ナノダイヤモンド中の窒素-空孔センターの高分解能基底状態消光イメージング

概要

ナノダイヤモンド（NDs）中の負電荷窒素-空孔（^NV−）センターは、他の蛍光色素と比較して優れた光安定性と生体適合性により、細胞イメージング応用で最近研究されています。単一分子確率的局在顕微鏡や刺激放出消光顕微鏡などのサブ回折限界イメージングアプローチを用いて、NDs中の^NV−で20nm分解能の超解像イメージングが長年実証されてきました。ここでは、プローブビーム、消光ビーム、リセットビームの3ビームを用いた、NDs中のこれらのセンターの基底状態消光（GSD）ナノスコピーの最初の実証を示します。638nm消光ビームは^NV−センターを局所最小値を除くすべての場所で準安定暗状態に強制し、594nmガウシアンビームが^NV−センターをプローブし、488nmリセットビームが励起状態を再充填します。半値全幅36nmの単一^NV−センターの超解像イメージングを実証し、72nm離れた2つの隣接^NV−センターを分解能しました。GSD顕微鏡は、バルクダイヤモンドと比較してはるかに低い光パワーでNDs中の^NV−に適用されます。この研究は、超解像イメージング法での応用に合わせてNDs窒素濃度を制御する必要性を実証し、NDs中の^NV−ナノスケール相互作用研究への道を開きます。

はじめに

ダイヤモンド中の窒素-空孔（^NV−）センターは、置換性窒素と隣接空孔から構成され、将来の量子コンピュータにおける量子メモリ[1]、生きた細胞の医療イメージング[3]やニューロン活動[4]への応用を持つ高感度磁力計[2]、刺激放出消光（STED）顕微鏡やそのスピン変種、基底状態消光（GSD）顕微鏡の変種[5,6,7]、ナノメトリックスピン局在を持つ単一分子確率的局在顕微鏡（SMLM）[8]など、様々な超解像イメージング法における原子スケールプローブとして、いくつかの科学技術分野で幅広い関心を集めています。特に、蛍光顕微鏡における回折限界を打破する手法は、今日の生物医学におけるパラダイムシフトを表し[9]、ダイヤモンド中の^NV−は新規ナノプローブとしてこの分野で重要な役割を果たしてきました。ダイヤモンドの不活性、高い生体適合性、堅牢性、高い量子収率を持つ^NV−光ルミネセンスの光安定性により、生物医学とバイオフォトニクス[10, 11]、脳顕微鏡[12]、そしてナノ構造体として知られるナノダイヤモンド（NDs）[13, 14]での応用が広く探求されてきました。NDsはホストバルクダイヤモンドと類似のNV蛍光特性を保持し、ライフサイエンス超解像イメージング応用により互換性があるという利点があります[15]。しかし、現在大量生産されている蛍光NDsの形状と材料窒素ドーピングの不均一性により、バルクダイヤモンドと比較してNVの可変特性が誘発され、しばしば他の不純物をホストするため、NDsを用いた超解像イメージングは一般的にバルクダイヤモンドよりも困難です。

より高純度バルクダイヤモンドと比較してNDsに超解像手法を適用する制限は、NDs窒素濃度の不均一性、電荷トラップ、他の不純物濃度による^NV−光物理特性の変動に関連しています。

NDs中の^NV−センターのナノスケールイメージングは、20nm分解能達成のために>650mWの消光ビームパワーを用いたSTED顕微鏡で実証されてきました[16, 17]（バルクでの最大分解能は数3.7GW/cm²で達成[5]）；しかし、ナノスケール生体内細胞イメージングなどの例では光毒性を低減するために、μWオーダーの光強度でナノスケール分解能を達成するイメージングモダリティが必要です。NDsは細胞ラベリングを可能にする利点があり、バルクプラットフォームでは不可能で、SMLMを用いた磁場の超解像イメージングに使用されてきました[18]。これはSTEDやGSD顕微鏡より光毒性が低いです。バルクダイヤモンド中の^NV−のGSDを用いた以前の超解像イメージングは、532nmの高強度ビームでセンターを発光状態に励起し、基底状態を消光することで達成されました；したがって、基底状態消光は励起状態を経由して起こります[7]。しかし、このアプローチも超解像達成に非常に高い光強度（数GW/cm²で<10nm分解能達成）と、ポジティブ画像達成のためのイメージング再構成アルゴリズムを必要としました[19]。ピコ秒パルスレーザーを用いた^NV−の中性電荷状態（^NV0、ゼロフォノンライン575nm）への電荷変換誘起による低電力超解像は、バルクダイヤモンドで電荷状態変換（CSD）消光ナノスコピーとして知られています[20, 21]；しかし、消光ビーム平均電力1mWで12nm分解能達成し、メカニズムは材料依存的で、超低窒素濃度（5ppb未満[21]）、一般に電子グレード化学気相成長バルクダイヤモンドで達成されます。

