カーボンドット：次世代ナノサーモメーターの開拓─包括的レビュー

概要

高感度な非接触型温度センシングは、基礎的な化学反応や生物学的プロセスの研究、医療診断への応用において極めて重要です。ナノスケールベースのサーモメーターは、サブセルラー分解能で敏感かつ精密な温度センシングを可能にする非侵襲的プローブとして期待されています。蛍光ベースの温度センサーは「非接触」モードで動作し、細胞イメージングと分子レベルでの温度センシングという二重機能を提供するため、大きな可能性を秘めています。ナノ材料およびナノテクノロジーの進歩により、ナノサーモメーター（ナノスケールで高い空間分解能を持つ新規温度センシング材料）などの新しいセンサーが開発されてきました。このようなナノサーモメーターは、蛍光タンパク質、有機化合物、金属ナノ粒子、希土類ドープナノ粒子、半導体量子ドットなど、さまざまなプラットフォームを用いて開発されています。

カーボンドット（CDs）は、強い蛍光、光漂白耐性、化学的安定性、低コストな前駆体、低毒性、生体適合性といった優れた特性により、多くの研究分野で注目を集めています。近年の報告では、一部のCDsが熱センシング挙動を示し、他のナノ材料ベースのサーモメーターの代替となり得ることが明らかになっています。この種の発光ベースのサーモメーターは、ナノキャビティ内の温度センシングや熱マッピングに有望であり、生物学的プロセスの理解を深めることができます。CDsがナノスケールベースの熱センシング材料としてまだ初期段階にあることを踏まえ、本レビューでは、この新規ナノサーモメーター、熱感度と分解能を高めるための機能化手法、熱センシング挙動のメカニズムについて包括的に理解を提供します。

はじめに

温度は生物学的および化学的システムに著しい影響を与える基本的な熱力学変数です。自然科学、工学、農学、医学などほぼすべての分野で幅広く応用されているため、精密な温度測定は非常に重要です。医療応用では、脳卒中、がん、炎症などの疾患の早期発見に温度計測が用いられ、これらの初期症状の一つは局所的な温度異常の出現です。

歴史的に、最も古い温度推定は感覚や観察に基づいていました。古代（紀元前200–10年）には、熱による空気の膨張を利用した気圧実験が、熱の定量測定に用いられた装置の最古の記録とされています。熱膨張空気に関する最も初期の文献は、ビザンチウムのフィロンとアレクサンドリアのヘロン（ヒーロン）による気圧実験の著作に帰せられます。その後、1592年から1603年にかけてガリレオ・ガリレイは、熱による空気の膨張を利用し、水柱の上に閉じ込められた空気を含む管を用いた簡易な装置でサーモスコープを発明しました。ガリレオに続き、イタリアのサントリオがこの簡易装置を発熱の医学的検査に初めて応用したとされています。最初の完全密封液体ガラス温度計（アルコール充填ガラス管）は1641年にフェルディナンド2世によって組み立てられました。彼はガリレオとサントリオの開放式サーモスコープとは異なり、気圧の影響を受けずに温度を測定できました。ファーレンハイトの温度計測における実用的業績は1706年に現れ、最初はアルコールを用いましたが、後に水銀温度計で伝説的存在となりました。百分温度スケールの考案はアンデルス・セルシウスに帰せられ、1742年に水の沸点を0度、凝固点を100度とするスケールを提案しました。19世紀にはトーマス・ヨハン・ゼーベックが熱電効果の概念を考察し、電子実験が行われました。1820年から1823年にかけての一連の実験で、彼は二種類の異なる金属の接合点間に温度差があるとき、接合点に電位差が生じることを実証しました。これは後にゼーベック効果として知られ、最も正確な温度測定法とされる熱電対の起源となりました。温度計の進化の概略タイムラインを図1に示します。

従来の温度計は以下のカテゴリーに分類できます：

1. 熱膨張に基づく液体充填ガラス温度計
2. ゼーベック効果に基づく熱電対
3. 光学センサー

さらに、接触式と非接触式に分類されます。接触式には古典的な液体充填ガラス、熱電対、サーミスタ、抵抗温度検出器（RTD）などが含まれ、すべて電気配線と温度計と被測定体の直接接触を必要とします。このモードは、電磁ノイズが強い、火花が危険、環境が破壊的、部品が高速で移動している用途には適していません。また、従来の温度計は空間分解能がサブミクロンレベルに低下すると測定不能となり、例えば細胞内温度変動やマイクロ回路・マイクロ流体の温度マッピングでは対応できません。同様に、工学応用でも微小領域や過酷な環境向けの高度な熱感知戦略が必要とされています。したがって、ナノスケール領域では他のアプローチと材料を検討する必要があります。

新規非接触温度計測は上記の問題を克服できます。例えば、光学サーモセンサー（分子温度計）は、放出光の測定から温度を抽出する分子クラスを用いる、より新しい世代の分析ツールです。蛍光温度感受性プローブは、ナノシステム応用における温度計測の有望な分野です。温度情報は、蛍光強度、バンド形状、ストークスシフト、減衰寿命に基づいて抽出でき、適切に校正されていれば温度と相関させることができます。

