ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の調製とLPS誘発性H9c2細胞損傷の治療におけるそれらの応用

要約

親水性ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（mPEG）を無水コハク酸によってイカリイン（ICA）にグラフトして、ポリエチレングリコール-イカリイン（mPEG-ICA）ポリマーを形成しました。ポリマーの構造は、フーリエ変換赤外分光法（FT-IR）と核磁気共鳴分光法（NMR）によって特徴づけられました。 ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子は、透析によるICAの物理的埋め込みによって調製されました。粒子サイズは（220±13.7）nmであると決定され、ζ電位は動的光散乱（DLS）によって（2.30±1.33）mVでした。透過型電子顕微鏡（TEM）の下では、ナノ粒子は球状であり、形態は規則的でした。 pH 7.4の培地では、mPEG-ICAナノ粒子の薬物放出率は72時間以内に（52.80±1.70）％に達しました。 pH 6.8では、ナノ粒子の累積薬物放出は48時間以内に（75.66±0.17）％に達しました。 LPSで処理したH9c2細胞でナノ粒子を処理すると、細胞の生存率が維持され、LDHの放出が減少し、抗アポトーシス効果が発揮されました。さらに、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子は、心筋の炎症性サイトカインであるTNF-α、IL-1β、IL-6MのmRNA発現を有意に減少させました。結論として、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子は、LPSによって誘発されるH9c2細胞の損傷から保護されました。

はじめに

炎症反応は、心室リモデリングの病理学的プロセス全体に関与し、心臓損傷後の心臓病の合理的なリモデリングの主な理由です[1、2]。腫瘍壊死因子（TNF）-a、IL-1β、IL-6およびIL-18を含むこれらの炎症性サイトカインは、心筋傷害および長期の病理学的リモデリングを引き起こします[3]。心筋細胞が損傷すると、HMGBIなどのDAMP（損傷関連分子モデル）を放出して、内皮細胞を活性化してケモカイン受容体を発現させ、炎症性因子を生成し、心筋細胞の壊死またはアポトーシスを誘導することもできます[4、5]。さらに、HMGBは、CXCL12 / CXCR4を介して損傷した心臓にマクロファージや好中球などの炎症細胞の蓄積を促進し、心臓の負担と損傷を悪化させます[5]。したがって、炎症反応の活性化をブロックすることは、心臓の病理学的リモデリングを減らすための効果的な戦略として使用できます。

イカリイン（ICA C ₃₃ H ₄₀ O ₁₅ ）は、中国の薬草エピメディから抽出されたリポソーム化合物です[6]。広範な研究により、ICAは免疫調節剤、心臓保護剤、抗酸化剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤として有望であることが示されています[7、8]。 ICAの肯定的な特性にもかかわらず、低い水溶性、短い半減期、低い経口バイオアベイラビリティなど、その適用を制限するさまざまな要因があります[9]。ナノキャリアは、標的への直接的な有効性、抗炎症、心臓保護を強化するための新しい戦略になりました。さらに、ナノキャリアはICAの欠点を克服することができます[10、11]。

最近、研究者はドラッグデリバリーシステムに焦点を合わせています[12]。ミセル[13]、リポソーム[14]、カーボンナノチューブ[15]など、さまざまなナノキャリアが開発されています。心血管疾患の死亡率と罹患率を減らすには、十分なICAを搭載した新しいナノ投与フォームを設計し、標的指向性の放出特性を持たせることが急務です。

ICAアプリケーションの制限を克服するために、キャリアとしてポリエチレングリコールモノメチルエーテル（mPEG）を使用しました[16、17]。 mPEGはポリエチレングリコールの誘導体であり、PEGよりも安定した化学的性質と強い親水性を持っています[18]。ただし、mPEGの末端ヒドロキシル活性は非常に小さいため、薬物をロードしたナノ材料としてのmPEGはヒドロキシル活性化を受ける必要があります。したがって、疎水性末端としてICAを使用し、化学結合の親水性末端としてmPEGと無水コハク酸のエステル化によって形成されたカルボキシルmPEGを使用しました。形成されたエステル結合は、酸性条件下で開裂を加速する可能性があります。

