抗がん効果を高めるための標的ナノドラッグへの有機溶媒を使用しない新しい方法

背景

過去20年間にわたって、研究の集中は、化学療法の次善の薬物動態特性を改善してその有効性を高めることに焦点を合わせていました[1、2]。大きな進歩が見られ、多くのナノ粒子ベースの多機能ドラッグデリバリーシステムの準備に成功しました。これは、長期循環[3、4]、ターゲティング[5,6,7]、イメージング[8]などの幅広い複合特性を示します。 、9,10]、pH感度[11、12]、および持続的な薬物放出[9、13]。

近年、非球形の粒子形状は、ドラッグデリバリーへの潜在的な影響についてますます注目を集めています[14、15、16、17、18、19]。形状が生体内分布や分解などの粒子の多くの特性に影響を与えるという証拠はすでにあります[20、21、22]。とりわけ、細胞内在化は形状に強く依存することが証明されました[23、24、25]。なぜなら、粒子は癌細胞に入り、それらを殺すためにそれらの治療標的に作用することができなければならないからです。そして、多くの研究により、癌細胞はアスペクト比の高い粒子を好むことがわかっています[10、26]。

ただし、これらの方法のほとんどは、主にナノ粒子の調製プロセスで必要とされる疎水性基のために、有機溶媒に大きく依存しています[27]。これらの有機溶媒は粒子内に残留している可能性があり、減圧蒸留や凍結乾燥などの従来の方法では完全に除去することはできません。その結果、残留溶媒と呼ばれる微量の有機溶媒が薬に残ります。残留溶媒はごくわずかであり、医薬品中の残留溶媒の最大許容量を厳密に管理している薬局方で発表された特別な指示を満たす可能性がありますが、残留溶媒は体内に蓄積し、病気を強調したり、その他の深刻な原因となる可能性があります問題。したがって、製造業者は、薬剤製造プロセスで使用される有機溶媒の量を最小限に抑えることを目指してきました。したがって、多くの困難に直面しているものの、製薬業界に「グリーン」ケミストリーを使用することは、医学、人間の健康、および環境にとってかなり大きな飛躍となるでしょう。

この研究では、有機溶媒を使用せずに完全にグリーンな方法で、高アスペクト比で鋭い端を持つHCPTをロードした葉酸（FA）修飾ナノニードル（HFND）を開発しました。 HCPTおよびFA修飾キトサン（CS-FA）のpH制御された沈殿により、立体安定剤としてCS-FAで包まれたコアとしてナノ結晶HCPTを使用したナノニードルの核形成が起こります。 HFNDは、ターゲティングおよびイメージング機能の優れた特性を備えていることがわかりました。次に、invitroおよびinvivo研究を体系的に調査しました。これらの結果は、非常に効率的な化学療法や癌診断アプリケーションのための、FAで修飾されたイメージング機能ナノニードルの大きな可能性を浮き彫りにしています。

メソッド

資料

すべての化学物質は分析グレードであり、さらに精製することなく受け取ったままの状態で使用されます。すべての実験で脱イオン（DI）水を使用しました。 FAはBioBasic Inc.から購入しました。10-ヒドロキシカンプトテシン（HCPT;純度> 99％）はLishizhen Pharmaceutical Co.、Ltdから購入しました。キトサン（Mw =70 000、脱アセチル化度90％）はZhejiangAoxingから入手しました。 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（EDC）は、Sigma-Aldrichから購入しました。

FA-キトサンコンジュゲートの合成

FA（10 mg）、キトサン（20 mg）、EDC（4 mg）、およびNHS（4 mg）を2 mLのPBS緩衝液（pH 5.5）に加え、室温で12時間撹拌してCS-FA懸濁液を得ました。 。次に、懸濁液を緩衝液（pH 10）に対して透析して、過剰なFA分子を除去しました。残りの懸濁液を遠心分離（5000 rpm）し、24時間凍結乾燥して、乾燥したCS-FA粉末を得ました。

