DNA合成
背景
デオキシリボ核酸（DNA）合成は、核酸鎖のコピーが作成されるプロセスです。自然界では、DNA合成はDNA複製として知られているメカニズムによって細胞内で起こります。科学者たちは、遺伝子工学と酵素化学を使用して、DNAを合成するための人工的な方法を開発しました。これらの中で最も重要なのは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）です。 1980年代初頭に最初に開発されたPCRは、数十億ドル規模の産業になり、元の特許は3億ドルで販売されました。
歴史
DNAは、1951年にフランシス・クリック、ジェームズ・ワトソン、モーリス・ウィルキンスによって発見されました。ロザリンドフランクリンによって生成されたX線結晶学データを使用して、ワトソンとクリックは、DNAの構造が二重らせんの構造であると判断しました。この研究で、ワトソン、クリック、ウィルキンスは1962年にノーベル生理学・医学賞を受賞しました。長年にわたり、科学者たちはDNAを使って「生命のコード」を解明しようとしていました。彼らは、DNAがタンパク質配列の命令コードとして機能することを発見しました。彼らはまた、すべての生物が固有のDNA配列を持っており、スクリーニング、診断、および識別の目的に使用できることを発見しました。これらの研究で制限があることが証明された1つのことは、単一のソースから入手可能なDNAの量でした。
DNAの性質が決定された後、科学者は細胞の遺伝子の組成を調べることができました。遺伝子は、タンパク質を構築するためのコードを提供するDNA塩基対の特定の配列です。これらのタンパク質は、目の色や血液型などの生物の特性を決定します。ある遺伝子が単離されると、その分子のコピーを合成することが望まれるようになりました。大量の特定のDNAが合成された最初の方法の1つは、遺伝子工学によるものでした。
遺伝子工学は、目的の遺伝子を細菌プラスミドと組み合わせることから始まります。プラスミドは、多くの細菌に見られるDNAの小さなストレッチです。得られたハイブリッドDNAは組換えDNAと呼ばれます。次に、この新しい組換えDNAプラスミドを細菌細胞に注入します。次に、培養物中で細胞を増殖および増殖させることにより、細胞をクローン化する。細胞が増殖するにつれて、挿入された遺伝子のコピーも増殖します。バクテリアが十分に増殖したら、挿入された遺伝子の複数のコピーを分離することができます。このDNA合成方法では、数週間で数十億の遺伝子のコピーを作成できます。
1983年、Kary Mullisがポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と呼ばれるDNA合成プロセスを開発したとき、DNAのコピーを作成するのに必要な時間が大幅に短縮されました。この方法は、わずか数時間で数十億のDNA鎖のコピーを生成する以前の既知の方法よりもはるかに高速です。それは、二本鎖DNAの小さなセクションを、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーを含む溶液に入れることから始まります。溶液を加熱してDNA鎖を分離します。冷却されると、ポリメラーゼは各鎖のコピーを作成します。このプロセスは、必要な量のDNAが生成されるまで5分ごとに繰り返されます。 1993年、MullisのPCRの開発により、彼はノーベル化学賞を受賞しました。今日、PCRは医療診断、法医学、微生物学の分野に革命をもたらしました。これは、遺伝子研究における最も重要な進展の1つであると言われています。
背景
DNA合成を理解するための鍵は、その構造を理解することです。 DNAはヌクレオチドと呼ばれる化学単位で構成された長鎖ポリマーです。遺伝物質としても知られるDNAは、ほとんどの生物のタンパク質合成を指示する情報を運ぶ分子です。通常、DNAは化学的に結合したヌクレオチドの2つの鎖として存在します。これらのリンクは、塩基対規則によって指示された特定のパターンに従います。各ヌクレオチドは、デオキシリボース糖分子、リン酸基、および4つの窒素含有塩基の1つで構成されています。塩基には、ピリミジンであるチミン（T）とシトシン（C）、およびプリンであるアデニン（A）とグアニン（G）が含まれます。 DNAでは、アデニンは一般的にチミンと結合し、グアニンはシトシンと結合します。分子は二重らせんと呼ばれる構造に配置されており、ねじれたはしごやらせん階段を描くことで想像できます。ベースははしごの横木を構成し、砂糖とリン酸塩の部分ははしごの側面を構成します。配列と呼ばれるヌクレオチドが結合する順序は、DNA配列決定と呼ばれるプロセスによって決定されます。
真核細胞では、複製と呼ばれるプロセスを介して細胞分裂の直前にDNA合成が行われます。複製が始まると、DNAの2本の鎖がさまざまな酵素によって分離されます。このように開かれると、各ストランドは新しいストランドを生成するためのテンプレートとして機能します。このプロセス全体は、DNAポリメラーゼと呼ばれる酵素によって触媒されます。この分子は、対応する、または相補的なヌクレオチドを各DNA鎖と一致させます。次に、ヌクレオチドは化学的に結合して、元の鎖の正確なコピーである新しいDNA鎖を形成します。娘鎖と呼ばれるこれらのコピーには、親DNA分子の半分とまったく新しい分子の半分が含まれています。この方法による複製は、半保存的複製として知られています。複製のプロセスは、細胞が遺伝物質の正確な複製をある世代の細胞から次の世代に移す方法を提供するため、重要です。