ナノ粒子は、不溶性薬物の薬物送達[19]、高分子薬物[20]、および遺伝子治療[21]において独自の利点を持っています。腫瘍組織と同様に、心筋の炎症部位は同様の透過性および保持機能（EPR）を持っています[22]。サイズが約200nmのナノ粒子は、間質ギャップを貫通して薬物の濃縮を実現できます[23]。 mPEG-ICA NPは初期段階で調製され、心筋虚血における役割が確認されましたが、ICAの負荷が不足しているため、最良の効果を得ることができませんでした[24]。したがって、化学合成と物理的捕捉の組み合わせによって調製された新しい種類のICA負荷mPEG-ICAナノ粒子は、ICAの水溶性と薬物負荷を改善するだけでなく、心筋炎におけるナノ調製物の徐放時間を延長し、効果的に改善することができます薬物の生物学的利用能、ICAによるLPS誘発性H9c2細胞損傷の標的治療の最良の効果を達成します。 pH7.4および6.8のPBS溶液中のICAをロードしたmPEG-ICANPからのICAの放出を研究しました。さらに、心筋炎に対するmPEG-ICAナノ粒子の効果を研究するために、リポ多糖（LPS）を使用してH9C2細胞を誘導し、外部炎症モデルを確立し、細胞生存率、アポトーシス率、および炎症性サイトカインのmRNA発現を検出し、心筋炎の過程におけるICA負荷mPEG-ICAナノ粒子の薬力学的効果。

材料と方法

実験楽器

以下を使用しました：電子天秤JA302（上海朱漢計測器株式会社）。ロータリーエバポレーターRE52CS-1（上海ヤロン生化学機器工場）;デジタルディスプレイ定温マグネチックスターラー78HW-1（杭州計器モーター株式会社）;電気ブラストドライヤー101-OA（天津テレスター計器株式会社）;フーリエ変換赤外分光計NEXUS670（Neliko Co.、Ltd。）; UV-Vis分光光度計（Beijing Leiboteke Instrument Co.、Ltd。）;透過型電子顕微鏡（TEM Glacios）;超音波分散抽出装置ウォーターバスオシレーターJP-010S（China Jiemeng Co.、Ltd。）;リアルタイム蛍光定量PCR装置;多機能酵素標識装置;倒立顕微鏡（オリンパス社）蛍光顕微鏡（ライカ、ハイデルベルク、ドイツ）;二酸化炭素セルインキュベーター（Thermocompany）。

実験試薬

以下を使用しました：試薬名純度/仕様/製造バッチ番号（メーカー）：イカリイン（95％/ 1 g / DL070208 Sahn Chemical Technology Co.、Ltd。）;リポ多糖（モデル055-100 g / Z06J9Y52452 B5 25 mg Sigma Co.、Ltd。）;ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（Analytical Pure / 250 g / MKBT7172 V、Sigma Co.、Ltd。）;ジクロロメタン（Analytical Pure / 500 mL / 20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co.、Ltd。）; 4-ジメチルアミノピリジン（Analytical Pure / 100 g / L170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.、Ltd。）; N-ヒドロキシスクシンイミド（生物学的試薬/ 100g / RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co.、Ltd。）;ゲノムcDNA合成プレミックスキットの最初の鎖を除去するためのFastKingワンステップ法（Tiangen Biotechnology Co.、Ltd。）;アポトーシス検出キット（Biyuntian）; SYBR Green蛍光定量キット（QIAGENGmbH社）。

mPEG-COOHの合成

mPEG（5.00 g）、無水コハク酸（SA、0.40 g）、4-ジメチルアミノピリジン（モル比1：1.5 / 1.5、0.50 g）を秤量し、250mLの丸底フラスコに入れました。 50ミリリットルのジクロロメタンを加え、還流し、60℃で2時間撹拌しました。ジクロロメタンを35℃で半日ロータリーエバポレーターで除去し、白色の固体を得て、エーテル残留物が現れなくなるまで室温および大気圧で半日保持した。粉末を50mLの二次蒸留水に溶解し、2 kDaの透析バッグで48時間透析し、水を常に交換しました。溶解したSAを除去し、溶解していない物質をろ過して除去しました。カルボキシル化mPEG（mPEG-COOH）は、ろ液を凍結乾燥して秤量することにより得られました。

