ミセルナノ結晶の界面不安定性に基づく製造プロセスにおけるエマルジョン液滴サイズと界面活性剤の役割の検討

背景

蛍光半導体ナノ結晶（量子ドット、量子ドット）[1,2,3]、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）[4,5,6]、金ナノ粒子[7,8,9]などのナノ材料を適用する可能性、生物医学的検出のために、イメージングと治療は、ほぼ20年の研究の後に十分に確立されています[10、11]。したがって、近年、ナノバイオマテリアル研究の焦点は、概念実証実験から、ナノマテリアル製造プロセス、ナノマテリアルの構造と特性の関係、およびナノマテリアルとバイオシステムの相互作用に関する洞察と体系的な理解を得ることを目的としたメカニズム研究にシフトしています。 、および翻訳研究。これは、ナノマテリアルを産業および診療所に翻訳する際の主要な問題を特定して解決することを目的としています。本研究は、ナノバイオ材料の主要なクラスとなったミセルナノ結晶の、界面不安定性法として知られる新たな製造プロセスについての新たな理解を得ることに焦点を当てています。

疎水性ナノ材料（QD、SPION、一般的に使用される有機溶媒ベースの高温合成によって合成された金ナノ粒子[12,13,14]など）を水中に可溶化する主な戦略は、ミセルを使用して疎水性ナノ材料をカプセル化することです[ 15,16,17]。ミセルは古典的な自己組織化システムであり、両親媒性分子が水性環境で自発的にコアシェル構造（ミセルと呼ばれる）を形成し、両親媒性分子の親水性セグメントがミセルシェルとして外側を向き、疎水性セグメントが向き合うシステムの総エネルギーを最小化するために、ミセルコアとして内側に。ミセルは、主に疎水性分子（例えば、油、多くの抗癌剤）を疎水性コアにカプセル化できるという事実に基づいて、洗浄剤および薬物送達システムとしての長い用途の歴史があります[18、19、20、21、22]。主に疎水性相互作用によって駆動されるミセルの分析[23]。より最近では、ミセルは、生物医学的画像化および検出のために単一のナノ結晶をカプセル化するために適用されている（各ミセルは単一のナノ結晶をカプセル化する）[24]。ごく最近、かなりの数の研究グループが、ミセル内の異なるナノ結晶間の多機能性または相乗効果のために、複数のナノ結晶をカプセル化するためのミセルの使用を報告しました[25、26、27、28、29、30、31、32]。

ミセルナノ結晶（ナノ結晶でカプセル化されたミセル）を調製するための新たな方法は、界面不安定性法です[33,34,35]。界面不安定性プロセスは、2008年にZhuとHaywardによって酸化鉄ナノ粒子でカプセル化されたミセルを調製するために最初に報告され[33]、後にRuanとWinterらによって使用されました。 2010年にQDとSPIONの両方をカプセル化したミセルを準備し、2011年に異なる蛍光発光色のQDをカプセル化したミセルを準備します[25、26]。 QDカプセル化ポリ（スチレン-b-エチレングリコール）（PS-PEG）ミセルを調製するための界面不安定性プロセスには、2つの主要なステップが含まれます。（1）水中油型エマルジョン液滴の形成。このエマルジョンでは、油相に疎水性QDと、非極性有機溶媒（本研究ではクロロホルム）に溶解した両親媒性ブロックコポリマーPS-PEGが含まれています。水相は、水に溶解した界面活性剤ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含む。 （2）ナノ結晶でカプセル化されたミセルの形成。有機溶媒が蒸発すると、エマルジョンの油/水界面が不安定になり、疎水性相互作用によってシステムが駆動され、疎水性QDをカプセル化したPS-PEGミセルが自発的に形成されます。実験で通常使用されるミセルの形成を成功させるための簡単な指標は、ナノメートルサイズ（通常の直径30〜40 nm）のおかげで、乳白色の分散液（エマルジョン）から透明な分散液（ミセルナノ結晶分散液）へのシステムの劇的な視覚的変換です。 ）ミセルの。界面不安定性プロセスを使用してQDをPS-PEGミセルにカプセル化するRuanand Winterの以前の実験では、このプロセスには多くの肯定的な特徴がありましたが、主要な問題は、システムのQD蛍光の頻繁に観察される大きな損失であることがわかりました。製造/保管プロセス、および蛍光損失の原因は不明でした。現在の作業の目標は2つあります。1つは、界面不安定性プロセスによって調製されたQDカプセル化PS-PEGミセルの蛍光損失を最小限に抑えることです。一方、技術の最適化プロセスと、QDを含むナノコンポジット材料の製造プロセスを追跡するレポーターとしてのQDの蛍光を利用することにより、ナノ結晶でカプセル化されたミセルを調製するための新たな一般的なプロセスについての新しい理解を得ることを目指しています。つまり、界面の不安定性プロセス。私たちの結果は、エマルジョン液滴サイズと界面活性剤PVAが製造プロセスで重要な役割を果たすことを示唆しています。各エマルジョン液滴は本質的に「マイクロリアクター」として機能し、界面活性剤PVAが「マイクロリアクター」の形成に必要。大きな「マイクロリアクター」サイズ（〜25μm）を使用すると、小さな「マイクロリアクター」サイズ（〜超音波処理またはエレクトロスプレーによって生成された3μm以下）は、コロイド的に安定したナノ結晶でカプセル化されたPS-PEGミセルのみをもたらします。