HFNDの準備

HCPT（10μg）を200μLのNaOH水溶液（0.1 M）に溶解して溶液Aを取得し、CS-FA（10μg）を200μLのHCl（0.1 M）に溶解して溶液Bを取得しました。その後、溶液Aを取得しました。溶液Bを30秒間激しく攪拌しながら純水（1 mL）に滴下し、混合物を氷浴で6分間超音波処理（200 W）しました。懸濁液を遠心分離し（10,000 rpm、5分）、24時間凍結乾燥しました。 NDの調製では、溶液Bの代わりにキトサン溶液を使用しました。

特性評価

HFNDの形態は、15 kVでSEM（UV-70）によって調べられました。サイズとゼータ電位の値は、Malvern Zetasizer Nano-ZSマシン（Malvern Instruments、Malvern）によって決定されました。平均値を決定するために、3つの並行測定が実行されました。 HFNDの結晶化度はXRD（X’pert PRO）で分析されました。 HFND中のFAの含有量は、UV分光光度法（Beckman DU800）によって決定されました。すべてのサンプルは281nmで分析されました。 FA濃度を決定するために、事前に検量線を作成しました。 HFNDのHCPTの含有量は、383nmでの蛍光分光光度法によって決定されました。 HCPTの濃度を決定するために、検量線を事前に作成しました。含有量と捕捉効率は、式（1）によって計算されました。 （1、2、3、および4）：

インビトロ薬物放出研究

HFNDのinvitro薬物放出研究は、透析技術を使用して実施されました。 HFNDをPBS緩衝液（10 mL）に分散させ、事前に膨潤させた透析バッグ（MWCO 3500 Da）に入れました。次に、透析バッグをPBS（0.1 M、200 mL、pH 7.4）に浸し、37°C​​のシェーカーインキュベーター（100 rpm）で連続的に振動させました。すべてのサンプルは、蛍光分光光度法によって分析されました。

細胞の共焦点イメージング

細胞の共焦点イメージングは​​、ライカレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して実施しました。 HCPTのイメージングは​​、382 nmのレーザー励起下で実行され、発光は500〜550nmの範囲で収集されました。 HeLa細胞を播種し、37°C​​で24時間プレインキュベートしました（5％CO ₂ ）HFNDと8時間インキュベートする前。

蛍光測定で測定された細胞取り込み

HeLa細胞を24ウェルプレートに播種しました（1×10 ⁶ mL /ウェル）。次に、プレートを加湿雰囲気（5％CO ₂ ）で37°Cで24時間インキュベートしました。 ）。次に、細胞を、同等の濃度のHCPTでNDおよびHFNDとともにインキュベートした。薬物処理した細胞を37°Cで6時間インキュベートした後、PBSで2回洗浄し、トリプシン（0.05％）/ EDTA処理で消化しました。懸濁液を4分間遠心分離（1000 rpm、4°C）しました。細胞ペレットをPBSで洗浄して、培地中のバックグラウンド蛍光を除去した。洗浄と遠心分離を2サイクル行った後、細胞を2 mLのPBSで再懸濁し、強力な超音波処理によって完全に破壊しました。超音波処理された混合物中のHCPTの量は、蛍光分光法（382 nmでの励起）によって分析されました。薬物の非存在下でのブランク細胞を測定して、対照としての細胞の自家蛍光レベルを決定しました。

細胞毒性アッセイ

HFNDの細胞毒性はMTTアッセイによって決定されました。簡単に説明すると、適切な数の指数期HeLa細胞を、96ウェル平底マイクロプレートに5連でプレーティングし、薬物/粒子の存在下で24時間インキュベートしました。この研究では、20μLの3-（4,5-ジメチル-2-チアゾリル）-2,5-ジフェニル-2-H-テトラゾリウムブロミド（MTT）溶液（PBS中5 mg / mL）を各ウェルに添加しました。プレートを37°Cでさらに4時間インキュベートしました。その後、150μLのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加し、プレートを37°Cのウォーターバスチェーダーで30分間撹拌しました。マイクロプレートリーダー（モデル680、Bio-Rad）を使用して570nmでの吸光度を測定しました。