mPEG-イカリインポリマーの合成

mPEG-COOH（0.37 g）、 N -ヒドロキシスクシンイミド（0.024 g）と4-ジメチルアミノピリジン（0.026 g）を250 mLの丸底フラスコで秤量した後、10 mLの脱水ジメチルスルホキシド（DMSO）を溶媒として添加し、室温で半分攪拌しました。カルボキシル基を活性化する1日。次に、100 mgのイカリイン標準液を小さなチューブに入れ、水を除去した5mLのDMSOを添加して標準液を完全に溶解しました。次に、標準サンプルを丸底フラスコに加え、窒素ガスを保護しながら室温で48時間撹拌しました。二次蒸留水で連続透析した後、標準サンプルにはDMSOが含まれていなかったため、UVを使用してDMSOの除去を確認しました。次に、透析した材料を真空凍結乾燥機で48時間凍結乾燥し、淡黄色の生成物、つまりmPEG-ICAポリマーを得ました。

ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子（NP）の準備

mPEG-ICA（5 mg）を小さなチューブに量り取り、2 mLのDMSOに溶解した後、37°Cの水中で5分間振とうしました。 5ミリグラムのICAを適切な量のDMSOに溶解し、小さなビーカーに入れ、mPEG-ICAをゆっくりとDMSOに加えて溶解し、5mLの蒸留水を加えました。次に、溶液をマグネチックスターラーで室温で15分間撹拌しました。次に、反応物を3500透析バッグで透析し、水中で24時間透析しました。その間、水を絶えず交換し、DMSO溶媒をきれいに透析し、ろ過後にICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子を取得しました。

フーリエ変換赤外分光法

適切な量の標準ICA、mPEG-COOH、およびmPEG-ICAポリマーを瑪瑙乳鉢で粉末に粉砕し、適切な量の乾燥KBr粉末と混合し、微粉末に粉砕しました。タブレットをプレスした後、混合物を4000〜4400 cm / mol ^-1 のスキャン範囲でフーリエ赤外分光計でスキャンしました。、およびその赤外線スペクトルが記録されました。材料の特性評価にはICAとmPEG-COOHを使用し、製品の特性評価にはmPEG-ICAポリマーを使用しました。

核磁気共鳴水素スペクトル

ICA、mPEG-COOH、およびmPEG-ICAポリマーを重水素化ジメチルスルホキシド（DMSO-d6）に溶解し、ローターに挿入されたサンプルチューブにロードしました。次に、サンプルを500 MHzの核磁気共鳴分光計に配置し、サンプリングパラメータを設定しました。

UV-Visスペクトル

イカリイン標準液（4.0 mg）を25 mLメスフラスコに加え、メタノールをスケールに加えてから、振とうして透明になるまで溶解しました。次に、イカリイン標準溶液の0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、および2.5 mLのアリコートを25mLメスフラスコで正確に測定し、メタノールを加えて容量を調整しました。次に、溶液の吸光度値を、ブランクコントロールとしてメタノールを使用して、270 nmの波長（最大吸収波長）で紫外分光光度計で測定しました。データは線形回帰を生成するために記録されました。

mPEG-ICAポリマー（4.3 mg）を、25 mLのメスフラスコで正確に秤量し、メタノールをスケールに加えました。溶解して清澄化するまで溶液を振とうした。次に、2.0 mLのサンプル溶液を3回正確に測定し、25 mLのメスフラスコに溶解し、メタノールで容量を調整しました。次に、溶液の吸光度値を、ブランクコントロールとしてメタノールを使用して、波長270 nm（最大吸収波長）で紫外分光光度計で測定し、データを3回記録し、平均を取りました。次に、イカリインの含有量を計算しました。

上記の方法で調製したICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子を、容量25 mLのフラスコに入れ、メタノールを加えてスケールを調整し、溶液が溶解して透明になるまでフラスコを振とうしました。次に、2.0 mLのサンプル溶液を3回正確に測定し、25 mLのメスフラスコに溶解し、メタノールで容量を調整しました。次に、溶液の吸光度値を、ブランクコントロールとしてメタノールを使用して、波長270 nm（最大吸収波長）で紫外分光光度計で測定し、データを3回記録し、平均を取りました。データは、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の平均ICA含有量を計算するために収集されました。

