なる時間でのCSO-SA/DiR分布を観察・記録。図3に示すように、尾静脈注射4時間後、CSO-SA/DiR分布は他のミセルと類似し、主に肝臓、脾臓、腫瘍組織に分布。腫瘍でのナノミセル分布は時間経過とともに強度が徐々に増加。これはCSO-SAグラフトが優れた受動的標的化能力を持つことを示し、主にナノミセルのEPR効果による（図3）。

静脈注射後の異なる時間でのCSO-SA/DiR全身画像

CSO-SA/EMOの調製

異なるpH環境が薬物担持に及ぼす影響

CSO-SA溶液を調製し、CSO-SAのpHを調整して薬物担持へのpH影響を調査。図4に示すように、CSO-SAは優れた薬物担持能力を示し、pH 6.4-6.8範囲で放物線傾向を示した。最高薬物担持はpH 6.6で見られ、この値が薬物担持の最適pHとなる（図4）。

CSO-SAグラフトの異なるpH値が薬物担持に及ぼす影響。データは平均±SD（n=3）で表示

包接効率、TEM、薬物担持量

CSO-SAはシェル-コアナノコンポジットミセルに自己集合。疎水性モイエティが自発的に疎水コア構造を形成し親水性媒質を排斥。この構造は、EMOがその疎水構造により疎水コアに容易にカプセル化できるため、薬物担持の重要な担体となる。EMO投与量を変化させ、CSO-SAのEMO担持容量への影響を調査。図5に示すように、EMO投与量増加に伴い薬物担持量が増加。CSO-SAの担持率は30%比率で最大21.16%に達した（図5）。

EMOとCSO-SAの異なる比率（5-30%）が薬物担持に及ぼす影響。データは平均±SD（n=3）で表示

CSO-SA/EMOを透過電子顕微鏡で30,000倍拡大。ナノミセル形状とサイズを観察・記録。

CSO-SA/EMOからのEMO放出

薬物担持ミセル溶液を3.5kDa透析バッグに添加、放出培地としてPBS（pH 7.2）を使用。サンプル採取ごとに同量の新鮮な放出培地で置換。

各時間点のEMO濃度をHPLCで決定後、累積放出率を計算。図6に示すように、CSO-SA/EMOは遊離EMOと比較して有意な持続放出効果を示した。結果、遊離EMOの放出率は0.5時間で38.4%だったのに対し、CSO-SA/EMOからのEMO放出率は約6.6%。4時間では遊離EMO83.7%、CSO-SA/EMO約32.5%。72時間以内に遊離EMO放出は97.2%に達したが、CSO-SA/EMOからのEMO放出は78.4%。EMOはCSO-SA/EMO薬物担持ミセルから主に2経路で放出：ミセル核からのEMO解離と、ミセルコアから放出培地への浸透。

72時間でのCSO-SA/EMOからのEMO放出プロファイル。グラフのエラーバーは標準偏差（n=3）を表す

CSO-SA/EMOの胃癌細胞毒性

MTTアッセイは細胞生存率検出の標準的方法。遊離EMO、CSO-SA、CSO-SA/EMOのMGC803とBGC823胃癌細胞への細胞毒性をMTTアッセイで測定。EMOとCSO-SA/EMOがMGC803とBGC823細胞を用量・時間依存的に抑制できることを示した。しかし、同濃度ではCSO-SA/EMOが遊離EMO溶液と比較してMGC803とBGC823細胞により高い抑制効果を持つ。EMOとCSO-SA/EMOの胃癌細胞IC₅₀値（表2）を計算。各時点（24h、48h、72h）でCSO-SA/EMOのIC₅₀はEMOより有意に低かった。CSO-SAのIC₅₀値は、CSO-SAが生物学的毒性が少ない安全な生物学的担体であることを示し、CSO-SA/EMOの細胞毒性はEMO由来であることを確認（図7）。

CSO-SA、EMO、CSO-SA/EMOで24時間、48時間、72時間処理したMGC803とBGC823胃癌細胞の細胞生存率。データは平均±SD（n=3）で表示

表2と図7は、CSO-SA/EMO薬物送達システムの細胞毒性が遊離EMOより有意に高いことを示した。しかし、CSO-SA/EMOと遊離EMOのin vivo環境での放出をシミュレートすると、遊離EMO放出が0.5時間で38.4%に達するのに対し、CSO-SA/EMOはわずか6.6%。全体として、各時点での遊離EMO濃度はCSO-SA/EMOより高かった。

この現象は容易に説明できる。CSO-SA/EMOはEMOを比較的ゆっくり放出するが、CSO-SA/EMOの抗腫瘍効果は遅延も低下もしない。多くの研究でナノ薬物送達システムが化学療法薬の抗腫瘍活性を改善できることが示されている[21]。

第一に、遊離EMOは初期バースト活性を示すが、細胞に効率的に取り込まれないのに対し、CSO-SAはエンドサイトーシスや食作用で細胞取り込みを大幅に加速。

第二に、CSO-SA/EMOが細胞膜に近づくと、ナノ粒子と細胞膜の相互作用がナノミセルの構造と特性、イオンチャネルなどの生体高分子機能に影響を与える可能性がある。したがって、CSO-SA/EMOの細胞膜への付着は単純な物理吸着ではなく、細胞の動的平衡を変化させ、それによりCSO-SA/EMOの細胞毒性をさらに促進。

