細胞培養の性能を改善するためのレーザー支援法によるガラス上への抗体修飾アップコンバージョンナノ粒子の沈着

はじめに

上皮細胞は、皮膚、腸、気道、生殖管など、人体の内面と外面に見られます。上皮細胞は、汚れや微生物に対する安全シェルを提供するだけでなく、ストレッチ、トラックなどの重要な機能も発揮します[1]。したがって、上皮細胞は組織工学および組織再生に広く使用されてきました。上皮細胞と基質の表面との間の相互作用は、細胞の機能とコミュニケーションを維持するために不可欠です。通常、タンパク質ベースのコーティング、例えばラット尾コラーゲンは、さらなる研究のために、ペトリ皿またはガラス上で上皮細胞が成長することを可能にするために適用されます。最近、基板上にコーティングされたナノ材料は、ナノ構造コーティングの微細な形態、特殊なテクスチャ/パターンを利用することにより、細胞の成長を制御する可能性を示しています[2、3、4]。さらに、発光ナノ材料は、その非常に安定した光ルミネセンス特性のために、細胞間および細胞表面の相互作用の研究において、従来の有機色素に比べて大きな利点を示しています。細胞とタンパク質修飾発光ナノ構造でコーティングされた表面との相互作用を見つけることは興味深いことです。

1959年に最初に調査されたアップコンバージョン現象は、2つ以上の光子を連続的に吸収して高エネルギーの光を放出することです[5、6]。ランタニドをドープしたアップコンバージョンナノ粒子（UCNP）は、アクチベーター、増感剤、ホストマトリックスを含む3つの異なるコンポーネントで構成されています。 Er ³⁺ などのランタニドイオン 、Ho ³⁺ 、およびTm ³⁺ 彼らはユニークなエネルギー準位構造を持っているので、活性剤としての役割を果たすことができます[7,8,9,10,11]。 Yb ³⁺ イオンは、励起された光から活性剤にエネルギーを伝達するために適用できる最も一般的な増感剤です[12、13、14]。結晶ホストとしては、通常、酸化物材料とフッ化物材料の両方が使用されます[15、16、17]。近赤外（NIR）光の励起下で可視範囲から近赤外範囲に光を放出するアップコンバージョンナノ粒子は、「治療ウィンドウ」として知られるNIR光の散乱係数が低いため、深部組織のバイオイメージングに適用できます。 」[18]。最近、生物学的標識/センシングのために、UCNPのさまざまな表面修飾が開発されました[19、20]。たとえば、アビジンは、抗体との相互作用を実証するために、UCNPの表面で修飾されたヘキサン二酸（HAD）に結合されました[21]。 ssDNA修飾コアシェルUCNPは、特定のオリゴヌクレオチドを検出するために開発されました[24]。

一方、血液や細胞外液に含まれる抗体である免疫グロブリンG（IgG）は、組織の感染を抑制します。 IgGとナノ粒子の間の相互作用が研究されています。たとえば、IgGは金ナノ粒子を生成するためのテンプレートとして使用でき、IgG修飾磁性ナノ粒子は細菌細胞を標識するために使用できます[22、23]。ただし、細胞培養または組織培養のためにIgGをUCNPに修飾することについて報告されている研究はごくわずかです。

ゾルゲル法、スピンコーティング、溶媒蒸発などの従来の方法は、生物医学的アッセイのための基板上の生体分子修飾ナノ粒子の堆積に適用されてきました[27、28]。ただし、タンパク質またはタンパク質ベースのナノ構造の堆積のための溶液コーティング法は、汚染を最小限に抑えることはほとんどありません。レーザー蒸着は、十分に制御された厚さを示し、化学蒸着で発生する操作の汚染を回避します。細胞培養用のタンパク質ベースの表面を開発するために使用されたレーザー蒸着技術はほとんどありません。