ICAをロードしたmPEG-ICANPの特性評価

動的光散乱検出

動的光散乱粒子サイザー（DLS; zetasizer 3000hs、Malvern Instruments、Malvern、UK）を使用して、ICAをロードしたmPEG-ICANPの粒子サイズ分布と電位を測定しました。新しく調製したmPEG-ICAおよびICAをロードしたmPEG-ICANPを凍結乾燥し、蒸留水に再分散させ、比色カップに注ぎ、動的光散乱粒子サイズアナライザーのサンプルプールに入れて検出しました。各サンプルは3回分析されました。

TEMによる形態の観察

ICAをロードしたmPEG-ICANP（1.0 mg / mL）溶液を、カーボンフィルムと濾紙を備えた銅メッシュに滴下して乾燥させました。グリッドを乾燥機に置き、2％（w / w）リンタングステン酸を加え、10分間自然乾燥させました。次に、ICAをロードしたmPEG-ICA NPの形態学的特性を、透過型電子顕微鏡により80kVの加速電圧で観察しました。

安定性の測定

調製したICAをロードしたmPEG-ICANPを、真空凍結乾燥機で5％マンニトールを使用して48時間凍結乾燥した後、凍結乾燥したナノ粒子を再蒸留水に再溶解して、粒子サイズとPDI値の変化を検出しました。。

薬物の負荷と捕捉効率の決定

1.8mLのICAをロードしたmPEG-ICANP溶液を10mLのメスフラスコで正確に測定し、0.2 mLのDMSOを加え、2分間超音波を行いました。溶液の吸光度を270nmで測定し、同じ溶媒を含むmPEG-ICAポリマーをブランクとして使用しました。決定されたサンプルの吸光度を検量線の式に代入し、イカリイン含有量を計算しました。 DMSO / H ₂内 O =1/9溶媒システム、イカリインの準曲線方程式を270 nmで測定し、ナノ粒子の薬物負荷（EE％）と捕捉効率（LC％）を計算しました。

薬物負荷（EE％）=ナノ粒子の薬物質量/薬物負荷ナノ粒子の総質量×100％
カプセル化率（LC％）=ナノ粒子の薬物質量/投与量×100％。

invitroでの薬物放出

5ミリリットルの遊離ICA、mPEG-ICAポリマー、およびICAをロードしたmPEG-ICA NPを透析バッグ（3500 kDa）に入れ、両端を固定し、25 mLのPBS（放出媒体）で37°Cおよび100 rpmの超音波振動（pH =7.4）。所定の期間内に2ミリリットルが除去されました（Tn、 n =0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、および72時間）、同じ量の新しい溶液と交換します。 UV-Vis分光光度法を実行して、さまざまな時間での270nmでの透析液の吸光度を測定しました。 ICA放出のパーセンテージ比は記載されているように計算され、平均薬物放出を計算するために3つのサンプルが測定されました。透析液の含有量は検量線法で測定し、invitroで3回放出試験を繰り返しました。

薬物放出の式は Q です。％=（ C _n × V + V _n Σⁿ _{t =0} C _i ）/（W _NP ×LC％）、ここで、WはNPの重量、LC％はナノ粒子の薬物負荷、 C _n はTnでのサンプル濃度、Vは放出媒体の総生成物（25 mL）、Vnはサンプル重量（2 mL）、 C _i T です _i （ i =0、0.5、1、…。、 n h 、 V ₀ = C ₀ =0）。

さまざまなリリースメディアでのmPEG-ICA-ICANPのリリース

2ミリリットルのICAをロードしたmPEG-ICANP溶液を透析バッグ（4〜88 kDa、分子量カットオフ値）に入れ、pH7.4およびpH6.8のリン酸緩衝生理食塩水（PBS放出培地、37°C、25 mL）。次に、サンプリングのために2 mLの放出媒体を収集し、所定の間隔（Tn、 n ）で同じ容量の新しい溶液と交換しました。 =0、0.5、1、2、4、8、12、24、および48時間）。さまざまな時間での270nmでの透析液の吸光度は、UV-Vis分光光度法によって決定されました。 ICA放出のパーセンテージ比を計算し、3つのサンプルを測定して平均薬物放出を計算しました。