^NV−センターのバルクダイヤモンドにおけるGSDナノスコピーの代替アプローチでは、長寿命準安定状態を用いて、はるかに低いパワーで基底状態を消光しました。これはRef.[22]で最初に提案され、Ref.[23]で有機染料Atto532を用いた哺乳類細胞で初めて実証されました。

GSDの原理は、ツービームアプローチで蛍光マーカーの蛍光を非活性化することです。第1ビームは励起またはプローブビームで、蛍光体を励起状態に励起し、第2ビームは阻害ビームで、蛍光をオフにします。蛍光の非活性化は、蛍光体の個体数を準安定状態または長寿命三重項状態に一時的に棚上げすることで達成されます。シングレット準安定状態と三重項状態間の光学遷移はスピンフリップを必要とするため、光学的に抑制されます[23]。

Ref.[24]では、CW赤色レーザー（638nm）から25〜200μW光パワーでセンターを連続的にポンピングし、^NV−を長寿命準安定状態に個体数移動させることで非蛍光状態に導き、基底状態を消光しました。一方、青色レーザー（476nm）を用いて暗い準安定状態を空にし、より高エネルギー状態への遷移を誘起しました。ここでは638nmレーザーも励起に使用されます（効率的ではないが）、その後準安定状態に棚上げします。^NV−は青と赤両方のレーザーで励起されたときのみルミネセンスを示しました。5mW消光レーザーパワーで16nm分解能達成し、これはSTEDや以前のGSDで使用されるものよりはるかに低いです。この方法の1つの可能な制限は、窒素含有量が少ないまたは多い異なるタイプのダイヤモンド、さらにはNDsでの準安定状態特性への依存性であり、適用性を制限する可能性があります。Ref.[24]では、バルクダイヤモンドはタイプIIa光学グレードダイヤモンドで、窒素濃度500ppmに対応し、CSD[21]で依存する低窒素濃度（<5ppb）よりはるかに高いです。Ref.[21]で報告された、Ref.[24]の暗状態が^NV−の中性電荷状態であるという主張は、高窒素濃度ではNV^−/0電荷変換が抑制される[25]ことと、NVが主に負電荷状態にあることを考慮していません；さらに、測定された暗状態寿命は非常に長く、電荷変換プロセスに帰属できません。実際、CSDは商業用蛍光NDs（高圧高温、HPHT、ダイヤモンド由来）ではまだ証明されていません。これは高窒素濃度、他の欠陥による電荷不安定性、材料制御不足による光物理的可変特性が原因です。

GSDナノスコピー確立のメカニズムも、CSDがNDsで起こり得ないという仮説により、NDs中の^NV−センターではまだ報告されていません。

本論文では、NDsでGSDが実行可能であることを示し、GSDとCSD法がダイヤモンド窒素濃度に依存し、それぞれ高および低窒素ドープダイヤモンドで達成されることを証明し、特定の超解像とスピンセンシング法のためのNDs材料エンジニアリングの必要性を促しています。

本論文では、長寿命準安定状態に電子を棚上げすることで達成される類似のオン/オフ蛍光スイッチングメカニズムを用いた、3ビームアプローチと300μWで励起状態を完全に消光し最大分解能を達成する、NDs中の^NV−センターへのGSDナノスコピー実証を行います。ここでは、以前考えられていたように[24]、NDs中の^NV−特性がこの方法の適用性を制限しないことを示します。さらに、以前SMLM[26]とSTED顕微鏡[17]で示されたように、同一NDs内の2つの^NV−センターを区別できました。