分子温度計は、正常細胞とは異なる生理的温度を持つ病変細胞やがん細胞の診断に大きな可能性を秘めています。医療応用では、温度誘導型遺伝子発現制御、細胞代謝、細胞選択的な浸透と疾患治療、集積熱源からの放熱改善などへの可能性が広がっています。近年、半導体、高分子、金属ナノ粒子などのナノ材料が熱センサー（ナノサーモメーター）として用いられ、サブミクロン熱分解能を示しています。

サブ度レベルの温度分解能を広い温度範囲で実現し、かつ生体システム内に統合可能な温度計は、生物学、物理学、化学研究の無数の分野で強力な新ツールとなるでしょう。したがって、本レビューでは炭素ナノ材料（炭素質材料）ベースの「新世代」または「新クラス」のナノサーモメーターに焦点を当てます。著者らの知る限り、カーボンドットをナノサーモメーターとして扱ったレビュー記事は報告されていません。近年、カーボンドット（カーボン量子ドット、グラフェン量子ドット）が独自の特性とともに敏感な熱特性を示し、ナノスケール領域での温度計測挙動の優れた候補となっています。ここでは、カーボンドットの定義、利点、熱センシング挙動のメカニズムをレビューし、最後にこの新クラスの熱材料の将来展望を提示します。

ナノサーモメトリー

「ナノサーモメトリー」とは、ナノスケールの熱感受性材料を用いて、ナノまたはマイクロスケール領域の局所環境の温度情報を得ることを意味します。ナノ粒子ベースの熱プローブは幅広いセンシング応用に大きな可能性を持ち、多数の先進的な「ナノサーモメーター」が最近報告されています。また、ポリマー、ナノ結晶、希土類ドープナノ粒子、金属ナノ粒子など、さまざまな従来型ナノ材料が熱感受性発光特性を持つことが報告されています。

したがって、ナノサーモセンサーは、ナノスケールで高感度分解能を持って動作する非侵襲的、非接触型、高精度な温度計です。ナノ材料を用いた熱センシングは、それらの光学特性を操作することで達成できます。蛍光ナノサーモメトリーは、熱測定の基準となる正確なパラメータに基づいて、信号強度、バンド形状、蛍光寿命、バンドシフト、励起波長の偏光、スペクトルシフトなどいくつかのクラスに分類できます。最初のケースでは、蛍光が温度変化に伴い変化し、信号の絶対的な増加（または減少）として検出されます。

温度依存性発光を持つ発光ナノ材料を用いる非接触発光ナノサーモメトリーは、主に生物学的応用に適しています。これらの発光ナノ材料には、蛍光高分子、金属ナノ粒子、希土類ドープナノ粒子、ナノダイヤモンドなどが含まれ、生理的温度範囲で熱感受性特性を示します。これらの先駆的研究により、個々の細胞の平均温度を測定することが可能になりました。有機色素（ローダミン6Gなど）や高分子（ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)など）ベースの温度依存性発光プローブは、一般的に光安定性が低く、酸素への顕著な交差感受性を示し、ライブセルワークには望ましくありません。また、蛍光体の寿命には強いpH依存性があり、調査対象環境のpHを精密に制御しない限り使用が困難です。

純粋およびドープ半導体ナノ結晶ベースの別のクラスのナノサーモメーターも報告されており、CdSe、ZnS、InP、PbSeなどが最も顕著な候補です。半導体量子ドット（SQDs）は、高い量子収率、光漂白前の長寿命、適切な表面修飾後の十分な生体適合性を考慮すると、ナノスケール温度計の候補となります。さらに、タンパク質やDNAと容易に共役化でき、センシングとイメージングに利用できます。このタイプの発光温度計が直面する例外的な課題は、T=20–40℃における輝度、光安定性、感度、精度の両立です。SQDsは合成、物理化学的特性、発光、潜在的応用の観点から広くレビューされています。読者はこれらの多数の優れたレビューを参照されたい。有機色素と比較して、SQDsは検出のための優れた輝度、多重化のための広い励起プロファイル、長期研究のための優れた光安定性を示します。さらに、SQDsは細胞内で予想されるpHやその他の環境変動に対して耐性があります。

一般に、SQDsでは複数のプロセスの組み合わせにより、温度上昇に伴って蛍光強度の減少（クエンチング）が生じ、スペクトルシフトを伴います。このシフトは生物物理学的範囲で線形と仮定できます。両効果（発光クエンチングとスペクトルシフト）の大きさは、QDsを構成する材料とそのサイズに強く依存します。

各発光ナノ材料グループには、利点とともに使用上の制限があります。前述のように、SQDsは蛍光高分子や有機色素よりも好まれます。SQDsは光安定性、量子効率、調整可能な蛍光の点で優れていますが、固有のブリンキングにより単一分子の長期モニタリングには使用できません。さらに、QDsの主な欠点は、カドミウムなどの重金属含有による毒性であり、生物学的および環境応用を制限しています。また、前駆体元素の天然存在量が比較的低いため、SQDsは高価と見なされています。