生体内分布

インビボ蛍光イメージングでは、DiRはNDとHFNDにカプセル化されました。 DiR-NDおよびDiR-HFNDは、マウスの体重1キログラムあたりのDiR-HCPTと同等の用量で、尾静脈を介してHeLa腫瘍を有するヌードマウスに静脈内投与されました。所定の時間間隔で、マウスに麻酔をかけ、Maestro in vivoイメージングシステム（Cambridge Research＆Instrumentation、米国マサチューセッツ州ウォーバーン）でイメージングしました。 24時間後、マウスを犠牲にし、腫瘍と主要臓器（脾臓、肝臓、腎臓、肺、心臓）を切除し、ex vivoイメージングのために表面を0.9％NaClで洗浄しました。

InVivoでの腫瘍抑制

HeLa担癌マウスのHeLa腫瘍体積が約60mm ³ の場合 、マウスをランダムに4つのグループに分け、0.9％NaCl、遊離HCPT、ND、およびHFNDを3日ごとにマウスあたり80μgHCPTの用量で静脈内注射して治療しました。腫瘍の体積と体重を3日ごとに監視しました。腫瘍体積は、次の式で計算されました：腫瘍体積=0.5×長さ×幅 ² 。

21日後、マウスを犠牲にし、続いて腫瘍を切除して体重を測定しました。次に、腫瘍を4％パラホルムアルデヒドで4°Cで一晩固定し、パラフィンに包埋し、切片化し（4μm）、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色し、デジタル顕微鏡システムを使用して観察しました。

統計分析

治療結果の統計的有意性は、学生の t を使用して評価されました。 テスト（両側）; P <0.05はすべての分析で統計的に有意であると見なされました（95％信頼水準）。

結果と考察

FA-キトサンコンジュゲートの合成

まず、FAのカルボキシル末端基とキトサンのアミドゲンとのアミド化反応により、FAをキトサンに結合させました（図1）。コンジュゲーション（CS-FA）の構造は、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光法によって確認されました。図2に示すように、CS-FAのIRスペクトルでは、キトサンよりも1605 / cmのピークが強くなり、新しいアミド結合のC =O伸縮振動に対応しています。結果は、FAがアミド結合を介してキトサンのアミドゲンに首尾よく結合したことを示した。コンジュゲーション中のFAのパーセンテージを調査するために、標準曲線を紫外分光光度法で作成しました。また、FAの割合は23.4±2.5％と計算されました。

CS-FAコンジュゲートの合成経路

（ a のFTIRスペクトル ）FA、（ b ）キトサン、および（ c ）CS-FA

HFNDの準備

HCPTの水への溶解度は非常に低いことは周知の事実ですが、アルカリに溶解する可能性があります。キトサンは正反対です。酸に溶け、水に溶けません。そして、CS-FAはキトサンと同様の溶解度を示しました。したがって、HCPTとCS-FAはそれぞれアルカリと酸に溶解しました。 2つの溶液を混合すると、中和反応が起こります。生成された混合物は中性になるように制御されました。これは、HCPTとCS-FAの両方にとって貧溶媒です。 pHの変化によって引き起こされる溶解度の低下は、HCPTナノニードルの核形成と、それに伴う成長中のHCPTナノニードルへのCS-FAの共沈の機会を提供しました（図3a）。超音波下でのナノニードルの動的核形成と沈殿、および軟質成分CS-FAの能動的閉塞により、バルクHCPT結晶の代わりにHFNDが形成されました。配合条件を最適化するために、条件実験を設計して、HCPTとCS-FAの比率、超音波出力、生成された混合物のpH、および生成された混合物の濃度がHFNDの形態に及ぼす影響を調べました（表1）。