メソッド

資料

コアシェルCdSe / ZnS量子ドット（QD、発光波長600 nm、オクタデシルアミンで覆われている）はOceanNanotechから購入しました。ポリ（スチレン-b-エチレングリコール）（PS-PEG）およびカルボン酸末端ポリ（スチレン-b-エチレングリコール）（PS-PEG-COOH）（PS 9.5 k Dalton、PEG 18.0 k Dalton）はPolymerSourceから購入しました。 。ポリ（ビニルアルコール）（PVA）（分子量13〜23 kg / mol、87〜89％加水分解）はSigma-Aldrichから購入しました。 Tatペプチド（配列YGRKKRRQRRR）およびRGDペプチド（Arg-Gly-Asp）はChinaPeptidesから購入しました。 1-エチル-3-（-3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC）およびスルホ-NHSはSigma-Aldrichから購入しました。他のすべての化学物質は試薬グレードでした。すべての実験に使用された水は、MilliporeMilli-Q精製システムによって再蒸留および精製されました。

界面不安定性プロセスによるミセルナノ結晶の調製

一般的な手順では、最初に、有機溶媒であるクロロホルムにQD（0.1 µM、0.1 ml）とPS-PEG（10 mg / ml、20 µl）を混合して油相を形成しました。その後、水相（5 mg / mlPVAを含む0.6mlの水）を加えました。水中油型エマルジョンは、手動で振とう（混合物を手で1分間激しく振とう）または超音波処理（ShuMei KQ218バスソニケーターで混合物を30秒間超音波処理）することによって形成されました。いくつかの実験では、エレクトロスプレーを使用して、界面不安定性プロセス用の超微細エマルジョン液滴を生成しました[35]。液滴サイズの影響を研究するために、さまざまな処理を使用してさまざまなサイズのエマルジョン液滴を生成しました。手動で振とうすることで約25μm（直径）の液滴が形成され、超音波処理によって約3μm（直径）の液滴が形成されました。エレクトロスプレーにより、数百ナノメートルから数マイクロメートル（直径）の液滴が形成された。エマルジョンを超純水（2.4 ml）でさらに4倍に希釈しました。エマルジョンを化学ドラフト内に置き、100 rpmでマグネチックスターラーを使用してクロロホルムを蒸発させ、ミセルQDを形成しました。乳白色の分散液から透明な分散液への外観の目に見える変化は、ミセル形成の成功を示していました。

有機溶媒としてテトラヒドロフラン（THF）を使用した場合、THF中でQD（0.1μM、1 ml）とPS-PEG（10 mg / ml、0.2 ml）を混合することにより、最初に油相が形成されました。水分含有量が50％ v に達するまで、脱イオン水を滴下方式（1滴/ 20秒）で溶液に添加しました。 / v 。次に、溶液を10〜15分間投票して混合し、次に脱イオン水に対して2日間透析して、THF（分子量カットオフ100,000ダルトン）を除去しました。