ナノサーモメーターとしてのカーボンドット

非炭素ベースのナノサーモメーターから生じる問題（前節で説明）を克服するため、炭素ベースのナノ材料が作製され、低毒性、容易な調製、低コスト前駆体、光安定性、生体適合性といった独自の特性を示しました。これらの炭素ベースナノ材料は敏感な熱センシング特性を示しました。また、生物学的応用における環境ハザードの観点から、金属フリーナノ粒子の改良は重要かつ緊急です。炭素ベースナノ材料ファミリーの中で、蛍光ナノダイヤモンドが最初にナノサーモメーターとして報告されました。蛍光ナノダイヤモンドは、化学的に頑強で不活性な表面に起因する固有の生体適合性を持ちます。他のナノダイヤモンドも最近、サブ度精度で細胞内熱センシングに用いられています。これらのナノダイヤモンドの熱感度は、窒素-空孔カラーセンターに基づいており、これは格子炭素原子が窒素原子で置換され、近くに空いた格子サイトがある点欠陥で構成されます。蛍光ナノダイヤモンドの窒素-空孔センターは、その光物理学および生物学的応用における利用の観点から広く研究され、よく特性評価されています。窒素-空孔ベースの温度計測の機能原理は、高い空間分解能で光学的に検出可能なこのカラーセンターの精密測定に依存します。しかし、低い蛍光効率と制御性の悪さが、蛍光ナノダイヤモンドの応用を大きく妨げています。

炭素ベースナノ材料ファミリーの新しいクラスの一つは、高発光カーボンドット（CDs）であり、例外的に明るい光ルミネッセンス、光化学的安定性、水溶性、優れた生体適合性、無毒性を持ちます。CDsは直径10nm未満のゼロ次元球状ナノ粒子です。レーザーアブレーション、ゾルボサーマル、水熱合成、マイクロ波アシスト、アーク放電、酸化酸化など、多様なCDsを調製するためのさまざまなアプローチが適用されてきました。また、CDsは生物イメージング、化学・バイオセンシング、標的薬物送達、医薬品分析、触媒など、さまざまな応用への望ましい展望を示しています。CDsは合成、物理化学的特性、潜在的応用の観点から広くレビューされています。ここではCDsに関する多数の優れたレビューを読者に紹介します。

近年、温度センサーとしての蛍光CDsが研究者から多くの注目を集めています。原則として、効果的な温度測定には、関連温度範囲でカーボンナノドットが光ルミネッセンスに顕著な変化を示すことなど、いくつかの要件が必要です。光安定性、pH安定性、保存寿命も実用応用のために考慮すべき要件です。

CDsは従来の半導体量子ドット（SQDs）の有望な代替材料です。QDsと比較して、CDsは低コスト、低毒性、独自の頑強な光学的/化学的特性など多くの優れた利点を示します。また、CDsは非常に少ない光漂白を示します。他の蛍光原料と比較して、CDsは自然界に豊富に存在する安価な炭素源から作製されます。さらに、CDsの表面状態を修飾・官能基化するための簡便な方法がいくつかあり、実験要件に応じて溶解性、安定性、物理化学的特性、量子収率を調整できます。

文献には、温度依存性蛍光を示すカーボンドットに関する報告記事は少なく、表1に示されています。

Yuら[51]は2012年、カーボンナノドットの温度依存性蛍光を初めて調査し、半導体および金属ベースのナノ粒子と比較しました。彼らは時間相関単一光子計数法（TCSPC）により温度依存性光ルミネッセンス寿命を測定しました。光ルミネッセンス緩和ダイナミクスは高温で速くなり（図2a）、これは非放射的崩壊プロセスに起因するとされます。CDsフィルムの蛍光スペクトルを超低温から室温までの温度関数として測定しました（図2b）。温度上昇に伴い、蛍光強度は反復的に減少しました。

PLスペクトルは非対称ピークを示すため、各温度でのPLスペクトルは二つのガウス関数でよくフィッティングできました（図2c）。高エネルギーバンド（バンドI）、低エネルギーバンド（バンドII）（図2d）。さらに、蛍光のエネルギーギャップ（バンド幅）を温度関数として調べました（図2d）。全バンド幅は温度非依存（電子-電子散乱）と温度依存（電子-フォノンおよび表面/欠陥散乱）で顕著です。バンドIとバンドIIのバンド幅は温度非依存であり、CDsでは電子-電子散乱が支配的であることを示します。

したがって、CDsにおける弱い温度効果は、主要な相互作用メカニズムが電子-フォノン結合ではなく電子-電子相互作用であるという事実と一致します。また、非常に低温（77K）でも広いPLバンド（>100nm）が通常観察されることは、強い電子-電子相互作用を指しています（図2c）。この結果は金属ナノクラスターと類似しており、半導体QDsとは異なります。したがって、YuらはCDs中のπ電子が金属ナノクラスターの自由電子と同様に振る舞うと推測しました。