従来の物理蒸着法とは異なり、マトリックス支援レーザー脱離（MAPLE）技術は、ターゲット材料を直接アブレーションしません。代わりに、レーザーのほとんどのエネルギーは凍結溶媒（マトリックス）によって吸収されます[24、25]。 MAPLEプロセスでは、揮発性の高い溶媒（マトリックス）に分散したターゲット材料が、液体窒素で冷却されたターゲットホルダーに導入されます[26、27、28、29、30]。レーザー照射下で、ターゲット材料を蒸発溶媒とともに基板に輸送することができます。 APLE技術は、センサー、有機電子デバイス、ドラッグデリバリー、インプラントコーティングなどのさまざまな分野で適用されています[31、32、33、34、35]。ただし、MAPLEが沈着した生体分子/タンパク質ナノ粒子を含む基質が細胞培養の性能に及ぼす影響についての研究はほとんど報告されていません。

この研究では、UCNP（NaGdF ₄ ）を作成しました ：Yb ³⁺ 、Er ³⁺ ）および水熱法による免疫グロブリンG（IgG）修飾UCNP（UCNPs-IgG）。その後、532 nm Nd：YAGレーザーを使用したMAPLEプロセスを使用して、IgGの修飾の有無にかかわらずUCNPを細胞培養皿のガラス底に直接沈着させました。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、UCNPを沈着させたガラスに播種し、UCNPのコーティングの細胞毒性と、UCNPで処理した表面での細胞の挙動を調べました。

メソッド/実験

資料

硝酸ガドリニウム（III）六水和物（Gd（NO ₃ ） ₃ ・6H ₂ O、結晶および塊、99.9％の微量金属ベース）、硝酸イッテルビウム（III）五水和物（Yb（NO ₃ ） ₃ ・5H ₂ O、99.9％微量金属ベース）、硝酸エルビウム（III）五水和物（Er（NO ₃ ） ₃ ・5H ₂ O、微量金属ベース99.9％）、フッ化ナトリウム（NaF、BioReagent、昆虫細胞培養に適しています、≥99％）、分岐ポリエチレンイミン（PEI、LSによる平均Mw〜800、GPCによる平均Mn〜600）、抗ヒトIgG（Fab特異的）–ヤギで産生されたFITC抗体（アフィニティー単離抗体、緩衝水溶液）、4 '、6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI）、およびファロイジン-テトラメチルローダミンBイソチオシアネート（ファロイジン-TRITC）を購入しましたSigma-Aldrichから。エチレングリコール（EG）はFisherChemicalから購入しました。イソプロパノール（2-プロパノール）は、Caledonラボラトリーケミカルズから購入しました。

ワンポットプロセスを使用した、IgGを使用した場合と使用しない場合のUCNPの合成

UCNP（NaGdF ₄ ：Yb ³⁺ 、Er ³⁺ ）は、修正されたワンポット法によって合成されました[36]。簡単に説明すると、720 mgのGd（NO ₃ ） ₃ ・6H ₂ O、170 mgのEr（NO ₃ ） ₃ ・5H ₂ O、160 mgのYb（NO ₃ ） ₃ ・5H ₂ O、および20mlのエチレングリコールを3つ口フラスコに加えた。次に、0.7gのPEIをフラスコに穏やかに加えた。次に、10mlのエチレングリコールに溶解した336mgのNaFをフラスコに滴下した。混合物を200℃に加熱し、窒素保護下で6時間還流した。反応生成物を遠心分離によって収集し、エタノール/蒸留水で数回洗浄した。製品を60°Cで乾燥させました。

IgG抗体は、アミド結合によってUCNPの表面で修飾されました。図1に示すように、15mgのUCNP粉末を15mlの蒸留水に溶解しました。次に、5 mlのホウ酸緩衝生理食塩水（BBS、pH =8）と20μgのIgGを溶液に添加しました。溶液を室温で2時間撹拌した。生成物を洗浄し、遠心分離によって収集した。

UCNPおよびUCNP-IgGを生成するためのワンポット法の概略図

MAPLEによるIgGあり/なしのUCNPの沈着

レーザー蒸着プロセスは、532 nm Nd：YAGレーザーと提携しているMAPLE 2000装置（プロジェクト206、PVD Products、Inc。、米国）によって実行されました。堆積プロセスを図2に示します。ターゲットナノ粒子を1wt。％の濃度でイソプロパノールに溶解しました。混合物を液体窒素で冷却したターゲットホルダーで凍結した。このプロセスでは、他の追加の添加剤や界面活性剤は使用されていません。