原材料
DNA合成に使用される主な原材料には、DNA出発物質、taq DNAポリメラーゼ、プライマー、ヌクレオチド、および緩衝液が含まれます。これらはそれぞれ、何百万ものDNA分子の生成に重要な役割を果たします。
制御されたDNA合成は、コピーするDNAの小さなセグメントを特定することから始まります。これは通常、目的のタンパク質のコードを含むDNAの特定のシーケンスです。テンプレートDNAと呼ばれるこの材料は、約0.1〜1マイクログラムの濃度で必要です。 DNA精製に使用される微量の化合物でもPCRプロセスを阻害する可能性があるため、高度に精製する必要があります。 DNA鎖を精製する1つの方法は、70％エタノールで処理することです。
DNA複製のプロセスは1980年以前には知られていましたが、熱安定性のあるDNAポリメラーゼが知られていないため、PCRは不可能でした。 DNAポリメラーゼは、DNA合成に関与する反応を触媒する酵素です。 1980年代初頭、科学者たちは自然の蒸気ベントの周りにバクテリアが生息していることを発見しました。 サーマスアクアティカスと呼ばれるこれらの生物が判明しました。 極端なレベルの熱で安定して機能するDNAポリメラーゼを持っていました。この taq DNAポリメラーゼは、現代のDNA合成技術の基礎となりました。典型的なPCRプロセスでは、2〜3マイクログラムの taq DNAポリメラーゼが必要です。ただし、使用量が多すぎると、不要な非特異的なDNA配列が生じる可能性があります。
ポリメラーゼは、各DNA鎖上の対応するヌクレオチドを組み合わせることにより、DNA鎖を構築します。化学的に言えば、ヌクレオチドは糖構造、リン酸基、環状塩基の3種類の分子基で構成されています。糖部分は、すべてのヌクレオチドの一次構造を提供します。一般に、糖は、いくつかのヒドロキシ（-OH）基が結合した5つの炭素原子で構成されています。 DNAの場合、糖は2-デオキシ-D-リボースです。ヌクレオチドの定義部分は、糖に共有結合しているヘテロ環状塩基です。これらの塩基はピリミジンまたはプリン基のいずれかであり、核酸コードの基礎を形成します。アデニンとグアニンを含む2種類のプリン塩基が見られます。 DNAには、チミンとシトシンの2種類のピリミジン塩基が存在します。リン酸基はヌクレオチドの最後の部分を構成します。このグループはリン酸に由来し、5番目の炭素の糖構造に共有結合しています。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の最初のフェーズでは、DNAの変性が行われます。 DNA分子のこの「開放」は、生成される次のDNA分子のテンプレートを提供します。 DNAが別々の鎖に分割されると、温度が下がります—プライマーアニーリングステップ。次の段階では、DNAポリメラーゼが鎖と相互作用し、全長に沿って相補的なヌクレオチドを追加します。このフェーズで必要な時間は、1,000塩基対ごとに約1分です。
DNA合成を開始するには、DNAの短いプライマーセクションを使用する必要があります。オリゴフラグメントと呼ばれるこれらのプライマーセクションは、長さが約18〜25ヌクレオチドで、テンプレートDNAのセクションに対応します。それらは通常、約60％のCおよびGヌクレオチド濃度を持ち、均一に分布しています。これにより、合成プロセスで最大の効率が得られます。
緩衝液は、DNA合成が起こり得る媒体を提供します。これは、MgCl2、HCl、EDTA、およびKCIを含む水溶液です。 Mg2 +イオンはDNAおよびプライマーと相互作用してDNA合成に重要な複合体を生成するため、MgCl2濃度は重要です。推奨濃度は1〜4マイクロモルです。このシステムのpHは重要であるため、硫酸アンモニウムで緩衝することもできます。反応を活性化するために、ATP、GTP、NTPなどのさまざまなエネルギー分子が追加されます。これらの化合物は、生物が代謝反応を促進するために使用するものと同じものです。
このプロセスで使用できる他の材料には、鉱油またはパラフィンワックスが含まれます。 DNA合成が完了した後、DNAは通常、分離および精製されます。このプロセスで使用される一般的な試薬には、フェノール、EDTA、プロテイナーゼKなどがあります。
製造プロセス
DNA合成は通常、実験室で小規模に行われます。これには、サンプル準備、DNA合成反応サイクル、およびDNA分離を含む3つの異なるプロセスが含まれます。これらの製造ステップは通常、汚染を避けるために別々のエリアで行われます。これらの手順に従って、科学者はDNAの数本の鎖を数百万の正確なコピーに変換することができます。
サンプルの準備
- 1 DNA合成を開始するために、さまざまな溶液を準備します。これは通常、汚染を最小限に抑えるためにUVランプを備えた層流キャビネットで行われます。科学者は、同様の理由で、各製造ステップで新しい手袋を使用します。通常、プライマー、ポリメラーゼ、dNTPを除くすべての開始溶液は、汚染生物を殺すためにオートクレーブに入れられます。 2つの別々のソリューションが作成されます。 1つには、バッファー、プライマー、およびポリメラーゼが含まれています。もう1つは、MgCl2とテンプレートDNAを含みます。これらの溶液はすべて小さなチューブに入れられ、反応が始まります。