エレクトロスプレーを使用して界面不安定性プロセス用の液滴を生成した場合、操作は次のようになりました[35]。同軸エレクトロスプレー構成が使用されました。内毛細管針は27ゲージ（外径500μm、内径300μm）のステンレス鋼毛細管であり、外針は20ゲージ（外径1000μm、内径500μm）のステンレス鋼三方コネクタでした。ノズルの先端は、接地されたスチールリングの0.8 cm上、ガラスの収集皿の10cm上に配置されました。油相は、QDとPS-PEGを混合することによって形成され、シリンジポンプ（SPLab01、深セン、中国）を使用して0.6 ml / hの流量で内部のステンレス鋼キャピラリーに送られました。油相中のPS-PEGとQDの濃度は、それぞれ5 mg / mlと0.2μMでした。 PVAを脱イオンH ₂ に溶解することにより、水相を調製しました。 O 40 mg / ml。水溶液は、2番目のシリンジポンプ（SPLab01、深セン、中国）を使用して、1.5 ml / hの流量で同軸針の外側の輪に送られました。通常、6〜7 kVの範囲の電圧で、同軸ノズルの先端に凹型のコーンジェット（テイラーコーン）が観察されました。液滴を収集するために、10mlの脱イオン水を含むガラス収集皿をノズル先端の下に配置しました。エレクトロスプレー時間（安定したテイラーコーンが形成された後）は、通常30〜90分でした。これに続いて、化学ドラフト内で一晩さらに蒸発させた。最後に、ガラス収集皿の分散液を15mlの遠心分離管に移して特性を調べました。

ミセルQDの物理的特性の特性

ミセルQDの形態は、透過型電子顕微鏡（TEM、JEOL JEM-2100（HR））によって特徴づけられ、本研究でTEMによって調査されたすべてのサンプルは、1％のリンタングステン酸（PTA）によってネガティブ染色されました。粒子サイズは、TEMまたは動的光散乱（DLS）によって特徴づけられました。蛍光スペクトルは、HitachiF-4600蛍光分光光度計によって取得されました。

ナノマテリアルの細胞毒性

細胞毒性研究は、3つのよく特徴付けられたヒト癌細胞株、すなわちA549（肺胞基底上皮）、MCF-7（乳房）、およびHeLa（子宮頸部）細胞（KeyGen Biotech、中国から購入）で実施されました。細胞は、湿度の高いインキュベーター（37°Cおよび5％CO ₂ ）内で、10％ウシ胎児血清および抗生物質（ペニシリン/ストレプトマイシン）を含む培養DMEMで維持されました。 ）。細胞毒性を評価するために、細胞を200μlの培地で96ウェルプレートに24時間播種しました。次に、細胞を新鮮な培地でさまざまな濃度のミセルQDとともに、37°C​​、5％CO ₂ でインキュベートしました。 雰囲気。 24時間のインキュベーション後、ミセルQDが分散した培地を除去し、製造元のプロトコルに従ってMTTアッセイを適用しました。最後に、各ウェルの吸光度をマイクロタイタープレートリーダーで570nmで測定しました。

QDカプセル化PS-PEG-COOHミセルとペプチドの結合

PS-PEG-COOHミセルは、PS-PEG分子の代わりにPS-PEG-COOH分子を使用して、上記の界面不安定性手順で調製しました。次に、TatペプチドまたはRGDペプチドとの結合をEDC /スルホ-NHS法で行った。ミセルのカルボキシル基を活性化するために、2 mg / mlEDCと5mg / mlスルホ-NHSを含む0.3mlの0.1M MES緩衝液をミセル分散液（3 ml）に加え、室温で30分間撹拌せずに反応させました。 。次に、30 kD限外ろ過チューブを使用して余分なEDCとスルホNHSを除去し（10 krpmで5分間遠心分離）、得られた分散液をPBS（1 ml）に再懸濁しました。続いて、50μlのTatペプチド（PBS中2 mg / ml）または50μlのRGDペプチド（PBS中0.5 mg / ml）をそれぞれ添加し、4°Cで12時間反応させました。得られたペプチド結合PS-PEGミセルQD分散液は、50 kD限外ろ過チューブ（10 krpmで5分間の遠心分離）を3回使用して精製し、余分なペプチド分子を除去し、PBS（1 ml）に再懸濁しました。