a HFNDを準備する完全に環境に優しい方法の図。 b 、 c HFNDのSEM画像

図4は、さまざまな条件下での粒子の形態を示しています。 CS-FAが多すぎると、生成された粒子の表面に過剰なCS-FAが付着します（図4a）。 CS-FAは少なすぎましたが、CS-FAは、凝集しやすいHCPTナノニードルの成長を止めることができませんでした（図4b）。核形成はpHの変化によって引き起こされるため、生成された混合物のpHは調製プロセスで重要な役割を果たしました。 pHを中性に制御する必要があります。そうしないと、結晶化が損傷します（図4c）。超音波出力もHFNDの形態に大きな影響を及ぼしました。ナノニードルは低出力で凝集し（図4d）、高出力で断片に分解します（図4e）。さらに、生成された混合物の濃度は、HFNDのサイズに大きな影響を与えることがわかった。濃度を上げるとサイズが小さくなりました（図3bおよび4f）。

a – f さまざまな条件下でのHFNDのSEM画像（表1の詳細を参照）。 g HFNDの粒度分布。 h HFNDのゼータ電位

図3b、cは、平均長が約800 nm、幅が約80nmのHFNDの最適化された針状の形態を示しています。 DLS測定の結果は、104.3±5.7 nmのサイズ（図4g）と+ 16.3±1.9 mvのゼータ電位（図4h）を示しています。さらに、2 wt％のHFND分散液は、少なくとも2。5日間は良好な安定性を示しました。 CS-FAからの蛍光シグナルがないため、HCPTの蛍光特性を利用してHFNDのHCPT薬物負荷量を測定することができます。 HFNDのHCPT薬物負荷含有量は70.2±3.1％であり、カプセル化効率は83.1％でした。また、HFNDのFA含有量は7.0％でした。これは、CS-FAのFAのパーセンテージから計算されました。

XRD分析

よく知られているように、薬物の形態はナノ粒子の特性に大きく影響します。したがって、HFNDにおけるHCPTの形式を理解することは非常に重要です。 X線回折を使用して、HFND内のHCPTの形態を検出しました（図5）。純粋なHCPTは、高い結晶性の特徴を表す多くの鋭い結晶ピークを示すことは明らかです。半結晶性キトサンの幅広いピークはHFNDのXRDパターンにまだ存在していましたが、ピークの大部分はHCPTに属し、HCPTの高い結晶化度を示唆しています。要するに、XRDの結果は、HCPTがHFNDで結晶状態にあることを示唆しています。さらに、主にCS-FAの能動的閉塞および閉じ込め効果のために、HFND内のHCPTの成長動態が変化した。結晶化プロセスにおけるCS-FAの効果を調査するために、CS-FAが存在しない状態でHCPT結晶を調製しました。図6は、HCPT結晶の形態を示しています。長さは10μmを超える棒状で、HFNDとはまったく異なります。これはさらに、CS-FAがHFND内のHCPTの成長速度を変化させたことを示しています。

（ a のXRDパターン ）キトサン、（ b ）HCPT、および（ c ）MHND

HCPTバルク結晶のSEM画像

インビトロ薬物放出研究

薬物放出挙動は薬物送達システムにとって重要な特性であるため、HFNDのin vitro放出研究は、遊離HCPT粉末とともに透析技術を使用して実施されました。すべてのサンプルは、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって分析されました。放出プロファイルを図7に示します。遊離HCPTのプロファイルは、薬物の少なくとも30％が1時間の最初のサンプリング時間で放出され、18時間までにほぼ100％放出されたことを示しています。ただし、HFNDの放出プロファイルは、48時間にわたる2つの薬物の顕著な持続放出であるように見えます。薬物放出の延長は、CS-FAのポリマーシェルがコアでの薬物放出を制限する可能性があることに起因する可能性があります。これらの利点は、持続的なドラッグデリバリーシステムへのHFNDの適用を促進する可能性があります。