我々の研究における基底状態消光メカニズムがCSDではなく長寿命準安定状態によるものであることを実証するため、NV^−/0電荷状態変換に関連する主要な最近の結果を要約します。この光誘起電離、NV^−/0電荷状態の再結合に関しては、励起波長依存性であることが徹底的に研究され見出されています[27, 28]。赤色（または青色）レーザー励起による電荷状態スイッチングで、赤色励起がNV⁻を中性電荷状態にスイッチングするために使用されます。低レーザーパワーで起こるこの高速スイッチングは、電荷状態消光ナノスコピー[21]と確率的光学再構成ナノスコピー[8]の実装に使用されましたが、窒素濃度が良好に制御され一般に低温成長により非常に低い化学気相成長バルクダイヤモンドでのみです。NVの電荷変換に基づく励起波長によるこのスイッチングダイナミクスはNDsでは観察されませんでした[18, 26, 29]。そこでは、製造プロセス中の機械的損傷（一般に高窒素濃度マイクロダイヤモンドの粉砕）による電荷トラップや酸化[26, 29,30,31]、または他のアクセプター不純物との近接[18, 32]に関連する効果により点滅が生じ、NV^−/0電荷変換とは関連しません。また、NV⁻電荷変換がダイヤモンド格子内の電子ドナー不純物濃度、すなわち窒素濃度に強く依存することも実証されています。負電荷状態から中性電荷状態への変換は、ドナー不純物（窒素）高濃度で抑制されます[25]。実際、ドナーとアクセプターをダイヤモンドに使用してNV電荷状態を安定化することが提案されています[33]。これらの研究のほとんどはバルクダイヤモンドで実施され、最近の研究[34]のみが、低温でのNDs成長がより低い窒素取り込みを許容し、その結果NDsが純粋バルクダイヤモンドのように振る舞い、赤色（または青色）レーザー励起で強い電荷状態スイッチングを示し、高温成長でより多くの窒素不純物を取り込むとこの電荷変換が著しく抑制されることを示しました。

我々のNDsでは、レーザー波長励起によるNV^−/0電荷変換は観察されず、暗状態を確かに以前と同様に準安定状態に帰属します[24]、またここで使用されたNDsの大きなサイズ（〜100nm）、表面電荷状態による点滅なし、そして何より重要なことに高窒素濃度を考慮してもそうです。ここで研究されたNDsは、少なくとも不均一な500ppm窒素濃度を持つHPHTマイクロダイヤモンドから商業的に派生しています。Ref.[24]の準安定状態もその非常に長い寿命150秒によって証明されています。

^NV−センターは一般に532または561nmで最も効率的に励起され、637nmにゼロフォノンラインを持ち[35]、これは三重項基底状態と励起状態間の遷移に対応し、主にスピン保存遷移です。さらにシングレット準安定状態が存在し[36]、センターは非放射崩壊でこれを経由します。NDs中の^NV−光学遷移寿命は約22ns[37]で、バルクダイヤモンドの12ns[35]より長いです。

594nm励起（プローブ）ビームが基底状態から励起状態への遷移を促進し、638nm消光ビームが^NV−センターの電子を励起状態から非放射的系間交差で準安定状態に一時的に棚上げします（図1a）。594nmをプローブとして使用することは、緑色（通常532または561nm）と比較して暗状態個体数への最小限の変更によって正当化されます[24]。この方法は系間交差を効果的に飽和させ、基底状態を空にし、594nmでプローブされたときの^NV−センターの励起状態への励起とその後の蛍光放出を防止します。最終的に、488nm青色レーザーが励起状態を再充填し、基底状態へのその後の高速（ns）崩壊を阻害します[38]。

a NDs中の^NV−におけるGSDの原理。594nmプローブビーム（黄）、638nm消光ビーム（赤）、488nmリセットビーム（青）を使用。GS基底状態、ES励起状態、MS準安定状態。ナノダイヤモンド中のNVセンター図解。 b 実験セットアップの模式図。システムは488nm、594nm、638nm波長で動作する3レーザーを持つ自作共焦点顕微鏡で構成。ボルテックス位相板で638nm消光ビームをドーナツビームに空間エンジニアリングし、回折限界領域周辺のみを消光。 c 各レーザーのパルス到着時間測定によるアコースティックオプティックモジュレータの特性評価。 d GSDナノスコピーで使用したパルスシーケンスの概略。検出ウィンドウは594nmプローブビームに同期し、関連蛍光のみ収集。594nmプローブビームパルス長は20μsに最適化（より短いと平均化時間増加、より長いと超解像イメージング効率低下）。488nmリセットビームは20μsに最適化（全体パルスシーケンス時間短縮のため可能な限り短くするが、長寿命準安定状態を効果的に空にする）