生細胞イメージング

生細胞イメージングを使用して、Tatペプチド結合PS-PEGミセルQDの細胞内在化と細胞内輸送を研究しました。 HeLa細胞（KeyGen Biotech、中国から購入）を、ガラス底組織培養プレートに初期コンフルエンシー20％（播種密度1×10 ⁵ ）で播種しました。 600μlの培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清）に細胞/ ml）を入れ、5％CO ₂ で40時間培養しました。 37°Cで。次に、Tatペプチド結合PS-PEGミセルQD（細胞培養培地中の10 nMのQD）を追加しました。ミセルQDと1時間インキュベートした後、細胞を新鮮な培地で2回洗浄して、遊離ミセルQDを除去しました（内部移行ミセルQDの細胞内輸送の開始時間をおおよそ追加されたすべてのナノ粒子について同じ）。 6時間後、細胞の各プレートは、細胞インキュベーションチャンバー（IX3W、東海ヒット）、落射蛍光顕微鏡（IX-83、オリンパス、光源としてハロゲンランプを備えた）で構成される生細胞イメージングシステムによってイメージングされました。 ）、回転ディスク共焦点システム（Andor）および電子増倍電荷結合デバイス（EMCCD）カメラ（Evolve 512、Photometrics）。ここで使用される生細胞共焦点イメージングシステムは、顕微鏡ステージで培養された生細胞の回転ディスク共焦点イメージングを可能にします。これは、細胞輸送プロセスの研究に特に役立ちます。生細胞を顕微鏡ステージで培養し続けることにより、自然の生物学的プロセスを最小限の妨害で監視することができます。細胞核を対比染色するために、イメージングの直前（細胞輸送の特定の時点で）に、蛍光色素Hoechst 33342（細胞培養培地で5μM）を生細胞と20分間インキュベートしました。

生細胞イメージングは​​、RGDペプチド結合PS-PEGミセルQDとα _{v との特異的結合を研究するためにも適用されました。} β ₃ -インテグリン分子、α _{v を使用} β ₃ -インテグリン過剰発現細胞株（U87 MG細胞、KeyGen Biotech、中国から購入）とα _{v のない細胞株} β ₃ -インテグリンの過剰発現（MCF-7細胞、KeyGen Biotech、中国から購入）。 Tatペプチド結合PS-PEGミセルQDに使用される上記の細胞イメージングプロトコルが採用されましたが、主な変更点は、RGDペプチド結合ミセルQDに使用される濃度が100 nM（細胞培養培地中のQD）であったことです。

結果と考察

私たちと他の人々は最近、生物学的応用のための複合ナノ粒子を形成するためにナノ結晶をカプセル化するための界面不安定性法を導入しました。ただし、QDの蛍光強度に関して再現不可能で時には矛盾する結果に頻繁に遭遇しました（ここではQDをナノ結晶のモデルとして使用しました）。この問題は、業界や診療所に翻訳するために対処する必要があります。製造プロセス全体に関係する多くの要因（たとえば、溶媒、ポリマー、温度、「マイクロリアクター」のサイズ）は、蛍光損失と再現不可能な結果につながる可能性があります。関係するさまざまな要因を調査し、「マイクロリアクター」（エマルジョン液滴）のサイズがこの点で重要な要因であり、界面活性剤PVAの使用が密接に関連する要因であることを発見しました。以下では、主にエマルジョン液滴サイズと界面活性剤PVAの影響に関する結果について説明します。