最後に、遊離EMOは疎水性アントラキノン構造により血中分布が不良。CSO-SA/EMO薬物送達システムはEMO溶解度を高め、溶解を改善し、周囲細胞での分子濃度を高める。

FCMによる細胞周期停止検出

細胞周期解析は悪性腫瘍臨床治療の重要な側面。薬物感受性期間中の周期特異的薬物適用が高い効果を示すことが知られている。エチジウムブロミド類似体は正常細胞に透過できないが、損傷細胞膜を透過して細胞核を染色。PIが二本鎖DNAに埋め込まれ赤色蛍光を生成、蛍光強度は二本鎖DNAレベルに比例。PIでDNA染色後、フローサイトメトリー（FCM）でDNA含量決定。DNA含量分布に基づき細胞周期分布とアポトーシスを分析。

研究でEMOが細胞周期分布に影響することが示されている[11, 22]。FCM解析で、CSO-SA/EMOとEMOがMGC803とBGC823細胞を細胞周期のG2/M期でブロックできることを示した。

MGC803細胞を同濃度（20μM）のCSO-SA、遊離EMO、CSO-SA/EMO溶液で24時間曝露。MGC803細胞のG2/M期割合はそれぞれ8.95%、15.29%、23.12%。対照群は6.47%。同条件で20μM CSO-SA、遊離EMO、CSO-SA/EMO処理BGC823細胞のG2/M期割合はそれぞれ14.25%、16.79%、35.71%で、対照群（13.66%）より高値。これらデータは、CSO-SA/EMOが同濃度で遊離EMOよりMGC803とBGC823細胞のG2/M期をより効率的かつ有意にブロックすることを示した。CSO-SAは対照群と差なし（図8）。

EMOとCSO-SA/EMOで24時間処理したMGC803とBGC823細胞の細胞周期分布。Studentのt検定を計算、データは平均±SD（n=3）で表示（*p<0.05、**p<0.005、***p<0.001）

CSO-SA/EMOのin vivo抗腫瘍効果

CSO-SA/EMOの抗腫瘍効果をさらに研究するため、in vivoで腫瘍抑制率と細胞アポトーシスレベルを評価。結果、CSO-SA/EMOとEMO両方が腫瘍増殖に顕著な抑制効果（図9a）。CSO-SA/EMO群の腫瘍抑制率はEMO群の3倍（図9d）。各群マウス体重に有意変化なし（図9b）。これはCSO-SA/EMOとEMO両方が比較的安全であることを示す。各群腫瘍組織の形態学的変化とアポトーシスで、CSO-SA/EMOが有意な抗腫瘍効果を持つことが示された（図9e, f）。

CSO-SA/EMOのin vivo抗腫瘍効果。a 各群腫瘍形状。b 各群マウス体重。c 各群腫瘍体積。d 腫瘍抑制率。e 各群TUNEL染色腫瘍組織代表画像（スケールバー=200μm）。f 各群HE染色腫瘍組織代表画像（スケールバー=200μm）

結論

本研究では、CSO-SAの構造、CMC、SD%、粒子サイズ、電位を様々な方法で検出。結果は両親媒性CSO-SAが担体として良好に機能することを証明。胃癌細胞の蛍光強度で、CSO-SAが12時間以内に急速に取り込まれることを示した。ヌードマウスをモデルとして72時間以内のCSO-SA分布を研究。時間経過とともにCSO-SAの病変部位分布がより集中し、良好な受動的標的化効果を示した。

CSO-SA/EMOを超音波-透析法で調製。CSO-SAは強力な薬物担持能力を示し、環境pH 6.6で30%処方比で薬物担持レベルが21.6%に達した。CSO-SAと比較して、CSO-SA/EMOは粒子サイズが大きくゼータ電位が高かった。CSO-SA/EMO形状はTEMで直接記録可能。CSO-SA/EMOからのEMO放出は72時間で78.4%で、体内で滑らかで持続的なプロセスを示唆。CSO-SA/EMOの遊離EMOと比較した抗腫瘍効果を様々な実験で確認。

MTTアッセイでCSO-SAの胃癌細胞毒性を検出。結果、CSO-SAは安全な生物学的担体。遊離EMOと比較して、CSO-SA/EMOは胃癌細胞への抗腫瘍活性を有意に増強。MGC803とBGC823細胞周期をCSO-SA/EMOでより効果的にG2/M期で停止可能。腫瘍体積、HE染色、TUNELアッセイで、CSO-SA/EMOが遊離EMOより有意な抗腫瘍効果を持つことを証明。

以上の結果に基づき、CSO-SAは生体適合性と安全性を兼ね備えた担体である。本研究のCSO-SA/EMOは癌治療のための新しく効果的な剤形を利用し、in vivoで良好な受動的標的化効果を示す。

データと材料の入手可能性

本研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開論文に含まれている。

略語

CSO-SA:

キトサンオリゴ糖-ステアリン酸

EMO:

エモジン

FITC:

フルオレセインイソチオシアネート

MTT:

チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド

TEM:

透過電子顕微鏡

¹H NMR:

プロトン核磁気共鳴

EPR:

増強透過性保持

TCM:

伝統中国医学

CMC:

臨界ミセル濃度

Log C:

濃度の対数