Kalytchukら[89]は、クエン酸とL-システインのワンポット水熱処理により、高発光水溶性N,S-CDsを合成しました。彼らは幅広い温度範囲で定常状態吸収スペクトルを取得し、CDsの温度依存性PL特性を評価しました。10〜70℃（5℃刻み）の温度範囲で水中に分散したN,S-CDsの吸収スペクトルを図3aに示します。半導体ナノ結晶とは異なり、吸収バンドの位置と強度は温度変化しませんでした。グルタチオン存在下でのグルコース水熱処理により合成されたCDsでも同様の結果が以前報告されています。

彼らの研究では、2〜80℃（2℃刻み）の温度範囲で355nm励起で取得したN,S-CDsのPLスペクトルのカラープロットを示しました（図3b）。温度上昇によりPL発光強度が約2倍減少しましたが、PL発光のシフトは検出されませんでした。PL発光ピーク最大値λmax（図3c）、PL半値全幅fwhm（図3d）、積分PL強度（図3e）の温度依存的変化を定量的に決定し、結果を図3c-eにまとめました。

N,S-CDsのPLピーク位置は、ほとんどの半導体ナノ結晶（バンドギャップが温度変化しPL発光シフトを誘導）とは異なり、弱い温度依存性を示します。また、同温度範囲でPL fwhmはわずかな拡大（1.4±1nm）のみを示し（図3d）、N,S-CDsのPLピークは無視できる熱拡大を示します。CDsで起こる非放射的緩和プロセスを特性評価するため、積分PL強度の温度依存性クエンチングを解析しました。N,S-CDsの温度依存性積分PL強度のプロットを図3eに示し、値は2℃での強度で正規化されており、研究温度範囲で単調に減少し、80℃での強度は2℃の約半分でした。これらの結果に基づき、2〜80℃におけるCDsの熱クエンチング活性化エネルギーは、N,S-CDsに対するアレニウス式を用いて17.0±0.7meVと推定され、Yuら[51]の報告値に近い値でした。

さらに、Kalytchukら[89]は異なる温度でのCDsの発光ダイナミクスを調べました。図4a-cは、3つの異なる温度での時間分解PL発光分光データを示し、PL発光の強い温度依存性を示しています。CDsの過渡PL発光マップは、2、50、80℃で375-650nmのスペクトル領域で取得されました（図4a-c）。温度上昇に伴いPL減衰が明確に低下し、CDsがPL寿命ベースの温度センシングに満足な特性を持つことを示唆しています。重要なことに、研究されたすべての温度でドットの発光プロファイル全体にわたってスペクトル的に均一な単一指数減衰が観察され、再結合がCDアンサンブル全体で非常に類似した高発光チャネルを介して起こることを示しています。CDsのPLダイナミクスは、温度センシング応用に関連する最も有望な特性と言えます。具体的には、CDsの温度感度がPL寿命ナノサーモメーターとしての可能性を秘めています。

2〜80℃の温度範囲でのCDsのPL寿命変動が徹底的に調査されました。図4d,eは、ドットのPL発光最大値での時間分解PLデータを温度関数として示しています。研究温度範囲での過渡PLのカラープロットを図4dに示し、温度上昇が見かけのPL減衰の単調な短縮をもたらすことを示しています。記録されたすべての減衰曲線は単一指数関数でフィッティングされました。抽出された寿命のデータを図4eに示します。温度が2から80℃に上昇するにつれ、PL寿命は11.0から5.3nsへ単調に減少しました。このPL寿命感度が実証された温度範囲（2-80℃）は、生理学的に関連する温度範囲と多くの電子デバイスの典型的動作温度の両方をカバーしています。このPL寿命CDベース熱プローブの絶対擬似線形感度は0.08ns K⁻¹、最大相対感度は62℃で1.79% K⁻¹です。研究温度範囲全体でCDベース発光ナノプローブのPL減衰の単一指数フィッティングは、単一パラメータであるPL寿命（τ）を生成し、これは校正曲線を用いて直接温度単位に変換できます。これは、マルチ指数減衰を示しPL寿命測定応用での有用性を制限する典型的な半導体量子ドットに対する重要な利点です。

また、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびDulbecco変法イーグル培地（DMEM）でのCDs PL寿命の温度依存性を調べ、同様の挙動を示しました。

CDベース発光温度計の再利用性を実証するため、選択サンプルのPL減衰曲線を15〜45℃の間で7回連続の加熱・冷却サイクルで測定しました（図5a）。

各測定サイクルで、5分の熱平衡後にPL減衰を測定しました。加熱・冷却サイクル中に熱ヒステリシスは観察されず、PL寿命の変動を時間関数としてプロットした結果（図5b）、CDsのPL寿命が優れた熱安定性を示すことが実証されました。