MAPLE技術を使用したUCNPおよびUCNP-IgGの沈着の概略図

さらに、532 nmのNd：YAGレーザーを、10Hzのレーザー周波数とτ _fwhm で適用しました。 ≅200μs。レーザースポット面積のサイズは0.63cm ² レーザーフルエンスは150mJ / cm ² 。ガラス基板は、基板ホルダーに固定されたゼラチンの２重量％溶液で処理され、基板の温度は、実験プロセス全体を通して２５℃であった。レーザー蒸着プロセスは、1×10 ^-6 で実施されました。 トル。以前の研究[42、43]に従って、堆積時間は2時間に設定されました。基板からターゲットまでの距離は4.5cm（垂直構成）でした。レーザー照射期間中、ターゲットホルダーと基板ホルダーは回転していました（ターゲット：10rpm、基板：25rpm）。

材料の特性評価

MAPLE堆積前のUCNPおよびUCNP-IgGは、透過型電子顕微鏡（TEM、Philips CM-10、80 kVで動作）によって特性評価されました。 UCNPおよびUCNP-IgGのフーリエ変換赤外スペクトル（FTIR）は、Bruker Vector 22 FTIR分光計（スキャン範囲600 cm ^-1 ）によって取得されました。 〜4500 cm ^-1 、解像度4 cm ^-1 、64スキャン）。 QuantaMaster™40分光蛍光光度計（Horiba Canada—Photon Technology International Inc.）を使用して、UCNPのフォトルミネッセンス特性を調べました。ナノ粒子の沈着がある場合とない場合のガラス表面でのヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の成長を、共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 5 Duo Vario Microscope）で調べました。 INCA PentaFET-x3 EDXシステム（Oxford Instruments）を搭載したHitachi S-3400 N走査型電子顕微鏡を適用して、エネルギー分散型X線分光法（EDX）を実行しました。

細胞の挙動に関する研究

ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC、アメリカンタイプカルチャーコレクション）を適用して、レーザー沈着治療後のIgG修飾の有無にかかわらずUCNPの生体適合性を研究しました。 HUVECは、UCNPおよびUCNP-IgGが沈着したガラス表面に播種されました。ゼラチンの2wt。％溶液（UCNPなし）で処理されたガラス基板は、MAPLE堆積処理後のコントロールとして使用されます。沈着したサンプルをMCDB培地（10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン、およびアンホテリシンB）に浸して、HUVECを播種しました。 HUVECは37°Cで24時間培養されました。 HUVECは、共焦点イメージング（Zeiss LSM 510 Duo）を取得するために、4％ホルマリンで2時間基板の表面に固定されました。細胞をファロイジン-TRITCおよびDAPIで染色した。サンプルをPBS（pH 7.4）で洗浄し、退色防止剤で処理しました。

細胞毒性に関する研究

HUVECは、沈着したサンプルの表面でMCDB培地（10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン、およびアンホテリシンB）で培養されました。培養皿に移した後、細胞を24時間培養しました（37°C、5％CO ₂ ）サンプルの表面に。各サンプルの表面に約100,000個の細胞を播種しました（UNCPの沈着あり/なし）。対照、沈着したガラス基板、UCNP、およびUCNP-IgGを含むすべてのサンプルを3回測定した。次に、MTT剤（3-（4,5-ジメチルチアゾリル-2）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を細胞培地に添加し、細胞を3時間インキュベートした。細胞培地を除去し、ウェルをPBSで2回すすいだ。次に、DMSOを各ウェルに加えてホルマザンを溶解しました。液体を96ウェルプレートに移し、490 nmのバイオキネティックリーダー（Bio-Tek Instruments EL340Iマイクロプレートリーダー）で分析しました。