37°CでのPBS（pH 7.4）中のMHNDのinvitro薬物放出プロファイル。 （ a ）無料のHCPT; （ b ）HFND

セルラー取り込み

薬物送達システムが、全身投与または直接局所投与によって標的腫瘍部位にどのように到達するかに関係なく、それらが腫瘍領域内に浸透してそれらの細胞内標的に作用することができるかどうかは非常に重要である。共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）は、HFNDの細胞取り込みを評価するために実行されました。 HeLa細胞による細胞取り込みの効率を評価するために、HFNDとHCPTをロードしたナノニードル（ND;薬物負荷=64.7％）をHeLa細胞と37°Cで8時間インキュベートしました（NDはHCPTとキトサンによって調製されました。 HFNDと同じ方法）。図8に示すように、HFNDに曝露された細胞からは8時間のインキュベーション後にNDに曝露された細胞よりもはるかに強いHCPTの蛍光発光が検出され、粒子表面のFAが大幅に増強される可能性があることを示しています。細胞への取り込み。

37°Cで8時間の細胞内ドラッグデリバリー。 a とインキュベートしたHeLa細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡画像 HFNDと b ND

HFNDの細胞内在化速度がより速いことをさらに確認するために、HeLa細胞におけるHCPTの蛍光発光強度の差を定量化するために蛍光測定を実施しました。 CLSMの観察結果と一致して、細胞内在化プロセスでは、HFNDの方がNDよりもはるかに好まれていました（図9）。これにより、HFNDのターゲティングプロパティがさらに検証されました。

HFNDとインキュベートしたHeLa細胞の蛍光測定（ a ）およびND（ b ）37°Cで8時間のインキュベーション期間。 P <0.05

細胞毒性アッセイ

HFNDを局所ドラッグデリバリーに利用する可能性をさらに調査するために、癌細胞に対するHFNDの殺傷能力をテストしました。 HFNDの細胞毒性は、HeLa細胞を用いたMTTアッセイを使用して評価されました。同等の濃度のHCPTを含む遊離HCPTおよびNDを対照として使用した。 HCPTの濃度は、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、および16μg/ mLでした。図10に示すように、HCPTの細胞毒性はNDの細胞毒性よりも高かった。これは主に、HCPTの薬物放出速度がNDよりもはるかに速いためである。それにもかかわらず、HFNDの細胞毒性はHCPTの細胞毒性よりも高かった。これはおそらく、粒子が細胞に入り、それらを殺すのを助けることができる、HFNDの表面上のFAの標的化特性によるものでした。したがって、HFNDは癌細胞に驚くほど優れた殺傷能力を示しました。これらの結果は、HFNDの表面のFAが粒子の細胞取り込みを増加させ、FA受容体と結合することによって癌細胞への殺傷能力を増加させることができることを確認しています。

（ a で処理したHeLa細胞のinvitro細胞生存率 ）無料のHCPT、（ b ）ND、および（ c ）24時間のインキュベーション後のHFND。 P <0.05

生体内分布

二剤ナノニードルの腫瘍標的能力を評価するために、DiRを近赤外蛍光プローブとして使用し、同等のDiR濃度で遊離HCPT、ND、およびHFNDにカプセル化しました。 0.9％のNaCl、DiR-ND、およびDiR-HFNDを、ヒト子宮頸癌HeLa細胞に由来する腫瘍を有するマウスに静脈内注射し、それらのinvivo生体内分布を調査しました。