セルテスト実験

ラット心室筋芽細胞株であるH9c2（ラットH9c2）は、中国の上海生化学細胞生物学研究所から購入しました。細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco、USA）を含むDMEMで、37°C、CO ₂で培養しました。 -含有雰囲気。 H9c2細胞は通常10cmの培養皿に接種されました[25]。細胞が約80％に成長したら、0.25％トリプシン（Gibco）で継代培養しました。次に、以下の研究のために、細胞を対応する培養皿または96ウェルプレートに播種しました。

LPSまたはICAナノ粒子による細胞処理

H9c2細胞は、次のように5つのグループに分けられました。（1）コントロールグループ：通常の培地を使用、（2）LPSグループ：細胞を10 mg / LLPSで24時間処理しました。（3）ICAグループ：細胞を20μmol/ LICA（1：1000、DMSO）および10 mg / L LPSで同じ期間処理しました。（4）mPEG-ICAポリマーグループ：細胞を20μmolで処理しました。 / LmPEG-ICAポリマーと同じ期間のLPSの同じ最終濃度。（5）ICAをロードしたmPEG-ICA NPSグループ：細胞を20μmol/ LICAをロードしたmPEG-ICANPと10mg / L LPSで処理し、その他の条件は上記のグループと同じです。

MTT

LPS誘導心筋細胞傷害に対するICAナノ粒子の細胞生存率はMTTによって決定されました。簡単に説明すると、H9c2細胞をLPSとさまざまなICAナノ粒子で24時間処理しました。その後、細胞を最終濃度0.5 mg / mLのMTTで37°Cで4時間染色し、150μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加して甲状腺結晶を溶解しました。マイクロプレートリーダー（* / SpectraMax i3 Molecular Devices、アフガニスタン）で570nmの光学密度を測定しました。

乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出

LPSによって誘発されるH9c2損傷に対するナノICAの影響を調査するために、培地中のLDH放出を評価しました。簡単に説明すると、24時間の対応する処理に従って、培地を収集し、LDH検出キット（Beyotime Biotechnology）のプロトコルに従ってLDHを検出しました。最後に、分光計を使用して490nmでOD値を測定しました。

Hoechst33,258染色

Hoechst 33,258染色を使用して、蛍光顕微鏡で核の形態を観察しました。処理後、H9c2細胞をPBSで2回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドバッファー（Fisher Scientific、ペンシルベニア州ピッツバーグ）で固定し、PBSでリンスし、ヘキスト33,258で37°Cで15分間染色しました[26]。染色後、核の形態学的側面を蛍光顕微鏡（ライカ、ハイデルベルク、ドイツ）で直ちに観察した。アポトーシス指数=アポトーシス核の数/総核×100％。

TUNEL（ターミナルdUTPニックエンドラベリング）アッセイ

H9c2細胞のDNAの完全性を検出するために、TUNEL技術を採用しました。 H9c2細胞は24ウェル培養プレートで培養されました。処理後、PBSで3回洗浄し、4％ポリホルムアルデヒドで30分間固定しました[27]。次に、1％Triton X-100を5分間添加して、細胞膜の透過性を高めました。その後、TUNELワンステップ検出キット（Beyotime Biotechnology）で指示通りに細胞を染色し、蛍光顕微鏡で細胞アポトーシスを観察しました。各グループのアポトーシス率は、全核（青）に対する緑色蛍光核（TUNEL陽性）のパーセンテージとして表されます（核はDAPIで染色されています）[28]。

アポトーシスを検出するためのフローサイトメトリー

LPS誘導細胞アポトーシスに対するさまざまなICAナノ粒子の影響をさらに調査するために、アネキシンV-FITC / PI二重染色法を使用してアポトーシス率を分析しました。上記のH9c2処理後、細胞を回収し、10 µLのアネキシンV-FITCと5 µLのPIを含む195 µLの結合バッファーに再懸濁し、暗所で室温で15分間インキュベートしました。 1500 rpmで10分間、4°Cで遠心分離した後、染色バッファーを吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、100 µLのPBSに再懸濁しました。最後に、サンプルをフローサイトメーターで測定しました。

逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（RT–qPCR）

RT-qPCRを使用して、TNF-α、IL-1β、IL-6などの炎症マーカーのmRNA発現レベルを検出しました。 H9c2細胞を24時間処理した後、前述のようにTRIzolを使用して全RNAを抽出し、NanoDrop™One / OneCマイクロ紫外可視分光光度計（Thermo、ND-ONEC-W、USA）を使用して測定しました。 ExScript RTキットを使用してcDNAを合成し、蛍光定量PCRマシン（BIO-RAD CFX96 Touch *）で、SYBR Green試薬を使用して95°Cで5分間、95°Cで30秒間、増幅を行いました。 58°Cで30秒間、合計28サイクル。この研究で使用したプライマーは次のとおりです。

Actin ::

フォワード5'GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3 ';

リバース5'-TTGATGTCACGCACGATTT-3 ';

TNF-α::

フォワード5'TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3 ';

リバース5'-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3 ';

IL-1β::

フォワード5'GGATGATGACGACCTGCTA3 ';

リバース5'-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3 '

IL-6 ::

フォワード5'TGCCTTCTTGGGACTGAT-3 ';

リバース5'-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3 '。

各標的遺伝子の量は、アクチン遺伝子の量に正規化されました。実験は3回繰り返しました。

結果と考察

FTIRおよびH ¹ NMRスペクトル

mPEG-ICAスペクトルから、2つのエステル結合（–C =O–）の伸縮振動吸収ピークは1700 ^-1 にありました。および1740 ^-1 CM。 mPEG-COOHスペクトルと比較すると、1650 cm ^-1 に過剰なC =C伸縮振動ピークがありました。、ICAとmPEG-COOHのエステル化合成がmPEG-ICAの形成に成功したことを示しています（図1）。

mPEG-ICA水素スペクトルから、12.6 ppmは、低磁場に移動する–C =Oの強い吸収電子基の存在によるICAフェノール性ヒドロキシル基を示します。ベンゼン環の水素のピークは約7.5ppmで、ピーク面積は3.5 ppmと非常に大きく、–CH ₂と判断されます。 –O–mPEGポリマーの水素ピーク。多数の分析によると、アルキル水素信号は0〜2ppmです。したがって、1.7ppmがICAの二重結合水素ピークであると結論付けることができます。 mPEG-COOHとICAの特徴的なピークは、mPEG-ICAポリマーに現れ、ICAを使用したmPEG-COOHの合成が成功したことを示しています（図1）。

粒子サイズ、ゼータ電位、およびTEM

mPEG-ICAナノ粒子の平均粒子サイズは約（145.0±15.2）nmであり、ポリマーの分散指数（PDI）値は（0.277±0.00）です。 ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の粒子サイズはわずかに増加して約（220.0±13.7）nmになり、PDIは（0.119±0.00）でした。 PDIが小さいほど、ICAがロードされたmPEG-ICANPの分布が均一になります。 mPEG-ICAナノ粒子のゼータ電位は（0.439±0.258）mVであり、ICAをロードしたmPEG-ICA NPのゼータ電位は（2.30±1.33）mVでした。透過型電子顕微鏡により、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子は球状で、形態が規則的で、サイズが比較的均一であることが明らかになりました（図2）。

薬物の装填とカプセル化の効率

ICAをロードしたmPEG-ICANPのICA含有量は、紫外分光光度法で計算できます。 ICA濃度の標準曲線を作成し、標準曲線に基づいて薬物濃度を計算することにより、ポリマー中のICA含有量を求めました。計算によると、mPEG-ICAポリマーの吸光度（1.2397±0.1024）に基づくと、ICAの含有量は（0.4132±0.0359）mg / mLであり、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の吸光度（1.6289±0.0923）、およびICAの含有量は（0.5496±0.3234）mg / mLでした。この方法の式に従って計算すると、mPEG-ICAポリマーの薬物負荷は（16.5±0.014）％であり、カプセル化率は（41.3±0.036）％でした。 ICAをロードしたmPEG-ICANPの薬物ロード含有量は（21.9±0.013）％であり、カプセル化率は（54.9±0.032）％でした（表1）。