結果と考察

MAPLE沈着前のUCNPs / UCNPs-IgGの特性評価

IgG抗体は、アミド結合を介してアミン修飾UCNPに結合しました。 IgGの有無にかかわらずUCNPはTEMによって特徴づけられました。図3aは、立方晶UCNPのTEM顕微鏡写真です。 UCNPの平均サイズは50±8nmと推定されます。図3aの小さな挿入図は、高分解能TEM（HRTEM）の顕微鏡写真です。 UCNPは高度に結晶性の構造を持っています。 2つの隣接する格子面間の測定された面間距離は0.312nmであり、立方相NaGdF ₄ の（1 1 1）面に対応します。 （JCPDS 27-0697）。図3bは、IgGと結合したUCNP（UCNPs-IgG）のTEM顕微鏡写真です。抗体で修飾されたUCNPは立方体の形状のままであり、平均粒子サイズは約54±8nmです。 UCNPにバイオコンジュゲートされたIgG抗体は、図3bに示すように、赤丸でマークされたTEMによって直接観察できます。 IgG抗体のサイズは約10±5nmであり、理論計算および実験測定と同様です[44、45]。

a のTEM顕微鏡写真 UCNPと b UCNPs-MAPLE沈着前のIgG

UCNPの結晶構造（NaGdF ₄ ：Yb ³⁺ 、Er ³⁺ ）は、図4に示すX線粉末回折（XRD）パターンによって明らかになりました。XRDプロファイルの32°、37°、54°、および65°の4つのピークは、（111）、（200）、（ 220）、および（311）結晶面。これは、立方晶相NaGdF ₄ の標準XRDパターンと同じです。 （JCPDS 27-0697）および参考文献[36、37]。 HRTEMとXRDの両方の測定により、UCNPの結晶構造が確認されます。

NaGdF ₄ のXRDプロファイル ：Er ³⁺ 、Yb ³⁺ アップコンバージョンナノ粒子

UCNPへのIgGのバイオコンジュゲーションをさらに調査するために、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を使用しました。図5に示すように、アミン基の曲げ振動バンドは1515 cm ^-1 で観察されます。 および1511cm ^-1 PEI抗体とIgG抗体の両方がアミノ基を持っているため、UCNPとUCNP-IgGのスペクトルで。 2987 cm ^-1 のピーク 、2900 cm ^-1 、および1400 cm ^-1 -CH ₂ の伸縮振動に起因する可能性があります -およびC-C結合。ヒドロキシル基（-OH）の伸縮振動バンドは3673 cm ^-1 で観察されます。 IgGのカルボキシル基によるUCNPs-IgGのスペクトル。 1249 cm ^-1 のピーク および1650cm ^-1 は、IgG修飾UCNPのスペクトルにおいて、それぞれ炭素-酸素結合とアミド結合の伸縮振動バンドに起因します。これらのピークは、UCNPs-IgGの表面にIgG抗体が存在することを示しています。

ワンポットプロセスで作成されたUCNP-IgGおよびUCNPのFTIRスペクトル

MAPLE沈着後のIgGあり/なしのUCNPの特性評価

UCNPsおよびUCNPs-IgGは、ガラス底の細胞培養皿にMAPLEプロセスで沈着させました。 UCNPsとUCNPs-IgGのそれぞれの堆積の前後のガラスの表面は、エネルギー分散型X線分光法（EDX）によって特徴づけられました。図6は、UCNP（図6a）およびUCNP-IgG（図6b）でコーティングされたガラスのサンプル中のガドリニウム（Gd）、エルビウム（Er）、イッテルビウム（Yb）、およびフッ素（F）の元素の存在を示しています。それぞれ。さらに、より長い照射時間でのMAPLE堆積後のUCNPおよびUCNP-IgGのフォトルミネッセンスを測定した。追加ファイル1：サポートファイルの図S1に示すように、980 nmの励起下で、緑（540 nm）と赤（650 nm）の両方の発光を観察できます。発光の強度は、IgGを含む場合と含まない場合のUCNPのサンプル間でわずかに異なることに注意してください。これは、表面の欠陥または測定誤差が原因である可能性があります。さらなる研究が行われる予定です。その結果、MAPLEの沈着は、IgGの有無にかかわらずUCNPの構造と特性を維持することができます。