その後、水熱法、ゾルボサーマル法、加熱還流法、レーザーアブレーション法など多様な合成法を用いて、温度依存性発光を示す複数のCDsが調製されました（表1参照）。調製されたCDsは生理的範囲で線形温度依存性蛍光を示しました（表1参照）。CDsの蛍光強度は温度上昇に伴い減少しました。さらに、すべての論文で蛍光強度の可逆性と復元性が研究されました。図6は、さまざまな論文で研究されたCDsの一般的な特性を示しています。

Nguyenら[14]は、エチレンジアミン中のグラファイト粉末をフェムト秒レーザーアブレーションすることでカーボンドット（CDs）を合成しました。表面に豊富な官能基が形成され、複数の表面状態が表面サイトに形成されることで、CDsの多重発光が生じます。彼らは定常状態蛍光スペクトルを用いてCDsの蛍光依存性温度感度を調査しました。320nm励起でのCDsの温度依存性発光スペクトルを図7aに示します。400nmと465nmの両ピーク強度は、非放射的崩壊経路の熱活性化により温度上昇に伴い徐々に減少しました。ピーク強度は5〜85℃の範囲で温度と線形に変化しました（図7b）。温度感受性CDsは、400nmと465nmピークでそれぞれ3.3%および2.1%/℃の蛍光強度変化を示し、高感度な従来型強度ベース温度センサーとして使用可能です。

特筆すべきは、独自の多重発光特性により、CDsが比率蛍光温度センサーの有望な蛍光体となることです。320nm励起での400nmと465nmの2つの蛍光強度比を温度関数として図7cに示します。5〜85℃の広い温度範囲で強度比と温度の間に非常に良い線形関係があります（R²=0.998）。熱線形性は、ピーク強度比と温度の相関を単純化し、ダイナミックレンジ全体で一定の熱感度を提供するため有利です。CDsの温度感度は1.48% ℃⁻¹と決定され、他の材料と比較可能です。CDsの温度応答範囲は、二重発光温度センサーに関する他の報告よりもはるかに広く、生物学研究の生理的温度と多くの電子デバイスの動作温度の両方をカバーしています。320nm励起以外にも、340nmや365nmなど他の励起波長でも同じ感度で動作します。したがって、CDsは異なる作業波長を選択することで、多くの実用的応用で温度センシングに利用できます。

彼らは比率温度センサーが20〜50℃で4サイクル可逆であり、光源強度変更時にも光安定であることを示しました（図7d）。この結果は、CDsセンシングシステムが試料濃度、励起、検出効率の変化に対して安定で堅牢であることを示唆しています。

温度上昇が常にPLクエンチングを伴うわけではなく、PL増強を示す場合もあります。Macairanら[29]は、温度上昇に伴う二重発光カーボンドットのPL増強を示しました。彼らはホルムアミドとグルタチオンを用いたワンポットマイクロ波アシスト反応で生体適合性二重発光CDsを調製しました。640nm励起では、5-60℃の範囲で蛍光強度とPL積分面積が3.5倍増加しました（図8a）。図8bに示すように、5-60℃の全範囲で線形応答（R²=0.999）が観察され、温度感度は3.71% ℃⁻¹と高く決定されました。

405nm励起でも温度依存性蛍光が調べられました。興味深いことに、青色と赤色の蛍光バンドは温度変化に対して等しく敏感ではありません。温度上昇に伴い、青色成分の蛍光強度（および曲線下積分面積）はわずかに減少するのに対し、赤色成分は顕著に増加します（図8c）。これらの観察は5-60℃の範囲で、青色発光が1.3倍減少するのに対し、赤色発光は3.0倍増加することが確認されました。

図8dに示すように、赤色/青色蛍光比は温度上昇とともに増加し、3つの独立サンプルで三重に繰り返された高線形応答（R²=0.998）を示しました。これらの分析は平均化され、各温度での偏差は小さかったです。CDsの熱感度は全温度範囲で1.33-4.81% ℃⁻¹と変化し、以前に報告されたカーボンドットナノサーモメトリーシステムや、量子ドット、金属有機構造体-色素複合体などの他の二重発光ナノ材料よりも改善されています。CDsの熱分解能は0.048 K⁻¹と計算され、微小な熱変化の測定が可能であることが示されました。

Zhangら[98]は、25-95℃の範囲で温度応答特性を持つCDsを合成し、優れた感度と顕著な可逆性/回復性を示しました（図9a）。CDs/エポキシ複合材は、CDsをエポキシ樹脂に均一にドープすることでさらに調製されました。まず、5μgのCDsを50μLのトリエチレンテトラミン（TETA）に溶解し、350μLのエポキシ樹脂を混合液に加えて高速撹拌で完全混合しました。結果として得られた複合材は、温度応答が顕著に向上しました。