図11aに示すように、DiR-NDのグループでは腫瘍部位で蛍光シグナルは検出されませんでしたが、DiR-HFNDグループでは強い蛍光シグナルが視覚化されました。総蛍光数が常に減少すると、腫瘍部位での信号の強度が1時間から12時間に増強され、この間にHFNDが腫瘍に蓄積していたことを示しています。 24時間後、マウスを犠牲にし、腫瘍組織と正常組織をex vivoイメージングと分析のために分離しました（図11b、c）。DiR-HFNDs処理マウスの腫瘍組織の蛍光強度は有意でした。他のマウスよりも高い。 FAの導入により、ナノニードルに優れた腫瘍標的効果がもたらされ、より効率の高い癌治療につながることが検証されました。

a 示された製剤の静脈内注射を受けたHeLa担癌マウスにおけるDiRナノ粒子の分布と腫瘍蓄積。 b 安楽死させたHeLa担癌ヌードマウスから採取した腫瘍および正常組織のexvivo蛍光イメージング。画像は注射の24時間後に撮影されました。 H、Li、Lu、K、S、およびTは、それぞれ心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、および腫瘍を表します。 c 全身注射の24時間後に収集された腫瘍組織のDiR蛍光強度。 P <0.05。 （ a ）0.9％NaCl、（ b ）DiR-ND、および（ c ）DiR-HFND

InVivoでの腫瘍抑制

インビボ抗腫瘍効果を評価するために、昆明マウスでHeLa腫瘍異種移植片を生成し、0.9％NaCl、遊離HCPT、ND、および同じ濃度のHCPTを含むHFNDの静脈内投与後の腫瘍増殖を評価しました。コントロールとして0.9％NaClで処理されたマウスと比較して、遊離HCPTまたはNDを投与されたマウスの腫瘍の成長率は徐々に減少し（図12a）、有意に効果的な腫瘍成長阻害を示しています。注目すべきことに、HFNDは腫瘍増殖の最も顕著な阻害をもたらしました。実験の終わりに、腫瘍を切除し、重さを量った。図12cに示すように、二剤ナノニードルは他のグループと比較して優れた治療効果を示しました（ P <0.05）。二剤ナノニードルの抗癌効果の増強の追加の証拠が組織学的画像に示されました（図12d）。ドラッグデリバリーシステムの場合、安全性と有効性を確保するために、無料のHCPTを介した治療で通常遭遇する全身毒性を考慮する必要があります。この研究では、無料のHCPTの投与により、マウスの倦怠感/怠惰と重度の体重減少が生じ（図12b）、化学療法の望ましくない副作用を示しています。それどころか、NDおよびHFNDで治療されたマウスでは明らかな副作用は見られなかった。全体として、優れた抗がん効果と低い毒性を備えたHFNDは、生活の質の治療の有効性を大幅に改善することが示されました。

さまざまな（ナノ）製剤の抗がん効果。 a 治療中のマウスの腫瘍の体積変化。 b 治療中の担癌マウスの体重変化。 c さまざまな製剤で治療した後のHeLa腫瘍の重量。 d 治療後のマウスの腫瘍の組織切片。 （ a ）0.9％NaCl水溶液、（ b ）無料のHCPT、（ c ）ND、および（ d ）HFND。すべての製剤は、HeLa腫瘍を有するマウスで同じ濃度のHCPTを使用しました。 P <0.05

結論

ここでの研究は、高い薬物負荷、ターゲティング特性、およびイメージング機能を備えた非常に効率的な化学療法のために、FA修飾されたHCPT負荷ナノニードルを取得するための完全に環境に優しいアプローチを示しています。薬物放出プロファイルは、HFNDが持続的かつ長期の放出を示したことを明らかにした。 CLSMは、NDよりもHFNDのより効果的な細胞内在化を示しました。 MTT実験は、HFNDが個々の薬剤およびNDよりもはるかに高い細胞毒性を示しただけではないことを示しました。これは、HFNDの優れたターゲティング特性を示しています。この作業は、完全にグリーンな方法でナノ粒子の新しい投与量を設計するための扉を開きます。これは、将来の環境保護に強力な影響を与える可能性があります。