a のEDXスペクトル MAPLE処理後のサンプルと b MAPLE処理なしのサンプル（裸ガラス）

FTIRを使用して、裸のガラスサンプルと比較して、MAPLE技術によって作成されたUCNPSおよびUCNPs-IgGコーティングを調査しました。 UCNP、MAPLE堆積によるUCNPs-IgG、およびブランクサンプル（裸のガラス基板）で堆積されたサンプルのFTIRスペクトルを図7に示します。3648cm ^{-1 <での-OH基の伸縮振動バンド/ sup> これは、IgGのカルボキシル基に起因します。これは、スペクトル1、つまりUCNP-IgGコーティングでのみ観察されます。この結果は、基質の表面にUCNP-IgGが存在することを示しています。スペクトル2（UCNPsコーティング）では、1575 cm -1 の曲げ振動バンド は、UCNPで修飾されたアミン基に起因しますが、アミン基の曲げ振動バンドは、バイオコンジュゲーションが成功したため、スペクトル1（UCNPs-IgG）ではほとんど観察されません。その結果、MAPLE技術は、抗体で修飾されたUCNPの特性と微細構造を維持することができます。}

裸のガラスとUCNPでコーティングされたガラスのFTIRスペクトル-それぞれIgGとUCNP

裸のガラスのスペクトル（スペクトル-3）と比較すると、メチレン基の伸縮振動バンドは約2985 cm ^-1 です。 および2900cm ^-1 UCNPの表面にある炭素ベースの官能基により、スペクトル1とスペクトル2の両方で。図７のコーティングのピークは、基板表面に堆積された少量のナノ粒子、および１２５０ｃｍ －１でのスペクトルの変化によって引き起こされる図５のピークよりも著しく弱いことに留意されたい。 図5と比較した図7は、ガラス基板の効果によるものです。

さまざまなコーティングでのセルの動作

HUVEC細胞の従来の方法では、細胞培養性能の研究でコントロールとして使用されるタンパク質層をコーティングする必要があります。したがって、この研究における3つの異なるコーティングは、（1）コントロール（ゼラチンでコーティングされたガラス）、（2）UCNPでコーティングされたガラス、および（3）UCNPs-IgGでコーティングされたガラスです。図8は、さまざまな表面で24時間培養した細胞の共焦点顕微鏡写真を示しています。 UCNPおよびUCNP-IgGでそれぞれコーティングされた表面で増殖するHUVECの量は、対照の量と同様です。ただし、UCNPs-IgGで修飾された表面で成長するHUVEC細胞の挙動は、最初の24時間の培養期間で劇的に改善されます。培養期間内の細胞増殖挙動には、細胞の面積、接続の長さ、細胞の長さ、およびサンプル表面の総細胞数が調査および分析されました。

a の表面にあるHUVECの共焦点顕微鏡写真 コントロール、 b UCNP、および c IgG修飾UCNP

図9は、3つの異なる表面で24時間培養した後の細胞の挙動の統計分析を示しています。セルの面積（図9a）、接続の長さ（図9b）、セルの長さ（図9c）、およびセル数（図9d）は、ImageJソフトウェアによって調査されました。セルの長さは、このセルの最大の長さの値として定義されます。接続の長さは、細胞の先端の端と細胞核の間の距離として定義されます。対照サンプルで増殖している細胞と比較して、UCNPおよびUCNP-IgGで修飾された表面のHUVEC細胞の細胞面積は、それぞれ11.2％および22.2％増加します。 UCNPおよびUCNP-IgGで修飾された表面上のHUVEC細胞の接続の長さは、12.5％および17.5％増加します。 UCNPsおよびUCNPs-IgGで修飾された表面のHUVEC細胞の長さは、8.2％および17.3％増加します。さらに、細胞数の分析結果は、UCNPsベースのサンプルの表面上の細胞の量が対照のそれよりも約8％多いことを示しています。これらの結果は、UCNPsサンプルとUCNPs-IgGサンプルの両方がHUVECs細胞と生体適合性があることを示しており、これは以前の研究と一致しています[38]。 UCNPsおよびUCNPs-IgGが沈着した表面で培養されたHUVEC細胞の増殖は、細胞面積、細胞長、および接続の長さの点で促進されています。以前の研究は、ナノ構造がHUVEC細胞の内皮活性化を引き起こす可能性があることを示しています[2、3、4、39]。さまざまなナノ粒子に曝露すると、炎症性メディエーターの放出とHUVECの接着分子のアップレギュレーションが観察されることが報告されています[40]。以前の研究に基づいて、炎症性メディエーターは血管新生および血管新生促進効果を促進する可能性があります[2、41]。さらに、最近の研究は、IgGがHUVECの血管新生のような形質転換を促進する可能性があることを示しています[3]。