エポキシ樹脂は一般的な熱硬化性樹脂で、LEDチップの封止に広く用いられます。図9bは、直径約2cm、厚さ8-10mmのCDs/エポキシ複合材ディスクの光学顕微鏡画像を示します。硬化したCDs/エポキシ複合材は透明で、その蛍光発光スペクトルを図9cに示します。CDs/エポキシ複合材の発光ピークは、CDs溶液と比較して約10nmブルーシフトしています。特筆すべきは、複合材の温度応答が顕著に改善されていることです。25-95℃の温度範囲で、温度上昇に伴い蛍光強度が35%減少し、これは溶液状態の2倍以上であり、線形性もより安定しています。線形式はI₀/I=0.0074[℃]+0.80454（R²=0.99724）を満たし、I₀とIは温度上昇前後のCDs/エポキシ複合材の蛍光強度、励起波長は360nmです。発光ピークのブルーシフトと温度応答特性の向上は、CDsが置かれた環境の誘電率変化による可能性があります。この複合材は広い温度検出範囲を持ち、優れた感度と安定性により、さまざまな環境での蛍光ナノ材料ベース温度センサーとして使用可能です。

熱センシングのメカニズム

現時点では、カーボンドットの熱センシング挙動を説明する確立されたメカニズムはありません。いくつかの報告では、表面（トラップ/欠陥）状態の非放射的チャネルの熱活性化にメカニズムを帰属させています。一般的な理解では、低温では非放射的チャネルが活性化されていないため、励起電子は放射的に光子を放出できます。逆に、温度上昇に伴いより多くの非放射的チャネルが活性化され、励起電子が非放射的プロセスで基底状態に戻るため、蛍光強度が減少します。CDsの加熱/冷却に伴う発光メカニズムを図10に示します。

CDs発光プロセスの熱力学をよりよく理解するため、Kalytchukら[89]はCDsサンプルの放射的（τᵣ⁻¹）および非放射的（τₙᵣ⁻¹）再結合率を、そのPL量子収率と相関付けました。放射的速度はPL量子収率（QY）と測定再結合率τ⁻¹からτᵣ⁻¹=QY×τ⁻¹として決定されます。非放射的緩和速度τₙᵣ⁻¹はτₙᵣ⁻¹=τ⁻¹-τᵣ⁻¹で表されます。CDsの様々な温度でのPL QYは、温度依存性吸収と積分PL強度、室温でのPL QYから計算されました。時間分解PL測定データから導出された放射的および非放射的再結合率を温度関数として図11にプロットしました。放射的再結合率は70℃まで対応する非放射的速度より大きく、2-80℃の間で（0.74-0.82）×10⁶ s⁻¹の範囲でほぼ変化しません。対照的に、温度を2から80℃に上昇させると、非放射的再結合率が顕著に（約7倍、0.16×10⁶から1.12×10⁶ s⁻¹へ）単調に増加します。放射的および非放射的速度の温度依存的クロスオーバーは70℃で起こり、この温度ではPL QYは50%です。これらの結果は、彼らのCDsにおけるPLクエンチングの温度活性化が、主に非放射的緩和チャネルの活性化によって引き起こされることを示唆しています。

Guoら[102]は、調製したカーボンドットの熱クエンチングを、非放射的崩壊プロセスの活性化だけでなく、温度上昇に伴う非放射的トラッピングの発生にも帰属させました。彼らはCDsの温度依存性崩壊寿命を測定し、図12aに示しました。データは320nmレーザー励起下で発光最大値を温度関数としてモニタリングして取得されました。結果は、温度が283から343Kに上昇するにつれPL寿命が15.03から11.70nsに低下することを示し、これは非放射的崩壊プロセスの発生に起因するとされます。さらに、CDsのPL緩和ダイナミクスは温度上昇に伴いマルチ指数減衰を示し、光励起キャリアが複雑な緩和プロセスを経ることを示唆しています。非放射的トラッピングの発生は温度上昇とともに増加し、これは積分PL強度のアレニウスプロットにより定量的に分析できます：

I=I₀/[1+a exp(-Eₐ/kT)]

ここでEₐは活性化エネルギー、kはボルツマン定数、aは定数です。図12aは発光強度の1/Tに対するプロットを示し、活性化エネルギー（Eₐ）は0.329±0.02eVと計算されました。CDs発光プロセスの熱クエンチング理由を探るため、寿命（τ*）と量子収率（QY）からCDsの放射的（Vᵣ）および非放射的（Vₙᵣ）再結合率を以下のように決定しました：

τ*=1/(Vᵣ+Vₙᵣ); QY=Vᵣ/(Vᵣ+Vₙᵣ)

様々な温度でのCDsのQYは、温度依存性吸収と積分PL強度、室温でのQYから計算されました。彼らは、温度が283から343Kに上昇するにつれ放射的速度がわずかに低下する一方、非放射的再結合速度が約2倍徐々に増加することに気づきました。これらの結果はさらに、CDsにおける温度活性化PLクエンチングが主に非放射的緩和チャネルの活性化によるものであることを示しています。

他のグループも顕微鏡および分光技術を用いて、カーボンドットの熱センシングメカニズムの理解を試みています。

WangらはTEMとUV-Visスペクトルを用いて、調製CDsの温度応答性PL挙動を研究しました。図13aに示すように、温度を20から80℃に上昇させてもCDsのUV-Visスペクトルに変化はありませんでした。しかし、CDsの平均直径が室温で2.6±0.2nmから80℃で4.4±0.2nmに増加することが判明しました（図13b）。したがって、温度上昇により調製CDsの凝集が起こり、顕著な蛍光クエンチングを引き起こしました。