STEDと同様に、消光ビームは横断面でドーナツビームに空間エンジニアリングされ、超解像イメージングを達成します[24]。GSDナノスコピーの分解能dは式[23]に従います：

$$d \approx \frac{\lambda }{{[2\left( {NA} \right)\sqrt {1 + I_{{\text{D}}}^{\max } /I_{{\text{s}}} ]} }}$$ (1)

NAは対物レンズ数値開口数、\(I_{{\text{s}}}\)は蛍光半分が消光される飽和強度、\(I_{{\text{D}}}^{\max }\)はゼロを境界とするピークの最大強度値を表します。

ND中の単一^NV−センターで、消光ビーム強度に依存して36nmのイメージング分解能を測定しました。さらに、72nm離れた2つの^NV−センターを分解能しました。本研究は、^NV−センターを含むNDsをバイオマーカーとして、生きた細胞内での蛍光ナノスコピーに有望です。

実験方法

この実験では、公称100nmサイズの高圧高温（HPHT）NDs懸濁液[39, 40]を酸洗浄し、MilliQ溶液で希釈して使用しました。NDs溶液20μl（MilliQ水で1:200希釈）を酸素プラズマアッシャーで洗浄したホウケイ酸ガラスカバーガラスに滴下し、空気中で乾燥させました[37]。GSDナノスコピー実験セットアップは、488nmと638nm波長の2つの連続波ダイオードレーザーと、594nm波長の連続波ヘリウム-ネオン（HeNe）レーザーを持つ自作共焦点顕微鏡で構成されました。各ビームパスにアコースティックオプティックモジュレータ（AOM）を設置し、連続光ビームから光パルスを生成し、相互に同期させました。AOM通過後、空間フィルターで空間ビームプロファイルをクリーンアップしました。第2レンズで各ビームを平行光にし、さらに伝播させました。まず、488nmと638nm波長レーザービームを532nmロングパスレーザーフラットダイクロイック（Semrock-LPD01 532R）で空間重ね合わせしました。第2ダイクロイック（Semrock-R405/488/543/638）で、488nmと638nm波長を反射し、594nm波長を透過させることで3ビームすべてを空間重ね合わせしました。638nm波長消光ビームの空間ビームプロファイルを位相板でドーナツビームにエンジニアリングしました。さらに、対物レンズ前に1/4波長板を配置し、消光ビームの円偏光を確保しました。高数値開口数（NA=1.4）油浸対物レンズでNDsをイメージングしました。ダイクロイック（Semrock-LP02-671RU-25）で^NV−センター蛍光を励起波長から分離し、シングルモードファイバー（ピンホールとして機能）を介して単一光子アバランシェダイオード（SPCM-AQRH-14FC）検出器にリダイレクトしました。光学セットアップの模式図を図1bに示します。

平均サイズ40nmの金ナノ粒子をガラスカバーガラスに滴下し、消光ビーム空間プロファイルを調査しました。中心に局所最小値を持つ高強度リングを持つドーナツ形状ポイントスプレッド関数を観察しました（図1bインセット）。

まず各レーザーパルスの時間応答を調査しました。AOMはLabVIEWで制御され、マルチチャネルパルスジェネレータ（PulseBlasterESR-PRO）が各レーザービームの個別時間特性と3ビーム間タイミングを制御しました。各レーザーの光路長が異なるため、同時に生成された光パルスが検出器にわずかにオフセットした到着時間を持ちます。これにより、サブマイクロ秒タイムスケールで3レーザービームすべての時間制御が可能です。