コントロール、UCNP、UCNP-IgGを含むさまざまなコーティングで培養されたHUVEC： a セル領域、 b セル接続の長さ、 c セルの長さ、および d 細胞数

IgGを含む/含まないUCNPのコーティングが細胞生存率に及ぼす影響

細胞生存率は、異なる表面で培養されたHUVEC細胞を使用して研究されました。図10は、さまざまな表面での相対的な細胞生存率を示しています。コントロール（ゼラチンでコーティングされたガラス）、裸のガラス、ガラス基板上に堆積されたUCNP、およびガラス基板上に堆積されたUCNP-IgG。裸のガラス、UCNPでコーティングされたガラス、およびUCNPs-IgGでコーティングされたガラスの相対的な細胞生存率は、それぞれ99.6％、105.44％、および103.96％でした。いくつかの研究は、特に高濃度で適用された場合、高濃度のPEIが毒性作用を及ぼす可能性があることを示していますが、リガンドとしてのPEIの使用は許容され、無視できる細胞毒性を示します[44,45,46,47]。 MAPLEのメカニズムにより、基質表面のUCNPs / UCNPs-IgGの量は、しきい値（1 mg / ml）よりもはるかに少なくなっています。明らかに、MAPLEによるガラスへのUCNPおよびUCNP-IgGの沈着は、HUVEC細胞に毒性作用を課しません。生体適合性材料は通常、細胞の相対的な細胞生存率（> 85％）を持つことができることに注意してください。 [8]

裸のガラス、それぞれUCNPとUCNP-IgGでコーティングされたコーティング、およびコントロールとして使用されたゼラチンでコーティングされたガラス上で成長するHUVEC細胞の細胞生存率

結論

要約すると、UCNPsおよびUCNPs-IgGは、ワンポット法によって正常に合成され、MAPLE技術によってガラス底の培養皿に堆積されました。 TEMおよびFTIRの結果は、UCNPの表面でのIgGのバイオコンジュゲーションの成功を示しています。 UCNPの平均粒子サイズは50±8nmです。抗体で修飾されたUCNPは立方体の形状のままであり、平均粒子サイズは約54±8nmです。 UCNP上のIgGのバイオコンジュゲーションは、平均サイズが10±5nmのTEMで直接観察できます。 FTIRスペクトルは、UCNPの表面で修飾された抗体のカルボキシル基/ペプチド結合の存在も確認しました。 MAPLE堆積プロセスを使用して、ガラス基板上にUCNPおよびUCNP-IgGを堆積しました。 EDX、FTIR、およびPLの測定結果は、MAPLE堆積後のUCNPおよびUCNPSの構造と特性の保持を示しています。私たちの研究は、MAPLEプロセスが抗体の修飾の有無にかかわらずUCNPの特性と構造の保持を達成できることを示しています。さらに、細胞培養の性能は、MAPLEプロセスによってそれぞれUCNPおよびUCNP-IgGで処理された異なる表面でHUVEC細胞株を培養することによって統計的に研究されています。セルの面積、セルの長さ、および接続の長さは、理想的な合流点と微小血管構造の形成をサポートするために非常に重要です。 MAPLE技術によってUCNPsおよびUCNPs-IgGサンプルで処理されたガラス表面は、HUVEC細胞株に対して毒性作用を示しません。 UCNPおよびUCNP-IgGのMAPLE沈着は、組織工学および組織再生のための新しい生物学的デバイスの製造に適用できると期待されています。

略語

DAPI：

4 '、6-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸塩

EG：

エチレングリコール

HUVEC：

ヒト臍帯静脈内皮細胞

IgG：

免疫グロブリンG

MAPLE：

マトリックス支援パルスレーザー蒸発

PEI：

ポリエチレンイミン

ファロイジン-TRITC：

ファロイジン–テトラメチルローダミンBイソチオシアネート

UCNP：

アップコンバージョンナノ粒子