機械的強度が大きく異なる2つの異なる乳化方法、すなわち手動振とう（混合物を手動で激しく振とう）とバス超音波処理（バスソニケーターで混合物を超音波処理）の効果を比較しました。これら2つの方法はどちらも、有機溶媒の蒸発後に最終的に透明で均一な分散をもたらす可能性があることを発見しました。これは、ナノ結晶でカプセル化されたミセル形成が成功したことを示しています（図1b、c、下）。透明で均質な外観は、界面の不安定性に基づく製造プロセスでミセル形成が成功したことを示す簡単で便利な指標として一般的に使用されるため、ミセル製品に対するさまざまな乳化方法の潜在的な影響は以前は見過ごされていました。光学顕微鏡を使用して、これら2つの異なる乳化法によって生成されたエマルジョン液滴のサイズをそれぞれ調べたところ、手動​​振とう法では約25μm（直径）の液滴が得られ、浴超音波処理法では約3μm（直径）であることがわかりました。直径）のもの（図1b、c、上）。光学顕微鏡画像を使用して、各サンプルについて約500の液滴のサイズを測定し、平均サイズとサイズ分布を取得しました。統計分析（学生の t テスト）は、手動振とうによって形成された液滴の平均サイズ（〜25μm）と超音波処理によって形成された液滴の平均サイズ（〜3μm）の差が統計的に有意であることを示しています（ P <0.001）。重要なのは、これら2つの異なる乳化方法が、それぞれ上記の2つの異なるサイズ範囲のエマルジョン液滴サイズを一貫して生成することを確認するための制御実験も実行したことです。 〜25μmのエマルジョン液滴（同様のサイズ分布）およびいくつかの異なる時間（0.5、1、および2分）でのバス超音波処理では、すべて〜3μmのエマルジョン液滴（同様のサイズ分布、追加ファイル1：図S1）が得られました。 。

有機溶媒の蒸発後に得られたエマルジョン液滴とQDカプセル化ミセルの目視観察。 a PVAは使用されませんでした。エマルジョンの液滴はほとんどまたはまったく形成されませんでした（上の画像 ）;有機溶媒を除去すると、QDでカプセル化されたミセルはほとんどまたはまったく形成されませんでした（下の画像 、挿入図 は、ハンドヘルドUVランプを使用して赤を励起する対応する蛍光画像を示しています。 QD蛍光）。 b 手動振とうを使用して、エマルジョン液滴を形成した。約25μmのエマルジョン液滴が形成されました（上の画像 、挿入図 は、500滴の画像解析による液滴サイズ測定結果を示しています。さらに、異なる振とう時間によるサイズの変動は最小限であることがわかりました（図S1）。有機溶媒を除去すると、透明で均質な分散液が形成され、ナノ結晶でカプセル化されたミセルの形成に成功したことを示しています（下の画像 、挿入図 は、ハンドヘルドUVランプを使用して赤を励起する対応する蛍光画像を示しています。 QD蛍光）。 c バス超音波処理を使用して、エマルジョン液滴を形成した。約3μmのエマルジョン液滴が形成されました（上の画像 、挿入図 は、500滴の画像解析による液滴サイズ測定結果を示しています。さらに、異なる振とう時間によるサイズの変動は最小限であることがわかりました（図S1）。有機溶媒を除去すると、透明で均質な分散液が形成され、ナノ結晶でカプセル化されたミセルの形成に成功したことを示しています（下の画像 、挿入図 は、ハンドヘルドUVランプを使用して赤を励起する対応する蛍光画像を示しています。 QD蛍光）。特定のサンプルのエマルジョン液滴のサイズを分析するために、最初にエマルジョン液滴の光学顕微鏡画像を撮影し、続いてフリーソフトウェアImageJによって約500液滴の直径を測定し、の平均サイズとサイズ分布を取得しました。サンプルのエマルジョン液滴

さらに、界面活性剤PVAの非存在下で乳化処理を行ったところ、光学顕微鏡の結果（図1a、上）から判断すると、エマルジョンの液滴はほとんど形成されておらず、ミセルはほとんど形成されていませんでした。最終生成物のほぼ完全な相分離（QD沈殿）の観察、つまりミセル生成物の形成の失敗（図1a、下）。図1aの結果は、界面活性剤PVAが、エマルジョン液滴（「マイクロリアクター」として）およびミセル（最終生成物として）の形成を成功させるために、界面不安定性プロセスに必要であることを示唆しています。これは、PS-PEGも本質的に両親媒性であるが、システム内にPS-PEGのみが存在すると（PVAが存在しない場合）、界面の不安定性プロセスに必要なエマルジョン液滴を生成できないことを示唆しているため、重要です。