Kary Banks Muilis
Kary Banks Muilisは、1944年にノースカロライナ州レノアで生まれました。1966年にジョージア工科大学を卒業し、理学士号を取得しました。化学では、Muilisはカリフォルニア大学バークレー校の生化学博士課程に入学しました。彼の博士号を取得する1973年に、彼はカンザスシティのカンザス大学医学部で教職に就きました。 1977年、彼はカリフォルニア大学サンフランシスコ校で博士研究員に就任しました。
Muilisは、1979年に、他の科学者が遺伝子クローニングに使用する化学物質を合成する、成長を続けるバイオテクノロジー企業であるカリフォルニア州エメリービルのCetusCorporationで研究科学者としての地位を受け入れました。そこにいる間、彼はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を設計しました。これは、数時間で数十億のコピーを作成できる特定の遺伝子またはDNA（デオキシリボ核酸）フラグメントを複製するための高速で効果的な手法です。 DNAを複製する最も効果的な方法はクローンを作ることでしたが、それは問題がありました。 Mullisの同僚にこの発見の重要性を納得させるには時間がかかりましたが、すぐにPCRが集中的な研究の焦点になりました。 Cetusの科学者は、プロセスの商用バージョンとサーマルサイクラーと呼ばれるマシンを開発しました（DNA [ヌクレオチド]の化学的ビルディングブロックと生化学的触媒[ポリメラーゼ]を追加すると、マシンはターゲットピースに対してプロセスを自動的に実行しますDNAの）。
Cetusは、PCR特許の開発に対してMuilisに10,000ドルを授与し、その後3億ドルで売却しました。 1986年にCetusを去り、Muilisは民間の生化学研究コンサルタントになり、1993年にノーベル賞を受賞しました。
DNA合成サイクル
- 2反応溶液が調製された後、PCRサイクルが開始されます。最初のフェーズでは、DNAの変性が行われます。最も重要な最初のステップの1つは、DNAテンプレートの完全な変性です。 DNAの変性は、本質的に二重結合鎖の切断を意味します。 DNA分子のこの「開放」は、生成される次のDNA分子のテンプレートを提供します。変性が不完全な場合、最初のサイクルでコピーが非効率になり、後続の各サイクルに悪影響を及ぼします。最初の変性は、DNAテンプレート溶液を1〜3分かけて203°F（95°C）に加熱することによって行われます。合計時間は、テンプレートの構成によって異なります。繰り返しサイクルでは、変性ステップは約2分間続き、溶液を201PF（94°C）に加熱します。グリセロール、DMSO、またはホルムアミドなどのDNA変性を促進するために、追加の材料を溶液に加えることができます。
- 3 DNAが別々の鎖に分割された状態で、温度を122-149°F（50-65°C）に下げます。これはプライマーアニーリングステップとして知られており、約2分間続きます。この時点で、左右のプライマーは一致し、テンプレートDNA上の相補的な塩基と化学的に結合します。
- 4次のフェーズには、拡張ステップが含まれます。反応のこの部分は、ほとんどのDNA鎖がコピーされるときです。システムの温度は約162°F（72°C）に加熱され、コピーするDNAの長さに応じてそこで保持されます。この段階で、DNAポリメラーゼは鎖と相互作用し、全長に沿って相補的なヌクレオチドを追加します。このフェーズで必要な時間は、1,000塩基対ごとに約1分です。
- 5この最初のサイクルの後、DNA合成サイクルが繰り返されます。サイクル数は、初期DNAの量と必要なDNAの量によって異なります。テンプレートDNAのコピーが10未満の場合、40サイクルが必要です。初期DNAが多い場合は、25〜30サイクルで十分です。
- 6最後のサイクルの間、サンプルは162°F（72°C）で約15分間保持されます。これにより、新しいDNA鎖の突き出た端を（ヌクレオチドで）埋めることができます。この段階で、ポリメラーゼはDNA鎖の一端に余分なAヌクレオチドを追加します。
DNA分離
- 7反応が完了すると、DNAポリメラーゼ、MgCl2、プライマーなどのPCR反応物質からDNAが分離されます。これは、フェノール、EDTA、プロテイナーゼKなどの化合物を追加することによって行われます。遠心分離もこの点で役立ちます。
未来
科学者は定期的にDNA合成にPCRを使用していますが、DNA複製についてはまだ理解されていないことがたくさんあります。将来的には、関連する成分や中間体など、プロセスのいくつかの重要なステップの詳細を研究で解明する必要があります。さらに、改良されたポリメラーゼが開発される可能性があり、より小さな開始サンプルからより多くのDNAを作成することが可能になります。いつの日か、DNA合成が生物の重要な側面のいくつかを解き放ち、さまざまな癌、ウイルス、細菌感染症を治療する医薬品の開発につながることが期待されています。
製造プロセス