励起ビームで60nsの立ち上がり/立ち下がり時間を測定しました（図1c）。594nmと638nm波長光パルスが、488nm波長パルスに対してそれぞれ85nsと155nsの分離で到着しました。各レーザーパルスは、^NV−センター、ND中の他の不純物、ガラスカバーガラス内欠陥など、いくつかの異なるソースから発生する蛍光を生成します。励起ビームによって生成される蛍光のみがGSDイメージングに関連します。他のレーザーパルスからの蛍光は蛍光画像のノイズに寄与します。そのため、タイムゲーティングを導入し、プローブビーム以外のレーザーパルスで生成される蛍光を除去しました。これはプローブビームパルス到着時間で検出をゲートすることで達成され、他の蛍光ソースを効果的にフィルタリングし、イメージングの信号対雑音比を向上させます。

GSDナノスコピーの典型的パルスシーケンスと検出ウィンドウを図1dに示します。^NV−センター蛍光のオフは、638nm波長消光パルスで電子を長寿命状態に棚上げすることで達成しました。^NV−センターのサブ回折領域励起は594nm波長パルスで提供し、488nm波長パルスで^NV−センターを励起状態にリセットしました。パルスシーケンスを500〜1000回繰り返し、高信号対雑音比を確保しました。パルス長はプローブビーム（594nm）とリセットビーム（488nm）で10〜20μs範囲でした。消光ビーム最適パルス長は〜300μsと判明しました（図2d）。ビームパルス持続時間の最適化はRef.[24]に基づきます；しかし、最終分解能改善のためにより系統的な最適化を実施すべきです。分解能は阻害ビームパルス持続時間に依存すると予想され、これは準安定状態寿命によって制限されます。

a 638nmと488nm励起による単一^NV−センター蛍光。両レーザーが空間重ね合わせで^NV−センターを同時に励起すると検出蛍光増加。 b 消光パワー依存蛍光。インセットにパルスシーケンス図示。蛍光は594nmプローブレーザーオン時のみ検出。 c ^NV−センターのアンチバンチング曲線、ゼロ遅延時間で2次相関関数<0.5示す

結果と考察

638nmと488nm波長レーザー光源で^NV−センターを励起し、オン/オフスイッチングメカニズムを調査しました（図2a）。2ビームが空間重ね合わせしたときのみ^NV−センター蛍光放出増加が検出されました。この放出振る舞いは、638nm波長ビームが電子を長寿命状態に優先的に棚上げし、488nmビームが自発放出を許容すると仮定して理解されました（図1a）。NDsでの^NV−センター長寿命状態寿命はバルクダイヤモンド準安定状態寿命（測定150秒）[24]より短く（NDsでの唯一測定はref.[38]の33-127ns、シングレット状態遷移は300ns[41]）、励起状態寿命[37]よりはるかに長いと仮定しました。

単一^NV−センターをアンチバンチング（図2c）測定で選択し、ドーナツ形状で蛍光を効果的にクエンチするために必要な消光ビームパワーを研究しました[42]。594nm波長ビームを追加し、単一^NV−センターがオン状態かオフ状態かをプローブしました。図2bは選択された^NV−センターの消光ビーム強度依存蛍光を示します。蛍光の急速な減少を観察しました。151.2μW消光パワーで、^NV−センターが効果的にオフになりました。

ここでは、我々の知識では初めて、NDsへのGSDナノスコピー適用による単一^NV−センター超解像イメージングを実証します。

GSDによる超解像達成のため、集光励起ビームでカバーされるすべてのエミッターが、ドーナツ形状消光ビームとの重なりによりセンターを長寿命暗状態に移動させることで、サブ回折サイズ領域を除いて一時的にオフにされます。得られる分解能は、センターが「オン」になる焦点面プロファイルで定量化でき、式(1)に従ってスケーリングします。ここで\(I_{s}\)は関与状態寿命と光学スイッチオフ遷移阻害断面積に逆比例します[43, 44]。

図3aは、ND中の単一^NV−センター超解像蛍光画像を示します（図2c）。x方向半値全幅（FWHM）57nm、y方向42nm（図3c）。

a GSDナノスコピーベース超解像^NV−センター蛍光画像。ドウェルタイム10ms、2nmピクセルサイズ。 b 消光パワー関数としての横分解能。実験と理論の不一致は、ホスト材料の不完全さとNDs局所環境変化がバルクダイヤモンドと比較して生じることが主因。理論はバルクダイヤモンド中NVセンター基準。 c x軸とy軸に沿った画像断面プロファイル、それぞれFWHM分解能57nmと42nm。実線は最良フィット