製品分散液は、形成直後は透明で均質に見えましたが（TEMおよびDLSの特性評価結果では、球状および単分散のQDカプセル化ミセルが示されました、追加ファイル2：図S2）、上記の2つの異なるエマルジョン液滴サイズの違い乳化法、すなわち手動振とうおよび超音波処理は、ミセルナノ結晶製品に大きな違いをもたらすことがわかった。 4°Cで40日間にわたって、手動での振とうと超音波処理によってそれぞれ形成されたミセルQD（QDカプセル化ミセル）の蛍光強度の変化を測定し、追跡しました。ミセルの場合、手動で振とうすることによって形成されたQD（1分間、約25μmのエマルジョン液滴から形成された）が、ミセル形成プロセス中に蛍光強度（蛍光分光法で測定）が時間の経過とともに維持された（約10日）ミセルQDの蛍光強度は、元の蛍光強度レベルの約50％まで徐々に減少し、その後も安定したままでした（図2a）。対照的に、超音波処理によって形成されたミセルQD（30秒間、約3μmのエマルジョン液滴から形成された）は、全期間にわたって蛍光強度（蛍光分光法で測定）をほぼ維持しました（図2a）。さらに、サンプルを4°Cで10日間放置した後、手動で振とうすることと超音波処理することによってそれぞれ形成されたミセルQD分散液の下部を裸眼で観察しました。ミセルの下部では、10日間の保存後に手動で振とう（1分間）して形成されたQD分散液で、肉眼で目に見える沈殿物が観察されました（図2a、挿入図）。対照的に、10日間の保存後に超音波処理（30秒間）によって形成されたミセルQD分散液の下部では、肉眼で目に見える沈殿物は観察されませんでした（図2a、挿入図）。これらの結果は、どちらの乳化方法でも、同様のカプセル化効率でQDカプセル化ミセルの形成に成功する可能性があるものの、QDカプセル化ミセルの大部分は、より大きなエマルジョン液滴（〜25μm、1分間の手動振とうによって生成）によって形成されることを示唆しています。 ）はコロイド状に不安定であり、時間の経過とともに分散液からの沈​​殿と蛍光損失が発生しましたが、小さなエマルジョン液滴（〜3μm、30秒間のバス超音波処理で生成）によって形成されたQDカプセル化ミセルはすべてコロイド状に安定しており、維持されていました。長期間の蛍光（追加ファイル3：図S3に示すように、10日間の保存後の分散液のTEM研究でも、ミセルナノ結晶の形態がよく維持されていることが示されました）。さらに、超音波処理時間を30秒から1分と2分に増やしてエマルジョン液滴を形成すると、QDでカプセル化されたミセルは長期間コロイド状に安定していましたが、蛍光強度が大幅に低下することがわかりました。保存期間中の安定した蛍光強度から判断した超音波処理時間（図2b）。図2bに示されている蛍光損失は、強力で長時間の機械的処理によるQDの表面欠陥の生成が原因である可能性があります。対照実験では、クロロホルムに溶解した疎水性QDの蛍光強度も、超音波処理時間の増加に伴う超音波処理下で徐々に減少することがわかりました（追加ファイル4：図S4）。これは、この提案された蛍光損失の原因を裏付けています。まとめると、図2a、bは、界面不安定性プロセスによって製造されたQDカプセル化ミセルシステムにおける蛍光損失の2つの主要なメカニズム、つまり、コロイド状に不安定なQDカプセル化ミセルと機械的処理によって生成されたQD表面欠陥を示しています。