<図>

安定性の判断

透析法により調製されたICA負荷mPEG-ICAナノ粒子の粒子サイズは（220.0±13.7）nmであり、PDIは（0.119±0.00）でした。 5％マンニトールで48時間凍結乾燥した後、ナノ粒子を水に再溶解して安定したナノ粒子を形成できます。粒子サイズは255nmで、PDIは（0.326±0.00）であり、透析ナノ粒子よりもわずかに大きかった（図3）。

mPEG-ICA-ICAのinvitroでの薬物放出

図4では、ICAの放出は放出媒体のpHに大きく依存します。 pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）放出培地内で、遊離イカリインが12時間以内に放出され（77.21±0.15）％、完全に放出されました。イカリイン薬物をロードしたmPEG-ICANPはナノ粒子の放出を増加させる可能性があるため、72時間以内に放出されたmPE-ICAナノ粒子の薬物放出は（44.08±0.12）％に達し、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子は（52.80±1.70）に達しました。％。 ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子をpH6.8の緩衝液に入れると、ナノ粒子を介した薬物の放出が48時間以内に（75.66±0.17）％に達することがわかりました。これは、一部のICAがロードされたmPEG-ICA NPが解重合されたNPを持っていたか、mPEG-ICA分子がNPで壊れたためと考えられます。これらの観察は、ICAの放出がpH6.8の酸性条件下でより良好であることを示した。また、局所病変は弱酸性環境で焦点を合わせるため、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の放出特性が心筋の炎症性損傷の局所治療に有益であることも示しました。

H9C2細胞の生存率と乳酸デヒドロゲナーゼの放出

まず、ICAをロードしたmPEG-ICAナノ粒子の細胞毒性を観察するために、遊離薬物（20 µM ICA）、mPEG-ICA NP、およびICAをロードしたmPEG-ICA NPをH9c2細胞に添加しましたが、MTTの結果ではナノ粒子（図5）。次に、LPSによる損傷からH9c2細胞を保護できるかどうかをさらに調査しました（図6）。 LPSで24時間処理した後、細胞の生存率は（50.0±3.22）％に減少しました（コントロールグループ100％）。ICA、mPEG-ICA NP、およびICAをロードしたmPEG-ICA NPで処理すると、H9c2細胞の生存率が大幅に増加しました。それぞれ（55.94±1.06）％、（60.97±2.615）％、および（65.36±1.214）％（ P <0.05）。

In addition, LDH levels are a marker of cell damage; therefore, we measured the release level of LDH in the culture medium (Fig. 7). LDH levels were increased in the LPS group compared with the normal culture group. Treatment with ICA, mPEG-ICA NPs or ICA-loaded mPEG-ICA NPs reduced the LDH level increase induced by LPS, especially in the ICA-loaded mPEG-ICA NP group. These results showed that ICA nanoparticles could protect cells from LPS.

Cell apoptosis induced by LPS

First, nuclear morphology was detected by Hoechst 33,258 staining (Fig. 8). Nuclear chromatin exhibited condensation, breakage and fragmentation after LPS damage in the LPS group. However, for ICA-loaded mPEG-ICA NP group, the number of apoptotic cells obviously decreased. Moreover, we used TUNEL staining to observe cellular DNA breaks or DNA damage (Fig. 9). The number of apoptotic nuclei in the LPS-induced group was (47.57 ± 3.41)% (P ˂ 0.0001) compared to (6.47 ± 1.87)% in the normal culture group. After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA, the apoptosis rates decreased to (17.92 ± 3.12)% and (26.54 ± 3.68)% and (35.49 ± 4.25)%, respectively, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs significantly reduced the apoptosis rate compared with mPEG-ICA NPs. In addition, flow cytometric analysis in LPS-induced H9c2 cells showed that (35.93 ± 2.23)% of the cells were in the early and late apoptotic stages (Fig. 10). After treatment with ICA-loaded mPEG-ICA NPs or mPEG-ICA NPs, the total apoptotic rates were reduced to (16.70 ± 2.77)% and (19.15 ± 3.67)%, respectively. These results were in line with the Hoechst 33,258 staining and TUNEL staining findings and indicated that ICA-loaded mPEG-ICA NPs largely prevented the cells from undergoing apoptosis.

Inflammatory cytokine mRNA in LPS-induced H9c2 cells

Next, we evaluated the effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs on the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in LPS-induced H9c2 cells. After LPS treatment for 24 h in H9c2 cells, the mRNA levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 were increased. These increases were attenuated by ICA-loaded mPEG-ICA NPs, mPEG-ICA NPs and ICA treatment, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs treatment markedly lowed TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression (Fig. 11).