消光パワーと分解能の関係を図3bに示します。理論曲線は式(1)に基づきます。実験データで^NV−センター蛍光抑制に必要な追加パワーは、NDホスト局所環境とバルクと比較したより短い準安定状態寿命[38]に起因すると考えられます。最大分解能42nmが2.2mWで達成されるのに対し、Ref.[24]では16mWで12nm分解元達成し、消光ビームピーク強度12MW/cm²に対応します。

さらに、GSDナノスコピーを適用し、近接した2つの^NV−センターのナノスケールイメージングを実証しました。図4aは^NV−センター共焦点画像を示します。GSDナノスコピー下で、2つの単一^NV−センターがナノスケール分解能でイメージングされます（図4b）。2つの^NV−センター間の中心間距離は72nmです（図4c）。y方向での2つの分解能^NV−センターFWHMはそれぞれ36nm（図4d）と38nm（図4e）です。ND長軸と分解能^NV−センター間のミスアライメントは、共焦点画像スキャン中のメカニカルドリフトに起因すると帰属しました。

a 500×500nm共焦点蛍光マップ（ドウェルタイム2ms、1nmピクセルサイズ）と b 白枠の超解像画像300×300nm（ドウェルタイム24ms、1nmピクセルサイズ） b 2つの^NV−センター。個々の共焦点スポットが超解像で2つの別個の薄い蛍光スポットに分解。 c X軸断面、2ピーク間72nm分離、2NVセンター中心間距離に対応。 d Y軸断面、測定FWHM分解能36nmと38nm、それぞれbの^NV−1と^NV−2に対応

結論

本研究では、ナノダイヤモンド中の^NV−センター準安定状態を用いたGSDナノスコピーを実装し、^NV−センター超解像イメージングを示しました。FWHM36nmで単一^NV−センターが分解能されました。消光ビーム強度に関する分解能スケーリングも示し、最大超解像は2.2mW消光パワーで達成されました。さらに、72nm離れた2つの^NV−センターが分解能されました。この結果は、近接^NV−センター間の双極子結合研究[45]、^NV−スピン特性ベース高空間分解能量子センシング[6, 18, 46,47,48]、バルクダイヤモンドベース多機能センシング応用[49]のNDs拡張[50]などの可能性を開きます。

本論文ではまた、ダイヤモンド窒素濃度が超解像のためのGSDとCSDメカニズムの基礎にあり、それぞれ高および低窒素ドープダイヤモンドで達成されることを示しました。したがって、特定手法向けエンジニアリングNDsが続くべきです。CSDは低窒素濃度によりスピンセンシングにより容易に適用可能と理解されます；しかし、NV⁰電荷状態がCSD量子センシング特性を制限する一方、窒素以外のドナーで^NV−電荷状態を安定化すれば、スピン量子センシングに適用したGSDの感度をはるかに高められる可能性があります。

NDs中の^NV−センターGSDナノスコピーは、バルクダイヤモンドと比較して光強度で低パワー（〜300μW）を使用し、生物学的サンにより適しています。GSD分解能は、最適窒素ドーピング決定[34]、表面パシベーションと他の不純物がNDs中^NV−準安定状態寿命に与える影響研究、光ルミネセンス不純物の少ないNDsエンジニアリングにより改善可能です。

スピンセンシング関して、現在商業的に利用可能なHPHT由来および高窒素含有マイクロダイヤモンド由来NDsの高窒素濃度は、光検出磁気共鳴コントラスト低下によりスピン感度を制限しています[34]。したがって、デコヒーレンス導入なしで^NV−電荷状態安定化のために他のドーパントを検討すべきです[50, 51]。

最終的に、この方法をマイクロ波励起[18, 52,53,54]と組み合わせれば、現在NDs材料特性がこの応用向けにより良くエンジニアリングできれば、ライフサイエンスでの超解像光磁気イメージングの代替アプローチを提供できる可能性があります。