Heら[101]は、彼らのCDsの水和粒子サイズが温度上昇とともに大きくなることを報告しました（図14a）、これは温度上昇がCDsの凝集を引き起こし、最終的に蛍光クエンチングにつながることを示しています。一方、温度低下に伴いCDsの水和粒子サイズが減少し始めました（図14b）、これは冷却がCDsの脱重合を引き起こす可能性を示しています。

Cuiらなどの別グループも、蛍光クエンチングをCDsの凝集に帰属させました。彼らはアクリル酸のみを前駆体として合成したアンドープCDsを温度センサーに適用しようとしました。残念ながら、アンドープCDsは同じ温度上昇下でドープCDsよりも弱いクエンチング効果を示しました。

Yangら[94]は、N-CDsの温度依存性PL特性に関わる2つの鍵因子として、（i）表面官能基と（ii）水素結合相互作用を提案しました。第1因子の効果を調べるため、表面O含有基について、強還元剤NaBH₄（1.0mL、0.1mol L⁻¹）でN-CDs（4.0mL）を処理し、カーボンドット表面のC=O種を除去する対照実験を行いました。得られた還元N-CDsを便宜上r-N-CDsと表記します。N-CDsと比較して、r-N-CDsはより弱い蛍光強度を示しました（図15a）。また、r-N-CDsの蛍光強度は温度を20から80℃に上昇させても13%しか減少しません（図15aインセット）、これはO含有基の減少に起因するはるかに低い温度感度を与えます。

第2因子、溶媒との水素結合がN-CDsの蛍光挙動に及ぼす効果を探りました。N-CDs溶液（1.0mL）をろ紙に滴下し、空気中で乾燥させて固体サンプルを得ました。これは依然として明るい蛍光を発します。しかし、温度上昇に伴う固体N-CDsの蛍光強度に明らかな変化は観察されませんでした。また、エタノール中に分散したN-CDsの蛍光を測定しました。N-CDsのC₂H₅OH中での蛍光強度は水中より低く、温度を20から80℃に上昇させてもPL強度の変化はほとんど観察されませんでした（図15b）。したがって、強い水素結合がN-CDsの温度依存性PL特性に重要な役割を果たします。図15cはN-CDsの温度依存性蛍光強度の概略メカニズムを示します。

しかし、我々のグループはYangグループと同じ実験戦略を用いましたが、両ケースでr-CDsとe-CDsの発光が元のCDs結果と同様に温度上昇とともに線形にクエンチングされました（図16）。したがって、我々の結果は豊富な酸素含有官能基と水素結合の相乗効果を否定しました。

生細胞でのバイオイメージング（熱イメージング）

文献では、CDsの温度応答性蛍光特性を生物イメージングで探求した記事はわずかです。このような実験の前には、CDsの生細胞内での毒性を推定可能にするin vitro細胞毒性分析が不可欠です。in vitro細胞毒性分析は、ナノ材料が培養細胞に及ぼす影響や影響力を評価します。

Yangら[94]は、CDsが生細胞で有効な温度計として使用可能ことを検証しました。HeLa細胞をCDsで6時間処理後、PBSで洗浄しました。温度25℃でHeLa細胞内のCDsの明るい青色蛍光が観察されました（図17a）。温度を37℃に上昇させると青色蛍光が弱まり（図17b）、温度を25℃に下げるとN-CDsの蛍光が回復しました（図17c）。in vivoサーモイメージングとして、N-CDs注射後のマウスの蛍光画像を異なる温度で即座に取得しました。28℃での蛍光強度を基準（I₀）として設定すると、CDs注射領域のI/I₀は温度28から34℃の上昇に伴い1.0から0.87に変化しました（図17d,e）。温度がさらに43℃まで上昇するとI/I₀は0.52まで低下し、蛍光はほぼ検出不能になりました（図17f）。温度が39から28℃に低下するとI/I₀は0.66から1.0に可逆的に増強されました（図17g-i）。これらすべての結果は、N-CDsがin vitroおよびin vivoで有効なナノサーモメーターとして使用可能であることを示しています。

探索的実験で、KalytchukらはCDsのヒト子宮頸がんHeLa細胞での細胞内温度モニタリング能力をテストしました。図18は、CDs（500μg/mL）でインキュベートしたHeLa細胞の測定細胞内温度を示します。各温度でのCDsのPL減衰曲線は高い再現性を持ち、記録されたすべての温度で単一指数関数でフィッティング可能でした。図18aでは、25〜50℃（5℃刻み）の温度範囲での記録PL減衰曲線を記号で、対応する単一指数フィットを実線で示しています。CDs濃度≥100μg/mLで、これらのPL寿命測定でのPL信号がCDsのみに由来することを確認しました。各測定での細胞内温度は、2-80℃の温度上昇に伴うPL寿命との校正曲線から決定されました。このように決定された温度（T_meas）をPL寿命の関数として図18bにプロットしました。独立に、細胞溶液の温度を校正済み参照温度計で測定しました（図18bのT_set）。発光CDプローブと参照検出器による温度報告は良好に一致しました。これらの結果は、CDsベースのナノプローブのPL寿命が細胞内温度を確実に測定できることを示しています。