界面不安定性プロセスによって製造されたQDカプセル化ミセルの蛍光安定性。 a QDカプセル化ミセルの蛍光強度（蛍光分光法で測定）の経時変化。エマルジョン液滴は、手動振とう（1分間、つまり約25μmの液滴）または超音波処理（30秒間、つまり約3）のいずれかによって形成されます。 μm液滴）、それぞれ。 挿入物 手動振とう（1分間、つまり約25μmの液滴）または超音波処理（30秒間、つまり約3）のいずれかによって形成されたエマルジョン液滴を使用して、4°Cで10日間保存した後のQDカプセル化ミセル分散液の画像です。 μm液滴）、それぞれ。パネル a QDカプセル化ミセルの蛍光が失われる原因の1つは、コロイド状に不安定なQDカプセル化ミセルの存在であることを示しています。 b 3つの異なる超音波処理時間での超音波処理によって形成されたエマルジョン液滴（つまり、約3μmの液滴）を含むQDカプセル化ミセルの経時的な蛍光強度の変化（蛍光分光法で測定）。パネル b QDでカプセル化されたミセルの蛍光が失われる原因の1つは、強力で長時間の機械的処理によって生成されるQD表面の欠陥であることを示しています

これら2つの蛍光損失のメカニズムの中で、QD蛍光損失はQD表面の損傷によって引き起こされることがよく知られていますが、ミセルの一部がコロイド的に不安定であるという結果は私たちにとって驚きでした。したがって、この特定のメカニズムについてさらに研究を行いました。最初に、上記の沈殿した量子ドットが実際にミセル（またはミセルのようなアセンブリ構造）にカプセル化されているかどうかを質問しました。これらの沈殿物で分散液を振るだけで、分散液の蛍光強度が元のレベルに戻る可能性があることがわかりました（図3a、左）。対照的に、水中に沈殿した疎水性QDに同じ処理を使用した対照研究では、そのような蛍光強度の増加は示されませんでした（図3a、右）。さらに、10日間の保管後に手動で振とうすることによって形成された製品サンプルの下部の透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、大きな球形および非球形の構造にクラスター化された多数のQDを示しました（図3b、左）。対照的に、10日間の保管後に超音波処理によって形成された製品サンプルの下部では、対応するTEM画像は、球状構造にクラスター化された少数のQDのみを示しました（図3b、中央）。したがって、これらの結果は、沈殿したQDが実際にミセルまたはミセルのようなアセンブリ構造にカプセル化されていることを示しています。つまり、これらのQDは裸の疎水性QDではありませんでした。次に、これらのコロイド状に不安定なミセル（またはミセルのような集合構造）の化学的性質は何かという質問をしました。 PS-PEGミセルはコロイド的に安定しているはずなので、不安定なミセル（またはミセルのようなアセンブリ構造）は界面活性剤PVAによって形成されたと仮定しました。この仮説は、次の2行の実験的証拠によって裏付けられています。まず、界面不安定性プロセスでPS-PEGなしでPVAを使用すると、実際にミセルがQDをカプセル化する可​​能性があることがわかりました（図3b、右）。次に、比較のために、PS-PEGミセルQDとPVAミセルQDでそれぞれ透析実験を行いました。純水に対する透析処理（透析バッグの分子量カットオフは200 kDであり、PVAおよびPS-PEGの分子量よりも大きい）後、PS-PEGミセルQDはコロイド的に安定したままでした。 QD蛍光は分散液中で均一なままでした（図3c、左）。まったく対照的に、PVAミセルQD分散液は、上記とほぼ同じ透析処理後に、はっきりと見える蛍光凝集体をもたらしました（図3c、右）。 As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. a 左 , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Right , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b 左 and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Right , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ）、 それぞれ。 A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. a 、 b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ）。 c 、 d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d ）

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. a PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ）。 In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)

結論

In conclusion, we have used QDs as the model nanocrystals to follow the interfacial instability process, an emerging general method to fabricate nanocrystal-encapsulated micelles. Our results reveal the key roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA in the interfacial instability process. These results not only help to optimize the quality of nanocrystal-encapsulated micelles for biological applications such as biological detection, imaging and therapy, but offer helpful new knowledge on the interfacial instability process in particular and self-assembly in general.

略語

EDC:

1-Ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride

PS-PEG:

Poly (styrene-b-ethylene glycol)

PS-PEG-COOH:

Carboxylic acid terminated poly (styrene-b-ethylene glycol)

PTA:

Phosphotungstic acid

PVA:

Poly (vinyl alcohol)

QD：

量子ドット

SPION:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticle

TEM：

透過型電子顕微鏡

THF:

Tetrahydrofuran