In this study, we analyzed the suitability of polymer nanoparticles to load ICA for the treatment of LPS-induced H9c2 cell damage. The synthesis method is highly feasible and has many advantages. First, mPEG is nontoxic and has good biocompatibility [29]. In this study, a chemical bonding method was used to assemble mPEG and ICA into an mPEG-ICA polymer, and then dialysis was used to physically wrap the ICA and form stable nanoparticles [30]. Nanoparticles can significantly improve the water solubility of ICA and can realize the long circulation of nanoparticles in the body [31, 32]. Compared with mPEG-ICA nanoparticles, ICA-loaded mPEG-ICA nanoparticles have many significant advantages. First, their PDI value is smaller, which proves that the particle size distribution is more uniform [33]. Second, the drug loading and encapsulation efficiencies of ICA-loaded mPEG-ICA NPs are both higher than those of mPEG-ICA NPs, making it easier to reach the effective drug concentration of ICA [34]. In a pH 6.8 solution, nanoparticles release more drugs, and an acidic environment may destroy the self-assembly force of nanoparticles and accelerate the cleavage of ester bonds, resulting in faster release of the drug into the medium and effective enrichment of the drug in the inflammation site [35, 36]. Huang etal。 used LPS-induced osteoblasts to validate the model to explore the anti-inflammatory mechanism of Icariin. They found that Icariin can significantly upregulate the expression of BMP-2 and Runx2 in LPS-induced osteoblasts, thereby achieving effective therapeutic effects [37]. A study has shown that ICA can inhibit the inflammatory response of chondrocytes induced by LPS and reduce collagen formation [38]. In addition, ICA can also inhibit the caspase-1 signaling pathway mediated by the NLRP3 inflammasome and reduce LPS-induced sagging [39]. However, LPS-induced cells cannot effectively absorb ICA. Making ICA nanoparticles can solve this problem well. It may be that ICA is loaded by nanocarriers, greatly increasing its water solubility and allowing it to enter cells through free diffusion. At the same time, studies have shown that nanoparticles can promote cell endocytosis and tissue cell efflux and significantly improve the bioavailability of ICA [40, 41].

The results of the MTT assay and lactate dehydrogenase release experiments showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could effectively alleviate the cell damage induced by LPS, and ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release ICA from the particles. Furthermore, compared with the mPEG-ICA NPs, ICA-loaded mPEG-ICA NPs could load more ICA and release more easily. We also found that these nanoparticles markedly decreased apoptosis induced by LPS to alleviate the inflammatory response in H9c2 cells. Moreover, the antiapoptotic effect of ICA-loaded mPEG-ICA NPs was better than that of mPEG-ICA NPs and ICA. These results indicated that ICA nanoparticles could protect cardiomyocytes from inflammatory injury.

Inflammatory cytokines are the key factors involved in the development and progression of cardiovascular disease and are markers of the inflammatory response [42, 43]. Some researchers have found that TNF-α, IL-1β and IL-6 were closely related to cardiac function. The addition of these inflammatory cytokines to isolated cardiomyocytes resulted in abnormalities in cardiac function and promoted cardiomyocyte loss [44]. Our RT–qPCR results showed that ICA-loaded mPEG-ICA NPs could significantly inhibit the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6. Therefore, these results implied that the protective effects of ICA-loaded mPEG-ICA NPs may occur through controlling inflammatory cytokines.

Conclusion

ICA-loaded mPEG-ICA NPs are a new type of nanomedicine successfully synthesized through nanotechnology (a combination of chemical synthesis and physical embedding). This process not only converts the hydrophobic drug ICA into water-soluble nanomedicine but also successfully improves the load capacity of ICA. In the weakly acidic solution, the ICA release from ICA-loaded mPEG-ICA NPs was greater than that of the neutral solution, indicating that nanoparticles are meaningful for the treatment of inflammatory cardiovascular diseases. Treatment with ICA nanoparticles effectively protected against LPS-induced H9c2 damage, promoted cell viability and inhibited cell apoptosis. Further experiments demonstrated that the new ICA-loaded mPEG-ICA NPs could release inflammatory cytokine production.