発光CDナノプローブの長期リアルタイム温度モニタリングの可能性をさらに評価するため、CDs（500μg/mL）でインキュベートしたHeLa細胞のPL減衰プロファイルを24時間、15分ごとに記録しました。この期間中に測定されたPL減衰値から抽出されたPL寿命を時間関数としてプロットしました（図18c）。これらの結果を用いて、校正曲線から時間経過に伴う温度変動を計算しました（図18d）。また、各測定点での試料温度を、温度再現性60mKの参照温度計で測定しました。参照温度計で決定された温度を図18eにプロットし、測定温度と参照温度の間に優れた一致があることを示しました。測定温度と実在（参照）温度の差の統計解析により、PLベース温度測定の高精度がさらに実証されました（図18f）。これらのデータを用いて、提示手法による温度検出の絶対平均精度は0.27℃と計算されました。この実験は、CDベース熱プローブの生物学的システムでの可能性を確認するものです。

Macairanら[29]は、調製CDsが強度および比率アプローチで細胞内熱センシングに使用可能であることを示しました。CDs処理HeLa細胞を32、37、42℃で平衡化させました（図19）。640nm励起で細胞内CDsの赤色蛍光を選択的にモニタリングしました。熱変化は細胞内濃度変化による可能性があるか、強度変化（λex=640nm）と相関しない可能性があります。これは細胞内濃度変化や高温でのCDs局在化変化による可能性があります。したがって、単純に蛍光強度変化に頼るだけでは正確な細胞内熱センシングにはなりません。

対照的に、これらの制限は比率アプローチで除外されます。CDsは405nm励起後、コロイド分散液で以前観察されたように、細胞内で二重の青色と赤色蛍光を維持します（図19）。赤色/青色比は温度上昇とともに増加し、32℃で1.8、37℃で2.0、42℃で2.3の値を示します。CDsの赤色/青色蛍光の比率関係は、蛍光ナノサーモメトリープローブ開発における比率温度センシングの利点を浮き彫りにします。相対的な赤色/青色発光比は、細胞が取り込んだCDs量（コンフルエンシーなど様々な要因で影響を受け、濃度非依存）に関わらず影響を受けません。最後に、CDsは細胞内温度変化に関して蛍光可逆性を示しました。HeLa細胞でのインキュベーション後、32/42/32℃の加熱/冷却サイクルを実施しました。これは提案されたCDナノサーモメーターの堅牢性を強調し、蛍光可逆性をさらに実証するものです。

共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて、N,S,IドープCDsによる結腸がん細胞HT-29の熱イメージングを行いました（図20[100]）。蛍光スポットは温度依存性で（図20g-i）、最も強いのは15℃、最も弱いのは35℃でした。興味深いことに、蛍光スポットは可逆的で、20分間の連続励起後も非常に光安定でした。Shinら[96]もHeLa細胞で共焦点レーザー走査顕微鏡を用いました（図20e-g）。

Liら[103]は、MnOx-CDsで構成されるナノ複合材を生物学的環境用ナノサーモ応答性蛍光体として調製しました。HepG2細胞を異なる培養温度でMnOx-CDsとインキュベートしました。共焦点レーザー走査顕微鏡（405nm励起）で観察すると、環境温度40℃ではHepG2細胞内のMnOx-CDsの青色ルミネッセンスは弱く（図21a）、温度が30℃（図21b）さらには20℃（図21c）に低下すると青色ルミネッセンスが増強されました。温度応答特性により、合成MnOx-CDsはバイオイメージングや光熱療法などの生物医学分野へ容易に応用可能です。

結論と将来展望

カーボンナノドットは、熱感度、低コスト、光安定性など、ナノサーモメトリーに活用できる独自の特性を示します。柔軟な表面修飾と容易な調製は、多様な応用向けの多数の熱感受性ナノ材料確立への道を開きます。熱センシングナノ材料の全体的傾向は、低コストで安全な材料を用いて光安定性と熱分解能を向上させることです。CDsはこれらの要件を満たし、高温療法治療中の温度モニタリングなど、生物医学的温度計測応用に使用できる新世代の温度計と分類できます。容易な調製プロトコル、生体適合性、CDsの容易な官能基化は、CDsを次世代ナノサーモメーター材料の代替候補とする有望な基準です。この分野の基礎研究を促進するためにより多くの努力が必要です。熱感度の向上、より広い温度範囲での動作など、カーボンドットベースナノサーモメーターの製造には限界克服が必要です。蛍光熱センシングメカニズムのより良い理解は、CDsの構造設計と操作、熱分解能向上のためのもう一つの鍵となります。CDsの製造法と熱挙動の相関を理解するため、さらなる実験と理論モデリングが必要です。